ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ И ГЕМАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 A61K35/80 

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для повышения неспецифической резистентности организма к различным как биотическим, так и абиотическим факторам, профилактики и лечения иммунодефицитов, различных заболеваний систем крови и иммунитета.

В частности система крови имеет несколько звеньев, ответственных за характер, направления и силу иммунных ответов организма, она одной из первых реагирует на влияние факторов внешней среды. Поэтому в условиях постоянного действия неблагоприятных экологических факторов поиски высокоэффективных препаратов для предотвращения и лечения указанных заболеваний становятся все более актуальными.

Еще до недавнего времени арсенал средств для повышения устойчивости организма, иммуностимуляции и коррекции отдельных компонентов крови был достаточно ограниченным: в клинике инфекционных болезней использовали вакцины, для общей интенсификации обменных процессов - витамины, при аутоиммунных заболеваниях - гормональные препараты, анемиях - соединения железа, мышьяка или витамины, при лейкопениях - некоторые синтетические препараты.

В последние годы - в первую очередь благодаря достижениям в области неинфекционной иммунологии - положение значительно изменилось. Разработано достаточно много препаратов для стимуляции иммунной системы и лечения гематоцитопенических реакций.

Так, в медицинской практике уже применяется целый ряд иммуностимуляторов: гепарин, гистамин, гистаглобулин, сульфат декстрана, дибазол, дипиридамол или курантил, димексид, досулепин, изоприназил, циметидин, нуклеинат натрия, метилурацил, левамизол или декарис. Однако все указанные препараты действуют только на отдельные звенья иммунной системы, и их можно лишь условно отнести к классу неспефицических иммуностимуляторов.

Для лечения анемий в клинической практике применяют аскорбинат железа, восстановиленное железо, ангидрид мышьяка, арсенит калия, арсенат натрия, препараты, полученные из печени и желудка /камполон/, витамин B₆, B₁₂, B_c, лейкопений - нуклеинат натрия, пентоксил, тезан, лейкоген /Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993, т. I-II/.

Известен комплексный препарат для лечения заболеваний крови - гемостимулин, содержащий сухую /лиофилизированную/ кровь, лактат закисного железа и сульфат меди. Срок лечения им составляет 4-5 недель. Как побочное действие при использовании гемостимулина может раздражение слизистой оболочки желудка, тошнота.

Наиболее перспективными средствами являются препараты естественного, в частности растительного, происхождения в сравнении с соединениями химического синтеза: вследствие сродства их метаболических процессов с обменом веществ в теплокровном организме, а также уменьшения числа ограничений и побочного действия при использования. Препараты растительного происхождения могут выполнять функцию общих адаптогенов, значительно повышающих неспецифическую резистентность организма к большинству негативных факторов. Особенно это относится к фитокомпозициям, которые, как правило, более эффективны, чем их отдельные компоненты. Оптимальным методом получения сырья для изготовления препаратов с таким характером действия является биотехнологический способ, поскольку он высокопродуктивен, экологически чист, контролируем, независим от климатических условий и других как биотических, так и абиотических факторов.

Наиболее близким по физиологическому действию к заявляемой композиции является хлорофилло-каротиновый концентрат /ХКК/, выделенный из микроводоросли хлореллы - Chlorella vulgaris Bejier. /Патент Украины N 25582A. Средство для лечения гематоцитопенических реакций теплокровных организмов, 1998/. Это средство не имеет побочных эффектов, достаточно быстро /приблизительно за 20 дней/ нормализует количество эритро-, лейко- и ретикулоцитов в периферической крови животных при гематоцитопениях, вызванных различными факторами: кровопусканием, бензольной интоксикацией и внешним рентгеноблучением. Этот препарат выбран в качестве прототипа.

Задачей изобретения является разработка нового более эффективного средства, положительно действующего на различные звенья иммуно- и гематотропных процессов.

Поставленная задача достигается тем, что предлагаемая композиция содержит биомассы корня либо культуры женьшеня, а также микроводоросли спирулины при их массовом соотношении 1:/1-50/. При этом физиологическая активность веществ из этих биомасс значительно повышается при их одновременном применении. Это объясняется тем, что биохимический состав биомассы спирулины дополняется уникальными соединениями из биомассы женьшеня, что приводит к синергетическому эффекту их комплексного действия.

