Изобретение относится к области медицины, микробиологии, а именно к способу идентификации микобактерий из положительной гемокультуры методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) у больных туберкулезом и микобактериозами. Изобретение может найти свое применение в клинической диагностике микобактериозов.
Инфекции кровотока, в т.ч микобактериальные связаны с высокой смертностью. Выделение и идентификация микроорганизмов из крови должны происходить в максимально кратчайшие сроки. Получение роста микобактерий - возбудителей туберкулеза и микобактериозов из кровяного русла свидетельствует о генерализации инфекционного процесса. Особенно часто это проявляется у иммунокомпрометированных пациентов, в т.ч. больных ВИЧ-инфекцией и ассоциируются с высокой летальностью. Большинство клинически значимых микобактерий относятся к медленнорастущим. Цикл деления Mycobacterium spp. в течение 13-24 часов, тогда как типичные бактерии делятся каждые 15 мин. [Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II / Колл. авторов // [под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М.] - М.: Издательство БИНОМ, 2010. 1152 с.]. Соответственно, даже при использовании систем автоматического культивирования на жидких питательных средах время роста микобактерий составляет от 14 до 42-х дней. Кроме этого, после получения роста микобактерий, требуется видовая идентификация, скорость которой имеет решающее значение для выбора эффективной схемы химиотерапии.
Одним из наиболее быстрых и точных методов видовой идентификации микобактерий является метод матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS). Однако стандартная методика пробоподготовки для видовой идентификации бактерий рода Mycobacterium согласно инструкции производителя предусматривает проведение исследования с плотной или жидкой питательной среды, например в среде MGIT.
Стандартная операционная процедура для идентификации микобактерий из плотных и жидких питательных сред, описанная компанией производителем Brucker Daltonics (производитель MALDI-ToF-MS) включает в себя следующие этапы:
1. Подготовка раствора HCCA матрицы - для этого добавляют 250 мкл OS в пробирку с порционной HCCA матрицей, перемешивают полученный раствор HCCA матрицы на лабораторной мешалке (Vortex) при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества.
2. Подготовка проб с твёрдой питательной среды - для этого добавляют в пробирку 300 мкл деионизированной воды, помещают в пробирку с водой биомассу микобактерий объёмом от одной до трёх бактериологических петель 10 мкл, избегая переноса питательной среды.
3. Подготовка проб из жидкой питательной среды - большая часть биомассы будет находиться на дне пробирки. Если биомасса находится во взвешенном состоянии в объёме пробирки, необходимо подождать 5 - 10 минут, пока биомасса не осядет на дно пробирки. Затем отбирают биомассу, набрав со дна пробирки 1.2 мл питательной среды и помещают отобранную питательную среду в пробирку. Если в пробирке с питательной средой слишком мало биомассы, то переливают всю питательную среду в пробирку, подходящую для центрифуги. Далее центрифугируют 15 минут на максимальных оборотах. Аккуратно удаляют излишек супернатанта, оставив 1 мл питательной среды в пробирке. Полученный осадок биомассы размешивают в оставшейся питательной среде. Помещают питательную среду с биомассой в пробирку. Центрифугируют 2 минуты на максимальных оборотах и аккуратно удаляют супернатант из пробирки пипеткой, добавляют 300 мкл воды.
4. Проведение инактивации биоматериала кипячением в течение 30 минут.
5. Дальнейшая пробоподготовка пробы с твёрдой питательной среды и из жидкой питательной среды - добавляют 900 мкл этанола и перемешивают на Vortex, затем центрифугируют 2 минуты на максимальной скорости (примерно 13000 об/мин). Аккуратно удаляют супернатант пипеткой, не затрагивая осадок, повторно центрифугируют и аккуратно удаляют остатки этанола. Полученный осадок высушивают при комнатной температуре (несколько минут должно быть достаточно).
Добавляют циркониево-кремниевые шарики на наконечнике маленького шпателя в пробирку. В зависимости от количества осадка добавляют 10-50 мкл чистого ацетонитрила в пробирку (если вы не знаете точно какой объём ацетонитрила вам требуется, добавьте 20 мкл), проводят перемешивание на Vortex на максимальной скорости в течение 1 минуты. Затем добавляют 70% муравьиной кислоты столько же по объёму, сколько ацетонитрила, перемешивают на Vortex в течение 5 секунд, затем центрифугируют на максимальной скорости 2 минуты. 1 мкл супернатанта помещают на мишень и дают высохнуть при комнатной температуре. Сразу после высыхания покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и высушивают при комнатной температуре.
