ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЧИСТОГО ЦИКЛОСПОРИНА А И РОДСТВЕННЫХ ЦИКЛОСПОРИНОВ Российский патент 2001 года по МПК C07K1/16 C07K7/64 B01D15/08 

Изобретение касается нового способа хроматографической очистки циклоспорина A (Cy A) и родственных циклоспоринов, предназначенного для использования в фармацевтической промышленности.

При этом получают активные вещества в экономически выгодных условиях с фармацевтически приемлемой чистотой, т.е. в случае циклоспорина A выполняются, например, требования к степени чистоты PHARMEUROPA (PHARMEUROPA, т. 4, N 4, стр. 270, декабрь 1992 г.).

Благодаря успешному выделению циклоспорина A из Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) А. Рюггером и сотр. [Helv. Chim. Acta 59, 112 (1976)] впервые стал доступным новый класс сильнодействующих иммуноподавляющих веществ. Благодаря интенсивным исследованиям теперь известны свыше 25 родственных циклоспоринов с иммуноподавляющей и противомикозной активностью [R. Traber и др., Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)].

Сегодня выдающееся значение циклоспорина A в качестве средства подавления иммунной защиты после трансплантации органов неоспоримо. Между тем и в прошлом не было недостатка в стремлении удовлетворить возрастающие требования, предъявляемые к количеству и качеству этого необходимого для спасения жизни лекарственного средства путем усовершенствования способа получения.

Известные в настоящее время технические решения, касающиеся очистки содержащих циклоспорин A сырых экстрактов, предусматривают в большинстве случаев несколько стадий хроматографии с применением органических растворителей в качестве элюентов.

Так, например, в упомянутой выше работе A. Рюггера сначала хроматографию проводят на силикагеле 60 Merck (0,063-0,2 мм) с помощью хлороформа с возрастающим количеством метанола. После этого полученный продукт подвергают гель-хроматографии на Sephadex LH 20 в метаноле и затем в заключение на окиси алюминия (Брокманн, Akt. I) в толуоле при возрастании содержания этилацетата.

Аналогичные способы описываются и в более поздних работах (табл. 1). Часто адсорбенты Sephadex LH 20, силикагель 60 Merck (0,063-0,2 мм) и глинозем используются нейтральными. В качестве проточного средства применяют в большинстве случаев смеси из органических растворителей.

В связи с большой токсичностью, а также из-за присутствующих в активном веществе остатков растворителя и обусловленных этим проблем по технике безопасности во время переработки значительных количеств этих веществ (дистилляция, удаление вредных продуктов) хлороформ и хлористый метилен оказываются непригодны.

Кроме того, при использовании градиентов или сложных, например, тройных изократных смесей новый подбор проточных агентов после дистилляции элюатов является сложным и дорогим.

Аналогичным является и метод Биогала, описанный в патенте Канады 2096892, при котором перед хроматографией сырой экстракт подвергают температурной обработке. Здесь исходный продукт нагревают в течение около 1 часа до температуры примерно 110^oC и затем в течение 5 часов охлаждают до комнатной температуры. При использовании большой доли хлорированных углеводородов в двух последовательно применяемых системах проточных агентов при одностадийной хроматографии на силикагеле 60 выделяют циклоспорин A с чистотой около 97,6% в количестве около 15% от исходного количества. В промышленном масштабе такой результат не может удовлетворять ни по выходу, ни по чистоте получаемого активного вещества. Кроме того, согласно опыту такие сложные природные вещества не могут подвергаться температурному воздействию из-за своей термической нестабильности и возможной изомеризации.

Согласно известному уровню техники одностадийная хроматографическая очистка описана только в заявках FUJISAWA (WO 9213094) и BIOGAL (Канада, 2096892). Но в этом случае требуется дорогостоящая комбинация проточных агентов или градиент, что усложняет регенерацию проточных агентов.

Однако для точной оценки данного способа часто не хватает данных о выходе и чистоте продукта.

Примеры, иллюстрирующие некоторые из известных хроматографических методов очистки циклоспорина A, даны в табл. 1.

Краткое описание способа SMB содержится, например, у P.M. Никоуда, LC-GC INTL т. 5, N 5, стр. 43-47 и у К. К. Унгера (под его редакцией), Справочное пособие по высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), ч. 2, изд. GIT, г. Дармштадт, 1994 (см. чертеж).