Для работы были выбраны биомассы спирулины из коллекции водорослей Института гидробиологии НАНУ /Spirulina platensis /Nordst./Geitl. HPDP-60/128/, а также корня женьшеня настоящего /Panax ginseng C.A. Mey/ плантационного выращивания и недавно выведенного штамма культуры клеток женьшеня японского /Panax japonicus C.A. Mey/repens/ P_3-4 - ВСККВР N 62, задепонированного во Всероссийской специализированной коллекции клеток высших растений.

Определено, что биомасса спирулины имеет высокое содержание белка /до 70%/ со всеми незаменимыми аминокислотами, углеводов /до 20%/, в том числе биологически активных полисахаридов /в частности с антибиотическими, противовирусными, антиоксидантными, противоопухолевыми свойствами/, жиров /до 8%/ с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементов /до 10%/, пигментов /хлорофиллов, фикоцианинов/, витаминов /A, C, B₁, B₂, B₆, B₁₂, B_c, E/, органических кислот.

Биомассы женьшеня содержат специфические тритерпеновые гликозиды - панаксозиды в количествах соответственно 1,5-2,0% от сухой массы /корень плантационного выращивания/ и 0,2-1,8% /штамм P_3-4/, а также другие сапонины, эфирные масла, необычные олигопептиды и жирные кислоты, полиацетиленовые производные, низкометаксилированные пектины, витамины группы B.

Таким образом, решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что в композиции используется биомасса спирулины, содержащая комплекс активных соединений, совместно с биомассой женьшеня с повышенным содержанием физиологически активных веществ.

Эффективность и возможность практической реализации изобретения подтверждается конкретными примерами.

Пример 1.

Биомассу женьшеня японского из культуры клеток штамма P_3-4 получали путем его выращивания в стерильных условиях на твердой или жидкой средах Мурасиге и Скуга следующего состава /мг/дм³/:
NH₄NO₃ - 1145-1850
KNO₃ - 1490 - 2100
CaCl₂ + 2H₂O - 420 - 500
MgSO₄ + 7H₂O - 350 - 400
KH₂PO₄ - 150 - 210
H₃BO₃ - 4,2 - 8,0
MnSO₄ + 4H₂O - 15,6 - 26,7
ZnSO₄ + 7H₂O - 6,0 - 10,3
KJ - 0,53 - 0,90
Na₂MoO₄ + 2H₂O - 0,15 - 0,30
CuSO₄ + 5H₂O - 0,02 - 0,075
CoCl₂ + 6H₂O - 0,02 - 0,075
FeSO₄ + 7H₂O - 25,0 - 30,0
Na₂ ЭДТА - 26,1 - 40,1
Тиамин-хлорид - 0,08 - 0,12
Пиридоксин - 0,08 - 0,12
α Нафтилуксусная кислота - 1,8 - 2,2
Кинетин - 0,8 - 1,2
Никотиновая кислота - 0,45 - 0,55
Мезоинозит - 80,0 - 100,0
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота /только для линии P₃/ - 0,18 - 0,20
Гидролизат казеина - 500 - 700
Сахароза - 2 - 5%
Агар-агар (для твердой среды) - 0,6 - 0,8%
pH среды (до автоклавирования) - 5,5 - 5,9
Выращивание проводили в темноте при температуре 26±1^oC и относительной влажности воздуха 67±4%.

При поверхностном культивировании использовали банки емкостью 250 см³ с объемом питательной среды 40 - 60 см³. Размер каллусного инокулята составлял 6,0 - 7,5 г сухой массы/дм³ среды, цикл выращивания - 30-35 суток.

При суспензионном выращивании на шейкере /115 - 120 об./мин, радиус вращения - 6,0 - 8,5 мм/ использовали конические колбы емкостью 1 дм³ с объемом питательной среды 240 - 300 см³. Размер инокулята составлял 1,0 - 1,5 г сухой массы/дм³, цикл выращивания - 17-18 дней.