Однако данная методика не учитывает особенности флаконов и среды для культивирования крови, что не позволяет идентифицировать микобактерии напрямую из положительных гемокультур. Например, флаконы Myco/ F lytic (BD Bactec, США), содержат жидкую среду Миддлбрука 7H9 с добавками и сердечно-мозговым экстрактом, а также сапонин. Среда богата содержанием белка, что создает сложности при прямой экстракции из гемокультур по стандартным протоколам, а содержащийся в среде сапонин вызывает лизис форменных элементов. Для проведения идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) производители рекомендуют пересев гемокультуры на плотные питательные среды. Это увеличивает длительность проведения идентификации до 2-3-х месяцев и недопустимо у больных с микобактериальным сепсисом.
В настоящее время известны способы идентификации из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) без пересева на плотные питательные среды только для бактерий, не относящихся к бактериям рода Mycobacterium.
Известен способ экспресс-идентификация положительных гемокультур с помощью метода прямой MALDI-TOF-масс-спектрометрии [Попов Д.А., Овсеенко С.Г. и др. Экспресс-идентификация положительных гемокультур с помощью метода прямой MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Анестезиология и реаниматология, 2015, №5, с. 7175]. Для подготовки к анализу образца из флаконов к 1 мл его содержимого добавляют 200 мкл 5% водного раствора сапонина для лизиса эритроцитов. Смесь инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре, лизат центрифугируют при 12000 об/мин 1 мин, после чего удаляют супернатант. Далее осадок промывают 1 мл фосфатно-солевого буфера, затем повторяют операции центрифугирования и удаления супернатанта. К осадку добавляют сначала 300 мкл бидистилированной воды, перемешивают, затем 900 мкл этанола, далее центрифугируют при 12000 об/мин 2 мин, удаляют супернатант, осадок подсушивают при комнатной температуре в течение нескольких минут, после чего к нему последовательно добавляют сначала 20 мкл муравьиной кислоты, затем равное количество ацетонитрила. Полученную суспензию перемешивают, после чего вновь центрифугируют при 12000 об/мин 2 мин, мкл белкового экстракта наносят на мишень масс-спектрометра в двух повторностях, подсушивают, после чего добавляют раствор матрикса (α-циано-4-гидроксикоричная кислота) в соотношении 1:1 и оставляют до полного высыхания. Пробоподготовка образца из флаконов, содержащих в качестве сорбента активный уголь, включает предварительный этап его осаждения путем центрифугирования при 400 об/мин, 30 сек., не приводящего к седиментации микроорганизмов. Масс-спектры регистрируют в автоматическом режиме в диапазоне 2-20 кД. Исследуемые образцы помещают в вакуумную камеру прибора, где они подвергаются мягкой ионизации. Образующиеся при этом заряженные частицы двигаются в электрическом поле к аноду-детектору со скоростью, пропорциональной их массе, формируя соответствующий масс-спектр. При сканировании каждого образца снимают по 100 спектров. Идентификацию микроорганизмов осуществляют путем автоматического сравнения полученных масс-спектров с референсной базой данных, содержащей информацию более чем о 950 клинически значимых видах микроорганизмов. Не смотря на значимость, вышеуказанный способ является трудоемким, т.к. при подготовке пробы требуется дополнительное осаждение спиртом, обработка осадка муравьиной кислотой и ацетонитрилом в больших количествах (по 20 мкл) и не может быть использован при идентификации микроорганизмов рода Mycobacterium.
Известен способ идентификации бактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), у больных с инфекцией кровотока (RU2750611). Способ проводят следующим образом: положительный флакон с гемокультурой переносят в пробирку с разделительным гелем и центрифугиуруют при 3000 об/мин 10 минут, надосадочную жидкость переносят в микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 3000 об/мин 2 мин, отбирают надосадочную жидкость и переносят в следующую микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 13000 об/мин 2 минуты. Удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют деионизированную воду и перемешивают на вортексе, добавляют 96% этиловый спирт, перемешивают на вортексе, а затем центрифугируют при 13000 об/мин 2 минуты. Удаляют спирт и центрифугируют при 13000 об/мин 2 минуты, удаляют остатки спирта, оставляют пробирку с открытой крышкой до полного испарения спирта. Далее проводят экстракцию белковой фракции муравьиной кислотой и ацетонитрилом, перемешивая смесь на вортексе и центрифугируя при 13000 об/мин 2 минуты. Надосадочную жидкость наносят на мишень масс-спектрометра, после высыхания покрывают матрицей и проводят идентификацию методом MALDI-ToF-MS с помощью анализатора Microflex LT (Brucker Daltonics, Германия).
