СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению препаратов из сыворотки крови.

Известен способ получения церулоплазмина (ЦП) из сыворотки крови, включающий:
1) экстракцию осадка III (Б) фосфатным буфером (ФБ) 0,02 М pH 6,5 -7,8;
2) хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в том же буфере, с последующей отмывкой 0,02 М ФБ с 0,05 М хлористого натрия и элюцией 0,02 М ФБ pH 6,8 с 0,18 М хлористого натрия;
3) стадию денатурации двухкратное осаждение ЦП 3 объемами этанола при комнатной температуре.

Выход ЦП составил 2 г/кг осадка Б (III).

Недостатками известного способа являются:
использование на стадии денатурации высокой концентрации этанола при комнатной температуре приводит к снижению активности ЦП в результате нарушения нативной структуры белка;
чистота конечного продукта 80% [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ЦП, состоящий из:
1) экстракции ЦП из осадков (IV, IV-I, III по Кону VI) 0,05 М ацетатным буфером (АБ) pH 7,0 ±0,1 с 0,05 М NaCl;
сорбции на ДЭАЭ-сефадексе А-50 (ДЭАЭ) в том же буфере, с последующей отмывкой тем же буфером и градиентной элюции NaCl 0,05 0,3 М в том же буфере;
кристаллизации в течение 3 5 дней. Выход 60% [2]
Использование в данном способе градиентной хроматографии и кристаллизации взамен стадии денатурации позволяет повысить чистоту до 90 95% и оксидазную активность до 34 ед/мг белка по Равину [3]
Однако метод, как и другие известные способы, не предусматривает освобождения ЦП от высокомолекулярных примесей (аггрегированный ЦП, липиды), которым приписывают побочные эффекты: перекисное окисление липидов, тромбообразующая активность, агрегация тромбоцитов [4]
Кроме того, кристаллизация длится 3 -5 суток, что нетехнологично, а перевод белка из растворимого состояния в осадок приводит к его частичной денатурации. При выделении ЦП по способу-прототипу в наших опытах из осадка Б (III), содержащего больше 50% липидов плазмы, кристаллизация не происходила даже через 6 дней в связи с высокой вязкостью раствора, обусловленного высоким содержанием липидов, 0,1 0,15 г/г белка.

Целью изобретения является повышение чистоты ЦП за счет освобождения от высокомолекулярных примесей. Это достигается тем, что при осуществлении способа полученный после хроматографии элюат диафильтрацией или разведением переводят в условия, необходимые для выпадения высокомолекулярных примесей в осадок: концентрация белка 0,5 2% ионная сила 0,01 0,04 М, pH 5,1 5,4, и подвергают отстаиванию в течение 6 12 ч. Затем раствор центрифугируют и концентрируют ультрафильтрацией.

Сравнительный анализ заявляемого способа с прототипом показывает, что общими признаками у них являются: экстракция ЦП из исходного сырья (осадок Б, сыворотка крови), сорбция на анионообменнике с последующей элюцией и очистка целевого продукта. Отличительной особенностью заявляемого способа является замена стадии кристаллизации ЦП на отстаивании раствора ЦП при низкой концентрации белка (до 2%) и условиях, способствующих выпадению в осадок высокомолекулярных примесей (pH 5,1 -5,4, ионная сила ацетатного буфера 0,01 -0,04).

Недостатки использования кристаллизации для получения целевого продукта: необходимость высокой концентрации белка в растворе (7 13%), что влечет за собой соосаждение высокомолекулярных примесей, а также агрегация ЦП и низкий выход за счет остаточной концентрации ЦП в растворе.

Заявляемый способ обеспечивает осаждение из раствора церулоплазмина высокомолекулярных примесей, а в способе-прототипе происходит перевод церулоплазмина в нерастворимое состояние (кристаллизация), что сопровождается денатурацией белка и вышеуказанными недостатками, т.е. в заявляемом способе белок-церулоплазмин находится только в растворимом состоянии, что способствует сохранению нативности целевого продукта и повышению его выхода и чистоты. Указанные отличия в литературе не описаны.

Пример 1.

Исходное сырье осадок Б (III).

1 кг осадка III гомогенизируют в 1 л холодного 0,3 М АБ pH 5,5 затем приливают 5 л дистиллированной воды (2 -4^oC), перемешивают в течение 30 мин и оставляют на 2 8 ч. Полученный раствор подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок не используется. В центрифугат заливают ДЭАЭ сефадекс А-50 в АБ 0,05 М pH 5,5 из расчета 2 5 г на 1 кг осадка Б (60 150 мл). Перемешивают на настольной мешалке (МИ-2) с минимальной скоростью 4 6 ч. Отстаивают 1 ч и декантируют. Анионообменник (АО) перегружают в батист на воронке и отмывают 1,5 л 0,05 М АБ pH 5,5 с 0,07 М хлористого натрия. Перегружают АО в колонку и элюируют градиентом 0,05 0,3 М хлористого натрия в 0,05 М АБ pH 7,0. Получают 200 мл элюата с концентрацией белка 1% который подвергают диафильтрации на полых волокнах (ВПУ-15) четырьмя объемами 0,01 М АБ pH 5,4. Полученный раствор отстаивают 6 ч и центрифугируют. К центрифугату добавляют равный объем стабилизатора 5% раствора глюкозы pH 6,5 -7,5 и ведут диафильтрацию тремя объемами 5% раствора глюкозы с pH 6,0 7,0.

Выход 70% Специфическая оксидазная активность 30 ед. акт/мг белка. Чистота E₆₁₀/E₂₈₀= 0,042 (95%).