Полученную биомассу отделяли от среды с помощью фильтрации, промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 40-50^oC до воздушно-сухого состояния.

Спирулину выращивали на стерильной среде Зарукка следующего состава /г/дм³/:
NaHCO₃ - 16,8
K₂HPO₄ · 3H₂O - 1,0
NaNO₃ - 2,5
K₂SO₄ - 1,0
NaCl - 1,0
MgSO₄ · 7H₂O - 0,2
CaCl · 6H₂O - 0,04
К комплексу солей основной среды после стерилизации добавляли растворы смесей микроэлементов 1 и 2 по 1 см³ каждого, которые приготавливали таким образом /г/дм³/:
Раствор 1
H₃BO₃ - 2,86
MnCl₂ · 4H₂O - 1,81
ZnSO₄ · 7H₂O - 0,22
CuSO₄ · 5H₂O - 0,08
MoO₃ - 0,015
Раствор 2
NH₄VO₃ - 0,023
K₂Cr₂(SO₄)₄ · 24H₂O - 0,096
NiSO₄ · 7H₂O - 0,048
Na₂WO₄ · 2H₂O - 0,018
Ti₂ (SO₄)₃ - 0,040
Co(NO₃)₂ · 6H₂O - 0,044
pH среды - 8,2 - 8,4 /после автоклавирования и добавления микроэлементов/. Размер инокулята - 0,1 - 0,3 г сухой массы/ дм³ среды.

Водоросль выращивания в полупериодическом режиме в биореакторах АКЛ-10 с ежедневным отбором 1/4 - 1/3 общего объема /10 дм³/ и добавлением такого же количества чистой среды. Перемешивание суспензии проводили с помощью механической мешалки /50-100 об./мин/. Температуру поддерживали в пределах 28 - 35^oC. Освещение осуществляли лампами типа ЛБ /сумма 100-200 Вт или 8 - 12 клк/. Альгологическую чистоту проверяли микроскопическим методом.

Отделение биомассы от среды проводили цетрифугированием при 8 тыс. об. /мин. Сконцентрированную биомассу промывали от остатка солей дистиллированной водой, снова отделяли центрифугированием и лиофильно высушивали.

Биомассы спирулины и женьшеня тщательно растирания и смешивали в массовых соотношениях 1:1, 20:1, 25:1, 50:1.

Пример 2.

Биомассу из корня женьшеня настоящего получали путем плантационного выращивания растений в Мироновском районе Киевской области в течение 5 лет по стандартному методу /на серых подзолистых почвах с применением светозащитных щитов/. После сбора корней их тщательно очищали от грязи, измельчали и высушивали.

Биомассу спирулины и приготовление композиции проводили так же, как описано в примере 1.

Пример 3.

С целью изучения характера и особенностей действия композиции, приготовленной так, как описано в примерах 1 или 2, на различные звенья иммунной системы были поставлены опыты на белых неинбредных крысах /самцах/ массой 230 - 270 г /n = 150/.

Композицию и ХКК вводили перорально из расчета соответственно 100 мг/кг массы тела животных из 250 мг³/кг /1 раз в сутки/ в течение 10 дней.

В качестве критериев неспецифического иммуностимулирующего действия были взяты следующие показатели: количество лимфоцитов, количество циркулирующих иммунных комплексов, а также фагоцитарная активность /фагоцитарное число/ нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови крыс.

Кровь брали из хвостовых сосудов животных в первый и на десятый дни опыта.

При определении количества лимфоцитов мазки подготовленных по стандартному методу образцов крови окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали их под микроскопом.

Иммуноглобулиновую фракцию белка плазмы крови выделяли методом имуноэлектроблотинга в полиакриламидном геле в присутствии додецилфосфата натрия. Количество циркулирующих иммунных комплексов определяли нефелометрическим способом.

Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов к подготовленным образцам клеток добавляли суточную культуру Staphylococcus aureus 209, инкубировали в термостате при 37^oC в течение 4 часов и с помощью светового микроскопа исследовали количество фагоцитированных микроорганизмов.

Результаты этих исследований приведены в таблице 1.