Проведение идентификации микроорганизмов рода Mycobacterium известными методами не эффективно ввиду особенностей их строения. Строение микобактерий туберкулезного комплекса и не туберкулезных микобактерий сильно отличается от других прокариот [А.В. Лямин, А.В. Халиулин, с соавт. Железо как эссенциальный фактор роста микобактерий Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 18, №5(2), 2016]. Клеточная стенка микобактерий содержит значительное количество жирных кислот, и в особенности миколовых. По своему химическому составу миколовые кислоты богаты глицином кислых полипептидов. В итоге зрелая клетка микробактерий может содержать до 60% липидов [Nontuberculous mycobacteria. Clinics in chest medicine / [Editors Gwen A. Huitt, Charles L. Daley] - Elsevier, March 2015. Vol 36. №1. P. 125]. Так же в состав клеточной стенки входят микозиды, сульфолипиды, корд-факторы и другие липидосодержащие элементы. Тем не менее, именно миколовые кислоты и их производные, представленные длинноцепочечными разветвленными жирными кислотами, содержащими до 60-90 углеродных атомов, составляют основной каркас клеточной стенки микобактерий и определяют восковидность ее структуры. Часть миколовых кислот ковалентно связана с пептидогликаном посредством арабиногалактана. Кроме фиксированных в клеточной стенке миколовых кислот есть свободные гликолипиды-сульфолипиды и корд-факторы. Наиболее типичный состав кордфактора представлентрегалозой, эстерированной двумя молекулами миколовых кислот (димиколаттрегалозы) [Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т.1. Пер. с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 656 с.]. Все вышеперечисленные особенности строения микобактерий ограничивают использование стандартных и общепринятых методик, используемых для большинства прокариотических организмов.
Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам, за счет создания способа пробоподготовки гемокультур микобактерий, который позволил бы исключить этап пересева гемокультур на плотные питательные среды и напрямую идентифицировать гемокультуры методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным разделением ионов (MALDI-ToF-MS).
Техническим результатом заявляемого способа является прямая идентификация микобактерий из гемокультур, сокращение времени до получения результата идентификации и упрощения процедуры экстракции микобактерий. Время, затрачиваемое на идентификацию микобактерий заявляемым способом, составляет 13±3 дней, по сравнению с непрямой идентификацией с пересевом на плотные среды (42±3 дней).
Технический результат достигается заявляемым способом пробоподготовки образцов для идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (maldi-tof-ms), у больных туберкулезом и микобактериозами включающим:
- забор венозной крови у больных с подозрением на инфекцию кровотока;
- полученный образец крови вносят во флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для культивирования микобактерий;
- флаконы с кровью инкубируют в автоматическом анализаторе для гемокультур, согласно протоколу производителя флаконов;
- при получении сигнала о «положительном» флаконе проводят окраску по Граму и Циль-Нильсену и при выявлении кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в окрашенных препаратах проводят дальнейшую пробоподготовку, для этого:
а) отбирают 5-6 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель, пробирку центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-20мин;
б) полученный осадок отмывают для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови и инактивируют пробу прогреванием с последующим охлаждением и центрифугированием;
в) полученный осадок высушивают до кремообразной консистенции и наносят на ячейки мишени для масс-спектрометра в трех повторах, поверх осадка наносят 70% муравьиную кислоту и после высыхания наносят матрицу НССА, после полного высыхания пробу помещают в масс- спектрометр и проводят процедуру идентификации согласно протоколу производителя прибора с использованием библиотеки белковых спектров микобактерий.
При этом отмывку полученного осадка от остатков коммерческой среды проводят фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия, затем к осадку добавляют 300-600 мкл деионизированной воды, тщательно перемешивают смесь на встряхивателе и проводят инактивацию пробы. Для инактивации пробы проводят ее нагревание до температуры 100°C и выдерживание при данной температуре в течение не менее 30 минут, затем охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют до получения осадка. Высушивание осадка на стадии в) осуществляют при комнатной температуре в течение 10-15 минут, в случае если осадок сохраняет гелеобразную структуру, то его выдерживают при температуре -70°C ± 2°C не менее 30 минут.