С учетом описанного выше уровня техники задачами решения согласно изобретению, касающегося хроматографической очистки циклоспорина A с высокими требованиями к чистоте и выходу продукта, являются следующие.

Новый способ должен обеспечить получение циклоспорина A в количестве более 70% от использованного количества при качестве, отвечающем требованиям PHARMEUROPA (с учетом стадий хроматографической очистки).

Способ должен удовлетворять максимальным требованиям, предъявляемым к годовой производительности, и одновременно резко сократить расход растворителей и материалов для стационарных фаз.

Техническое решение должно быть простым, быстро реализуемым и надежным, т. е. растворители и адсорбенты должны обладать способностью к повторному использованию в течение по возможности длительного периода времени. В результате отпадает необходимость в применении трудно приготавливаемых или регенерируемых, изократно используемых смесей растворителей и градиентов.

Не допускается применение хлорированных углеводородов.

Способ должен обеспечивать возможность автоматизации, т.е. возможность непрерывного режима работы, и одновременно выполнять требования, предъявляемые к продукции, отвечающей GMP.

Исходным продуктом для хроматографической очистки служит, например, сырой экстракт, получаемый известными методами (например, DD 295872 A5) из сухого мицелия, содержащего циклоспорин A, путем экстракции (этилацетатом) и обезжиривания (нефтяным бензином/метанолом/водой) и содержащий кроме ряда, в большинстве случаев неизвестных веществ желтого и красного цвета и маслянистых продуктов, например, следующие циклоспорины:
Циклоспорины - Ненормальное соотношение, %¹⁾
C - 14,9
B - 13,7
L - 0,2
A - 65,1
G - 1,2
D - 1,2
Остаток - 3,7
¹⁾Аналитическое определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) в соответствии с требованиями PHARMEUROPA, т. 4, N 4, стр. 270 и последующие.

На первой стадии хроматографии отделяют полярные циклоспорины (C, B, L, U) от неполярных циклоспоринов (G, D), в результате чего образуются две целевых фракции, в которых наряду с циклоспорином A содержатся либо только полярные, либо только неполярные примеси. В результате на второй стадии хроматографии становится возможной оптимальная очистка циклоспорина A от соответствующих примесей.

Согласно изобретению высокая степень очистки циклоспорина A посредством хроматографии путем применения высокоэффективной жидкостной хроматографии в комбинации с методом подвижного слоя (Simulated Moving Bed - SMB-метод) проводится следующим образом.

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) или SMB-метод.

2. Хроматография, SMB-метод.

См. схемы 1-4 в конце описания.

Более точно, изобретение касается способа очистки циклоспорина A и родственных циклоспоринов из циклоспоринсодержащего сырого экстракта путем использования хроматографических способов с использованием силикагеля в качестве адсорбента, отличающегося тем, что при получении циклоспорина A и родственных циклоспоринов из циклоспоринсодержащего сырого экстракта хроматографическими способами с использованием силикагеля в качестве адсорбента:
а) на первой стадии хроматографии посредством препаративной хроматографии HPLC или SMB-метода сырой экстракт разделяют на фракции с различающимися концентрациями на целевую фракцию 1, содержащую неполярные примеси, и на целевую фракцию 2, содержащую более полярные примеси, и
b) целевую фракцию 1 (рафинат) и целевую фракцию 2 (экстракт) подвергают заключительной второй стадии хроматографии посредством SMB-метода.

При этом и первую стадию хроматографии, и также вторую стадию можно проводить в системе нормальная фаза/этилацетат или инверсная фаза, ацетонитрил/вода.

В частности при использовании SMB-метода обеспечиваются следующие преимущества:
становится возможным абсолютно непрерывный режим работы, т.е. благодаря новому режиму хроматографии отпадает необходимость в периодических инъекциях веществ. Такая непрерывно протекающая хроматография предпочтительна прежде всего при промышленном использовании.

SMB-метод позволяет применять более концентрированные растворы, чем раньше. В результате снижается расход растворителя и, следовательно, сокращается время на рекуперацию растворителя.

Благодаря таким экономически оптимальным параметрам SMB-метод применяется во все возрастающей степени и при хроматографическом разделении биотехнологически полученных протеинов (Nadler Т.К., Sch. Sci., университет Purdue, Восточный Лафейетт, США, IN 47907) и аминокислот (Adachi, S. и др., Agric. Biol. Chem., 1991 г., N 55, стр. 925-933).