Эти результаты свидетельствуют о том, что композиция биомасс женьшеня и спирулины достоверно повышает все исследованные показатели неспецифического иммунитета в периферической крови крыс. Особенно существенным является относительное увеличение количества циркулирующих иммунных комплексов в плазме крови, что, очевидно, преимущественно связано с интенсификацией под влиянием женьшеня и спирулины белкового метаболизма в организме.

Таким образом, предлагаемое средство положительно влияет на все исследованные звенья иммунной системы животных, что позволяет надеяться на необходимую коррекцию им иммунного статуса организма при возникновении иммунодефицитов различной этиологии.

Пример 4.

Для подтверждения значительного иммуно- и гематотропного действия композиции биомасс женьшеня и спирулины, в частности, использовали модель получения анемической, лейкопенической и иммунодепрессивной реакций под влиянием внешнего рентгеноблучения.

Опыты проведены на белых неинбредных крысах /самцах/ массой 230 - 270 г /n = 90/.

Животных облучали однократно с помощью аппарата ИГУР из расчета 5 Гр на одно животное.

Композицию, приготовленную так, как описано в примере 1, и ХКК вводили перорально в количествах соответственно 50 мг/кг массы тела и 125 мм³/кг 1 раз в день в течение 20 суток.

Исследовали количественный состав клеток периферической крови и костного мозга /окрашенных по Романовскому-Гимза и Паппенгейму/, количество циркулирующих иммунных комплексов и фагоцитарную активность нейтрофилов в крови /по методам, описанным в примере 3/, а также морфологическое состояние клеток костного мозга, тимуса, селезенки и лимфоузлов.

Результаты приведены в таблице 3.

Следует подчеркнуть, что указанная модель цитопений характеризуется тотальным угнетением всех ростков кроветворения и общим иммунодепрессивным действием. Количество эритро-, лейко-, ретикулоцитов, а также циркулирующих иммунных комплексов и фагоцитарная активность нейтрофилов в контрольном варианте уменьшались в течение всего времени проведения эксперимента и на 20 сутки составляли около 60% от исходного значения соответствующих показателей.

Применение заявляемой композиции и ХКК положительно влияло на восстановление процессов кроветворения и неспецифического иммунитета. На 20 день практически все показатели в этих вариантах достигали значений фоновых, которые наблюдались в начале эксперимента, либо были максимально близки к ним. Единственное исключение составлял показатель количества циркулирующих иммунных комплексов в прототипе, который был на 15% меньшим от исходного значения.

В варианте предлагаемого средства значения последнего показателя практически восстанавливались уже на 15 день, что подтверждает наибольшее влияние композиции именно на это звено в системе иммунитета /пример 3/.

В конце эксперимента у 25% животных были изучены состояние костного мозга и миелограммы клеток. При этом в контрольной группе была зафиксирована значительная атрезия костного мозга и угнетение процессов кроветворения, особенно эритро- и гранулоцитопоэза. Кроме того, у животных этого варианта в селезенке и лимфоузлах наблюдались существенные устойчивые нарушения процессов развития стромы и снижение количества лимфоцитов, а также уменьшение массы и изменения морфологии тимуса /об этом свидетельствуют данные патоморфологических исследований/.

В отличие от этого при введении заявляемой композиции при внешнем ионизационном облучении животных не наблюдалось значительных изменений эритро- и гранулоцитопоэза в костном мозге, а также морфологического и функционального состояния клеток селезенки и лимфоузлов, массы и морфологии тимуса, за счет чего и были обеспечены протекание восстановительных процессов в организме и нормализация практически всех исследованных показателей систем крови и иммунитета /таблица 2/.

При использовании ХКК не наблюдалось существенных изменений количества гранулоцитарных элементов, однако несколько уменьшалось количество лимфоидных клеток при отсутствии влияния на другие гемопоэтические ростки. В селезенке и лимфоузлах животных этого варианта происходили некоторое снижение количества лимфоцитов и нарушения процессов локального развития стромы клеток.

Пример 5.

Другим способом моделирования действия сильного негативного фактора, вызывающего анемическую, лейкопеническую реакции и существенные нарушения функций иммунных систем организма, было пероральное введение белым крысам бензола /из расчета по 2 мл/кг массы тела в течение 5 дней/. Иные условия эксперимента были аналогичны тем, которые описаны в примере 4.