Осуществление изобретения
Венозную кровь для микробиологического исследования берут у больных с инфекцией кровотока из периферической вены или из центрального венозного катетера. Вносят образцы крови в коммерческие флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для культивирования микобактерий (BACTEC Myco/F Lytic). Флаконы с кровью инкубируют в автоматическом анализаторе для гемокультур BD Bactec FX (Becton Dickenson, США). При получении сигнала о «положительном» флаконе (то есть, получен рост микроорганизма из крови во флаконе с питательной средой) необходимо провести микроскопическое исследование гемокультуры по Граму и Циль-Нильсену согласно инструкции производителя к флаконом с питательной средой BACTEC, Myco/F Lytic. (Becton Dickenson, США).
Далее проводят процедуру экстракции белков для идентификации микобактерий, состоящую из 3-х этапов:
1. Получение осадка из смеси лизированной крови и среды с добавками для микобактерий.
Отбирают 5-6 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель (например Hebei Xinle Sci&Tech Co., Ltd., Китай (т.м. VacPlus) или Zhejiang Gongdong Medical Technology Co Ltd", Китай (т.м. Rustech и Гундун)). Пробирку центрифугируют при 3000 об/мин 20 минут.
2. Отмывка осадка для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови.
После центрифугирования микобактерии находятся на поверхности геля. Отбирают 1 мл и переносят в микроцентрифужную пробирку с замком на крышке. Суспензию гемокультуры центрифугируют при 12000 об/мин в течение 2 минут. Затем аккуратно отбирают надосадочную жидкость. Оставшийся осадок, содержащий микобактерии подвергают двухкратной отмывке фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия (SDS, для молекулярной биологии и жидкостной хроматографии). Для этого, к осадку добавляют 1 мл отмывочной смеси (фосфатно-солевой буфер с 0,1% раствором додецила сульфата натрия) и тщательно ресуспендируют осадок на встряхивателе в течение 10-30 секунд, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 2 минут, максимально отбирают надосадочную жидкость и повторяют процедуру отмывки еще один раз.
К полученному после отмывки осадку добавляют 300 мкл деионизированной воды, тщательно перемешивают смесь на встряхивателе и прогревают при 100°C в течение 30 минут. Затем охлаждают и центрифугируют 2 минуты при 12000 об/мин.
3. Подготовка образов для идентификации на масс-спектрометре.
Полученный осадок подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Подсушенный осадок имеет кремообразную консистенцию. Если осадок остается гелеобразным, то пробирку с осадком помещают в морозильную камеру (-70°C), минимум на 30 минут.
Далее наносят 1 мкл осадка на ячейки мишени для масс-спектрометра по меньшей мере в трех повторностях. Поверх осадка наносят 1 мкл 70% муравьиной кислоты и дают ему высохнуть. Затем наносят 1 мкл матрицы НССА и дожидаются ее полного высыхания. Затем мишень помещают в масс- спектрометр и проводят процедуру идентификации согласно протоколу производителя прибора с использованием библиотеки микобактерий, поставляемых с прибором, например с помощью библиотеки Mycobacterium library для прибора MALDI-TOF microflex, Brucker.