Пример 2.

Исходное сырье сыворотка.

Плацентарную сыворотку 0,5 л разбавляют 1,5 л 0,05 М АБ pH 5,5, температура 2 5^oC. Выстаивают 10 16 ч и центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин. Все дальнейшие процессы ведут при температуре 2 5^oC. Осадок выбрасывают, а центрифугат, освобожденный от липопротеидов, забивающих колонку, наносят на колонку с ДЭАЭ сефадексом А-50 (2 4 г на 1 л исходной сыворотки) и отмывают 0,05 М АБ pH 7,0, содержащим 0,07 М хлористого натрия. ЦП элюируют градиентом хлористого натрия 0,07 0,3 М в АБ pH 0,05 М. Фракции с чистотой более 40 50% объединяют, подвергают диафильтрации против 3 объемов 0,025 М АБ pH 5,25 и концентрируют до 2% белка. Затем раствор подвергают выстаиванию 6 13 ч и центрифугированию. Белый осадок отбрасывают, а голубой раствор ЦП подвергают диафильтрации против 0,02 М АБ pH 6,0, содержащего 3,4% глюкозы.

Выход 80% Специфическая оксидазная активность 35 ед. акт/мг белка. Чистота E₆₁₀/E₂₈₀ 0,045 (99%).

Пример 3.

Выделение ЦП из плацентарной сыворотки проводят как в примере 2 с тем отличием, что полученный после хроматографии элюат разводят холодной дистиллированной водой (2 6^oC) до концентрации белка 0,5% и ионной силы 0,04 М, подкисляют 0,1 М ацетатным буфером (pH 3) до 5,1. Полученный раствор подвергают выстаиванию в течение 6 12 ч. Далее процесс ведут как в примере 2.

Характеристика полученного продукта: выход 74% специфическая оксидазная активность 33 ед. акт/мг белка, чистота E₆₁₀/E₂₈₀=0,043 (96%).

Обоснование найденных параметров способа.

Примеры 1 3 иллюстрируют достижение положительного эффекта в пределах выбранных значений параметра способа. Использование ионной силы меньше 0,01 и (или) pH ниже 5,1 приводит к денатурации белка с потерей синей окраски церулоплазмина. Ионная сила больше 0,04 и (или) pH 5,4 приводят к неполному освобождению от высокомолекулярных примесей.

Использование специальной стадии очистки для удаления высокомолекулярных примесей (липидов и аггрегатов) позволило получить ЦП с высокой степенью очистки, о чем свидетельствуют данные гель-хроматографии (фиг.1).

Гель-хроматография на сефадексе Г-200 (Фармация-ЛКБ, Швеция) церулоплазмина, полученного без ( а -прототип) и со стадией очистки от ЛП и аггрегатов (б заявляемый способ).

По данным гель-хроматографии видно, что высокомолекулярные примеси отсутствуют в препарате, полученном по предлагаемому способу, в то время как в препарате, полученном по способу-прототипу, их содержание составило 10 -20%
Содержание липопротеидов в процессе выделения ЦП представлено в табл.1.

Содержание липопротеидов в сыворотке крови и в образцах определялось сульфофосфованилиновым методом [5]
Сравнительная характеристика ЦП, полученного различными способами, представлена в табл.2.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение церулоплазмина, свободного от высокомолекулярных примесей, о чем свидетельствуют данные чистоты (95 99%) и гель-хроматографии.

Способ исключает воздействие на церулоплазмин денатурирующих факторов (этанол, высокая температура, кристаллизация-перевод в нерастворимое состояние), что предохраняет его от модификации биологических свойств и агрегации. Способ технологичен и не требует сложного оборудования.

Использованные источники информации
1. Авторское свидетельство СССР N 1003417, кл.A 61 K 35/16.

2. Авторское свидетельство СССР N 856078, кл.A 61 K 37/02 прототип.

3. Василец И.М. Шавловский М.М. Муха Г.Р. Физико-химические свойства и гетерогенность церулоплазмина крыс. Биохимия, 1970, 6, т. 35, вып. 6, с. 1139 1145.

4. Мхеян Э.Е. Влияние сывороточных белков на агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. "Патологическая физиология и экспериментальная терапия", 1982, N 1, с. 23 24.

5. "Определение общих липидов в сыворотке крови по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом". В кн. под ред. Колб В.Г. Камышников В.С. "Справочник по клинической химии", 1976.

Изобретение относится к способу получения ферментного препарата - церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта. Сырье (сыворотка, осадок Б) гомогенизируют в ацетатном буфере и центрируют. ДЭАЭ-сефадекс добавляют к центрифугату и перемешивают. Церулоплазмин элюируют градиентом хлористого натрия. Элюат диафильтрацией или разведением переводят в условия, необходимые для выпадения высокомолекудярных примесей: концентрация белка 0,5 - 2%, pH 5,1 - 5,4, ионная сила 0,01 - 0,04, затем подвергают отстаиванию в течение 6 - 12 часов, центрифугируют и концентрируют ультрафильтрацией. Чистота целевого продукта - 95 - 99%, выход - 70 - 80%. 2 табл., 1 ил.

Способ получения церулоплазмина путем растворения исходного сырья в буферном растворе, сорбции фермента на ионообменнике, элюции и последующей очистки, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты фермента, полученный после хроматографии элюат с концентрацией белка 0,5 2,0% подвергают отстаиванию в течение 6 12 ч при рН 5,1 5,4 и ионной силе 0,01 0,04 центрифугированию и концентрируют ультрафильтрацией.