Результаты исследований /таблица 3/ свидетельствуют о том, что под влиянием бензольной интоксикации в контрольной группе животных происходило значительное уменьшение количества лейкоретикуло- и эритроцитов в периферической крови и угнетение характерных признаков иммунитета. Так, количество лейкоцитов на 10 сутки проведения эксперимента составляло лишь около 44% от фоновых значений. Однако во второй половине опыта наблюдалась тенденция к определенному восстановлению количеств эритро- и лейкоцитов, хотя и не 20 сутки значения этих показателей были меньшими, чем фоновые.

Использование предлагаемого средства при этой модели цитопений обеспечивало абсолютную нормализацию всех исследованных показателей уже на 10 день эксперимента и достоверное увеличение количества ретикулоцитов /на 15 день/ и эритроцитов /на 15 - 20 дни/ в сравнении с фоновыми значениями. Особенно важной является стимуляция ретикулоцитоза, поскольку из этих полипотентных клеток в дальнейшем образуются как гранулоциты, так и агранулоциты, что имеет существенное значение в обеспечении высокого уровня иммунного статуса организма в целом.

В то же время при использовании ХКК в лучшем случае происходила нормализация значений показателей /количества эритро-, лейко- и ретикулоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов/, а количество циркулирующих иммунных комплексов в плазме периферической крови на 10 - 15 дни уменьшалось относительно фонового значения и было ниже в сравнении с вариантом, где применялась заявляемая композиция.

Анализ миелограмм клеток костного мозга, а также морфологического и функционального состояния тканей и органов, продуцирующих клетки крови, в целом выявил те же закономерности, которые были описаны в примере 4.

Таким образом, проведенными исследованиями доказано высокая иммуностимулирующая и гематотропная активность композиции биомасс женьшеня и спирулины, что, в частности, приводило в условиях различных экспериментов к увеличению количества циркулирующих иммунных комплексов, ретикуло-, лейко- и эритроцитов, а также фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов. А это свидетельствует о стимуляции практически всех исследованных звеньев иммунной системы теплокровных животных и интенсификации соответствующих компенсаторных механизмов под влиянием предлагаемого средства, что обеспечивает высокую степень неспецифической резистентности организма, значительный резерв надежности нормального функционирования систем иммунитета и крови при действии неблагоприятных внешних факторов и стресс-факторов различной этиологии. Это, очевидно, связано с влиянием различных биологически активных веществ, содержащихся в женьшене и спирулине, на ряд различных процессов метаболизма, что является причиной синергизма их действия и обеспечивает наиболее полную реализацию их свойств неспецифических адаптогенов.

Все это позволяет надеяться на успех широкого применения указанной композиции в практике медицины и ветеринарии.

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для повышения неспецифической резистентности организма к различным как биотическим, так и абиотическим факторам, профилактики и лечения иммунодефицитов, различных заболеваний систем крови и иммунитета. Предлагаемая композиция содержит биомассы микроводоросли спирулины, а также корня или культуры клеток женьшеня. Еще один аспект изобретения заключается в использовании штамма культуры женьшеня японского Pаnах japonicus 62 /ВСККВР/ для получения биомассы. Проведенными исследованиями доказана высокая иммуностимулирующая и гематотропная активность композиции биомасс женьшеня и спирулины, что, в частности, приводило в условиях различных экспериментов к увеличению количеств циркулирующих иммунных комплексов, ретикуло-, лейко- и эритроцитов, а также фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов. 1 з. п.ф-лы, 3 табл.

1. Иммуностимулирующее и гематопротекторное средство, содержащее биомассу водоросли, отличающееся тем, что оно содержит биомассу сине-зеленой водоросли спирулины и дополнительную биомассу женьшеня при их массовом соотношении (1 - 50) : 1. 2. Иммуностимулирующее и гематопротекторное средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит биомассу женьшеня, полученную при выращивании штамма культуры клеток женьшения японского Panax japonicus C.A.Mey (repens) N 62 (ВСККВР).