В период с 2018 по 2022 годы было исследовано 69 положительных гемокультур. Кровь для микробиологического исследования брали от больных ФГБУ «НМИЦ ФПИ» Минздрава России при лихорадочном состоянии и глубокой иммуносупрессии (CD4 менее 100 клеток/мкл) из периферической вены у постели больного. Вносили образцы крови в коммерческие флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для культивирования микобактерий (BACTEC Myco/F Lytic) и культивировали в автоматическом анализаторе гемокультур (BD ВАСТЕС FX, Becton Dickinson, США). После получения сигнала анализатора о наличии роста микроорганизмов во флаконе с гемокультурой, в зависимости от скорости роста, проводили микроскопию по Граму и Циль-Нильсену. При обнаружении в мазке кислотоустойчивых микобактерий проводили ускоренную идентификацию заявляемым способом. В случае, если КУМ в препарате не выявлялись, идентификацию не проводили. Параллельно проводили исследование стандартной методикой, которая заключается в пересеве полученной гемокультуры на плотные питательные среды, инкубируемые в термостате при 37±1°С. При получении видимого роста культуры идентифицировали методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии. Результаты представлены в таблице 1. Результаты идентификации до вида микобактерий, полученные заявляемой и стандартной методикой, полностью совпали. Медиана длительности инкубации флаконов с гемокультурой до получения положительного сигнала составила 13 дней 2 часа (разброс времени от 2 дней 0 минут до 40 дней 0 минут). Медиана времени, затраченного на пробоподготовку и идентификацию микобактерий заявляемым способом, составила 33 минуты (разброс от 25 до 49 минут). Медианное значение суммарного времени от начала инкубации гемокультур в анализаторе до идентификации микобактерий и передачи результатов исследования в клинические отделения с помощью заявляемого способа составило 13 дней 3 часа, тогда как при стандартной методике медиана суммарного времени составила 42 дня 11 часов. Таким образом, заявляемый способ позволяет идентифицировать микобактерии значительно раньше (на 29 дней 8 часов) и существенно сократить время предоставления результата в клинику, различия во времени статистически значимы (p<0,0001), что в свою очередь позволит врачу своевременно получить результат анализа и назначить адекватную терапию больному.
Таблица 1. Результаты идентификации микобактерий из положительных гемокультур разработанным и классическим методом.
Примеры реализации заявляемого способа ускоренной идентификации микобактерий
Пример 1.
Больной Б., 27 лет, поступил 28.03.2022 г. ВИЧ-инфекция, выявлена в мае 2021. Стадия 4В, кол-во CD4 8 кл/мл (2%), Жалобы на повышение температуры до 39°C, слабость, 29.03.2022 был назначен посев крови из периферической вены с помощью автоматизированной системы BACTEC FX. Через 8 дней 5 часов 35 минут (06.04.2022) после начала инкубации крови во флаконах для культивирования микобактерий, был зарегистрирован рост микроорганизмов. Сразу после сигнала автоматического анализатора гемокультур была проведена микроскопия по Циль-Нильсену, результаты которого определили наличие роста кислотоустойчивых микобактерий (микобактерии рода Mycobacterium) и использован заявляемый способ подготовки, образцов для идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS), согласно формуле изобретения:
а) отобрали 5 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель, пробирку отцентрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин;
б) полученный осадок отмыли для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия, затем к осадку добавили 300 мкл деионизированной воды, тщательно перемешали смесь на встряхивателе и провели температурную (нагрели до 100°C и выдержали при данной температуре в течении 30 минут, затем охладили пробу до комнатной температуры и центрифугировали 2 минуты при 12000 об/мин) инактивацию пробы;
в) полученный осадок высушили при комнатной температуре до кремообразной консистенции в течение 15 минут и нанесли на ячейки мишени для масс-спектрометра в трех повторах, поверх осадка нанесли 70% муравьиную кислоту и после высыхания нанесли матрицу НССА, после полного высыхания пробу поместили в масс- спектрометр и провели процедуру идентификации согласно протоколу производителя прибора с использованием библиотеки белковых спектров микобактерий.
Через 30 минут была получена идентификация микобактерий предложенным методом, были идентифицированы Mycobacterium avium. Сразу после получения результатов был установлен диагноз «Генерализованная МАС-инфекция с поражением легких, ВГЛУ, ВБЛУ, кишечника, костного мозга, прогрессирование» и назначено лечение по схеме лечения MAC-инфекции.
Параллельно был проведен пересев содержимого флакона с положительной гемокультурой на плотные питательные среды Левенштейна Йенсена согласно стандартной методике. Результат идентификации микобактерий стандартным методом, после пересева гемокультуры на плотные среды, был получен только через 33 дня и подтвердил полностью видовую принадлежность микобактерий.
