Способ получения церулоплазмина Советский патент 1995 года по МПК A61K38/48 

Ё

Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека - церу- лоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов.

Целью изобретения является сокращение числа стадий.

Поставленная цель достигается путем использования в качестве сорбента активированной целлюлозы отечественного производства, которая позволяет осуществлять сорбцию и элюцию препарата без применения хроматографических колонок, что. с одной стороны, значительно упрощает процесс и сокращает время элюирования, а с другой - исключает потери сорбента при элюировании и регенерации.

Кроме того, применение указанного сорбента позволяет исключить из технологии стадию промежуточного осаждения це- рулоплазмина спиртом из элюата и окончательную очистку препарата осуществлять непосредственно после элюции 0,25 М раствором хлористого натрия.

Сущность изобретения заключается в следующем. .

Отходы производства гамма-глобулина (фракции бета-глобулинов сыворотки крови) гомогенизируют в 0,05М раствора хлористого натрия), сорбируют церулоплазмин из полученного гомогената на активированной ДЕАЕ-целлюлозе при рН 6,3, освобождаются от балластных белков, промывая сорбент 0,12 М раствором хлористого натрия, злюи- руют церулоплазмин, помещая сорбент в сосуд с 0,25 М раствором хлористого натрия (при соотношении сорбента и элюата 2:1), доводят рН элюата до 5,2, температуру до 25°С, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации соответственно 25 об.%, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, доводят концентрацию спирта в центрифугате до 55 об.%, выдерживают на холоду 10ч при минус 10°С, центрифугируют, осадок препарата подвергают растворению, стерилизующей фильтрации и лиофилизации.

Пример 1.3 кг осадка III фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 14 л охлажденного до 4°С 0,05 М раствора хлористого натрия, доводят рН гомогената до 6,3, в полученную суспензию добавляют 300 г активированной ДЭАЭ- целлюлозы. Смесь оставляют при слабом перемешивании на 18ч при 4°С. Целлюлозу С сорбированным церулоплазмином отмывают от неспецифических белков в мешке из х/б ткани, помещая ее в сосуд с 5 л охлажденного до 4°С 0,12 М раствора хлористого натрия (последнюю процедуру проводят трижды до оптической плотности отмыви

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

шейся от сорбента суспензии балластных белков при длине волны 280 нм (Е 280) равной 0.100). Отмытую ДЭАЭ-цеплюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке помещают на 1 ч в 0,5 л охлажденного до 4°С 0,25 М раствора хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 0,5 л элюата доводят раствором 1 н. соляной кислоты до рН 5,2 и производят доочистку препарата от липопротеидных примесей добавлением этилового спирта и хлороформа до конечной концентрации 25 и 4 об,% соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при 25°С и образовавшийся осадок липопротеидов отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс.об/мин. К полученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в растворе 55 об.% и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10°С на 18 ч. Образовавшийся осадок получают центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 1 ч. Получено 1,35 г осадка, который был растворен и подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Окончательный выход препарата в данном примера составляет 0,45 г церулоплазмина на 1 кг исходного сырья. Его оптический коэффициент - 0,04. Биологическая активность - 17 усл.ед. Препарат апирогенный.

Пример 2. 30 кг осадка III фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 150 л охлажденного 0,05 М раствора хлористого натрия, рН 6,3, к гомогенату добавляют 3 кг активированной ДЭАЭ-цел- люлозы, сорбцию осуществляют при слабом перемешивании на холоду (4°С) 18 ч. Целлюлозу помещают в х/б мешок и отмывают от сорбированных на ней ыеспецифицеских балластных белков, помещая его в сосуд с 50л охлажденного 0,12 М хлористого натрия (эту процедуру повторяют трижды до оптической плотности отмывающейся от сорбента суспензии при длине волны 280 нм, равной 0,100).

Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке на 1 ч помещают в сосуд с 1,5 л охлажденного 0,25 М хлористого натрия для десорбции церуйоплазмина. Полученные 1,5 л элюата доводят раствором 1 н.НС до рН 5,2, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации в растворе до 25 и 4 об.% соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при 25°С, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс, об/мин. К полученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в раствора 55 об.% и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10°С на 18ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 1 ч. Получили 15 г осадка церуплаз- мина, который был растворен и подвергнут стерилизации и лиофилизации. Выход препарата церулоплазмина в данном примере 0,5 г на 1 кг исходного сырья. Оптический коэффициент Е 610/280 равен 0,042. Биологическая активность препарата составляла 17 усл.ед. Препарат апирогенен.

Преимущества заявляемого способа следующие: использование активированной целлюлозы, что значительно упрощает

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА путем гомогенизации Ш фракции по Кону отходов производства гамма-глобулина в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-целлюлозе, элюции, осаждении примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении из надосадочной

0

5

стадию освобождения сорбированного на ней церулоплазмина от сопутствующих балластных белков, имеющих близкую сорбци- онную способность; осуществление элюции препарата церулоплазмина без применения хроматогрфических колонок, с одной стороны, значительно упрощает процесс и время элюирования, а с другой - исключает потерю сорбента при элюировании и регенерации; проведение элюции церуплоплаз- мина 0.25 М раствором хлористого натрия позволяет исключить из технологии промежуточную стадию осаждения препарата этанолом, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения препарата церулоплазмина.

жидкости целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, отличающаяся тем, что, с целью сокращения числа стадий, сорбцию проводят на ДЭАЭ-целлюлозе, активированной ионизирующим излучением высоких энергий непосредственно после гомогенизации в растворе хлористого натрия, а злюцию - 0,25 мл раствором хлористого натрия.

Использование изобретение относится к медицине, а именно к технологии получения фермента крови человека - церулоплазмина, и может быть использовано при производстге медицинских препаратов Цель изобретения - сокращение числа стадий Сущность изобретения заключается в гомогенизации III фракции по Кону отходов производства гамма-глобулина в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ- целлюлозе, активизированной ионизирующим излучением, элюции 025 М раствором хлористого натрия, осаждении примесей смесью этилового спирта с хлороформом, центрифугировании, осаждении из надосадочной жидкости целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, его стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Положительный эффект заключается в сокращении одного этапа осаждения спиртом и растворения осадка