Время от начала инкубации флакона с гемокультурой до идентификации микроорганизмов предложенным методом составило 8 дней 6 ч 5 мин, стандартным методом- 41 день 5 ч 35 мин. На момент идентификации стандартным методом (09.05.2022) на фоне приема антибактериальной терапии уже было достигнуто клиническое улучшение в виде снижения температуры тела до 37,8°С, уменьшения слабости, потливости. В настоящее время пациент продолжает лечение микобактериоза с положительным эффектом
Пример 2
Больная П, 65 лет, поступила в клинику ФГБУ «НМИЦ ФПИ» 25.05.2021 с симптомом легочной диссеминации, жалобами на слабость, повышение температуры до 38,5°C, кашель, затрудненное дыхание. 02.06.2022 был назначен посев крови из периферической вены с помощью автоматизированной системы BACTEC FX. Через 19 дней 19 часов 0 минут (22.06.2021) после начала инкубации крови во флаконах для культивирования микобактерий, был зарегистрирован рост микроорганизмов. Сразу после сигнала автоматического анализатора гемокультур была проведена микроскопия осадка по Циль-Нильсену результаты которого определили наличие роста кислотоустойчивых микобактерий (микобактерии рода Mycobacterium) и использован заявляемый способ подготовки образцов для идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS).
а) отобрали 6 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель, пробирку отцентрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин;
б) полученный осадок отмыли для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия, затем к осадку добавили 300 мкл деионизированной воды, тщательно перемешали смесь на встряхивателе и провели температурную (нагрели до 100°C и выдержали при данной температуре в течении 40 минут, затем охладили пробу до комнатной температуры и центрифугировали 2 минуты при 12000 об/мин) инактивацию пробы;
в) полученный осадок высушили при комнатной температуре до кремообразной консистенции в течение 10 минут и нанесли на ячейки мишени для масс-спектрометра в трех повторах, поверх осадка нанесли 70% муравьиную кислоту и после высыхания нанесли матрицу НССА, после полного высыхания пробу поместили в масс- спектрометр и провели процедуру идентификации согласно протоколу производителя прибора с использованием библиотеки белковых спектров микобактерий.
Параллельно был проведен пересев содержимого флакона с положительной гемокультурой на плотные питательные среды Левенштейна Йенсена согласно стандартной методике. Через 32 минуты была получена идентификация микобактерий предложенным методом, были идентифицированы Mycobacterium tuberculosis. После получения результатов был установлен диагноз диссеминированный туберкулез легких в фазе инфильтрации, изменен режим химиотерапии туберкулеза. Результат идентификации микроорганизмов классическим методом из гемокультуры был получен только через 30 дней и подтвердил полностью видовую принадлежность микобактерий. Время от начала инкубации флакона с гемокультурой до идентификации микроорганизмов заявляемым способом составило 19 дней 19 ч 51 мин, классическим методом - 49 дней 23 ч 00 мин. На момент идентификации классическим методом (21.07.2021) на фоне смены антибактериальной терапии было достигнуто клиническое улучшение в виде отсутствия лихорадки и снижения температуры тела до нормальных значений. В настоящее время пациентка продолжает лечение туберкулеза с положительным эффектом
Заявляемый способ прямой идентификации бактерий рода Mycobacterium из гемокультур значительно уменьшает время от посева до идентификации, что способствует повышению эффективности диагностики генерализованных форм туберкулеза и микобактериозов.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ идентификации Candida spp. и других дрожжеподобных грибов из положительной гемокультуры методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) у больных с инфекцией кровотока | 2020 |
|
RU2739758C1 |
| Способ идентификации бактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), у больных с инфекцией кровотока | 2020 |
|
RU2750611C1 |
| СПОСОБ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ КУЛЬТУР | 2021 |
|
RU2766185C1 |
| ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ MYCOBACTERIUM AVIUM COMPLEX | 2023 |
|
RU2819877C1 |
| СПОСОБЫ РАЗДЕЛЕНИЯ, ХАРАКТЕРИСТИКИ И(ИЛИ) ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ | 2009 |
|
RU2519650C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИЕМИЙ | 2011 |
|
RU2495939C2 |
| СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ СПЕКТРОСКОПИИ (ВАРИАНТЫ) | 2009 |
|
RU2531225C2 |
| СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАРАФИНОФИЛЬНЫХ МИКРООГРАНИЗМОВ | 1994 |
|
RU2161654C2 |
| СПОСОБЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИДЕНТИФИКАТОРА | 2009 |
|
RU2533252C2 |
| СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ТЕСТИРУЕМОГО ОБРАЗЦА ГЕМОКУЛЬТУРЫ | 2009 |
|
RU2541775C2 |
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, фтизиатрии, и может быть использовано для пробоподготовки образцов для идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (maldi-tof-ms) у больных туберкулезом и микобактериозами. Осуществляют забор венозной крови у больных с подозрением на инфекцию кровотока. Полученный образец крови вносят во флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для культивирования микобактерий. Флаконы с кровью инкубируют в автоматическом анализаторе для гемокультур. При получении сигнала о «положительном» флаконе проводят окраску по Граму и Циль-Нильсену и при выявлении кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в окрашенных препаратах проводят дальнейшую пробоподготовку. Для этого отбирают 5-6 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель, пробирку центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-20 мин. Полученный осадок отмывают для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови и инактивируют пробу прогреванием с последующим охлаждением и центрифугированием. Отмывку полученного осадка от остатков коммерческой среды можно проводить фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия. Затем к осадку можно добавить 300-600 мкл деионизированной воды, тщательно перемешать смесь на встряхивателе и проводить инактивацию пробы. Для инактивации пробы можно проводить ее нагревание до температуры 100°С и выдерживание при данной температуре в течение не менее 30 минут, затем охлаждать до комнатной температуры и центрифугировать до получения осадка. Полученный осадок высушивают до кремообразной консистенции. Высушивание осадка можно осуществлять при комнатной температуре в течение 10-15 минут. В случае если осадок сохраняет гелеобразную структуру, то его можно выдерживать при температуре -70±2°С не менее 30 минут. Высушенный осадок наносят на ячейки мишени для масс-спектрометра в трех повторах, поверх осадка наносят 70% муравьиную кислоту и после высыхания наносят матрицу HCCА. После полного высыхания пробу помещают в масс-спектрометр и проводят процедуру идентификации с использованием библиотеки белковых спектров микобактерий. Способ обеспечивает возможность прямой идентификации микобактерий из гемокультур, сокращение в 3-5 раз времени на видовую идентификацию микобактерий и упрощения процедуры экстракции микобактерий за счет внесения меньшего количества реагентов и сокращения времени подготовки положительных культур микобактерий. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.
1. Способ пробоподготовки образцов для идентификации микобактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (maldi-tof-ms) у больных туберкулезом и микобактериозами, включающий:
- забор венозной крови у больных с подозрением на инфекцию кровотока;
- полученный образец крови вносят во флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для культивирования микобактерий;
- флаконы с кровью инкубируют в автоматическом анализаторе для гемокультур;
- при получении сигнала о «положительном» флаконе проводят окраску по Граму и Циль-Нильсену и при выявлении кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в окрашенных препаратах проводят дальнейшую пробоподготовку, для этого:
а) отбирают 5-6 мл гемокультуры в пробирку, содержащую активатор свертывания и разделяющий гель, пробирку центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-20 мин;
б) полученный осадок отмывают для удаления остатков среды и лизатов форменных элементов крови и инактивируют пробу прогреванием с последующим охлаждением и центрифугированием;
в) полученный осадок высушивают до кремообразной консистенции и наносят на ячейки мишени для масс-спектрометра в трех повторах, поверх осадка наносят 70% муравьиную кислоту и после высыхания наносят матрицу HCCА, после полного высыхания пробу помещают в масс-спектрометр и проводят процедуру идентификации с использованием библиотеки белковых спектров микобактерий.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что отмывку полученного осадка от остатков коммерческой среды проводят фосфатно-солевым буфером с 0,1% раствором додецила сульфата натрия, затем к осадку добавляют 300-600 мкл деионизированной воды, тщательно перемешивают смесь на встряхивателе и проводят инактивацию пробы.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для инактивации пробы проводят ее нагревание до температуры 100°С и выдерживание при данной температуре в течение не менее 30 минут, затем охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют до получения осадка.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что высушивание осадка на стадии в) осуществляют при комнатной температуре в течение 10-15 минут, в случае если осадок сохраняет гелеобразную структуру, то его выдерживают при температуре -70±2°С не менее 30 минут.
| FERNANDEZ-ESGUEVA M | |||
| et al | |||
| Use of MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) for identification of Mycobacterium species isolated directly from liquid medium | |||
| Enferm Infecc Microbiol Clin (Engl Ed) | |||
| Способ регенерирования сульфо-кислот, употребленных при гидролизе жиров | 1924 |
|
SU2021A1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА | 1991 |
|
RU2024021C1 |
| RU 2011144385 A, 10.05.2013 | |||
| WO 2007083147 A2, 26.07.2007 | |||
| WO 2022069155 A1, 07.04.2022 | |||
| ZHU Y | |||
| et al | |||