Также в случае очистки продуктов, содержащих циклоспорин A, отмечено превосходство SMB-метода по сравнению с традиционными способами хроматографии (см. табл. 2).

Важнейшим техническим условием реализации SMB-разделения является точная подготовка разных частичных потоков (см. примеры) с тем, чтобы обеспечить квазистационарное состояние фронтов элюирования в зависимости от продолжительности включения.

Наряду с этим для оптимальной подготовки SMB-разделения требуется точное знание изотермы адсорбции целевого продукта и примесей в применяемой системе хроматографии. Их необходимо определить аналитически заранее.

Кроме того, в результате введения так называемой пятой зоны стало возможным отказаться от обычного двухкомпонентного разделения при классическом четырехзональном SMB-методе. Благодаря установленной в этой дополнительной зоне промывочной системе теперь стало возможным на той же стадии удалять примеси, которые являются причиной экстремальных значений k' в циклоспорине A. В результате стало также возможным дополнительно повысить качество целевого продукта.

Обычно стандартным SMB-методом можно в большинстве случаев хорошо разделять смеси с показателем k' от 0,6 до 2,0 (k'=1 у целевого продукта). Однако компоненты, которые располагаются вне этого диапазона, обычно вымываются в экстракт неполностью, в результате чего рафинат обогащается по сравнению с исходным материалом (загрузка) (фиг. 1).

Согласно новому осуществлению способа по изобретению колонки приводят в заданный режим переключением между четвертой и первой зонами путем промывки растворителем с большой элюирующей способностью (например, метанолом). В этом случае соответствующие колонки в составе оборудования, находящиеся в пятой зоне, оказываются в течение одного такта полностью изолированными от замкнутой кольцевой системы, состоящей из остальных четырех зон (фиг. 1).

Указанная пятая зона подразделена при этом на две стадии:
1. Во время первой подстадии колонки пятой зоны промывают пригодным растворителем с большой элюирующей способностью с целью очистки стационарной фазы от налипших примесей.

Предпочтительно в качестве промывочного средства использовать метанол. В случае промывки RP-материала можно использовать и чистый ацетонитрил, благодаря чему упрощается решение проблемы, связанной с рекуперацией растворителя, из-за отсутствия дополнительного растворителя.

2. На второй подстадии промывочным средством повторно промывают элюент, необходимый для разделения.

Если подразделяют колонки на зоны таким образом, что в пятой зоне находится больше колонок, процесс промывки может быть интенсифицирован, если указанные колонки во время промывки подключены параллельно.

Дополнительная оптимизация способа была достигнута при высокой степени очистки так называемой целевой фракции 2 на первой стадии хроматографии. Эта фракция содержит наряду с циклоспорином A прежде всего полярные примеси, такие как циклоспорин U и L. После перестановки мест отбора экстракта и рафината на SMB-установке неожиданно было установлено, что после этого очень хорошо отделялась указанная целевая фракция 2. При этом элюировали полярные примеси перед целевым продуктом циклоспорином A, т.е. они характеризовались более коротким временем удержания. Это означает, что в случае применения такого специального SMB-режима на второй стадии хроматографии, на этой стадии можно работать исключительно с системой RP-18, в результате чего существенно упрощается рекуперация растворителя (схема 1, см. в конце описания).

В последующих трех примерах, подтверждающих использование SMB-метода на второй стадии хроматографии, использованные исходные вещества по своим примесям соответствуют типичным целевым фракциям, получаемым после первой стадии хроматографии, проводимой с помощью обычной препаративной HPLC.

Пример 1 иллюстрирует высокую степень очистки промежуточного продукта, полученного на первой стадии хроматографии посредством SMB-метода в системе с нормальной фазой Si 60/этилацетат. Используемый продукт содержит наряду с циклоспорином A преимущественно более полярные примеси.

В результате было показано четкое обеднение полярными циклоспоринами (в частности циклоспоринов U и L, а также B и C), что подтверждает принципиальную пригодность системы разделения, используемую в сочетании с SMB-методом.

В примере 2 показана высокая степень очистки промежуточного продукта, который в качестве целевой фракции 1 преимущественно содержит неполярные примеси, с помощью SMB-метода в системе инверсной фазы RP-18/ацетонитрил, вода (60:40 об.%). После SMB-разделения наблюдалось четкое обеднение неполярными циклоспоринами (в частности циклоспоринами G и D).

В примере 3 показана высокая степень очистки промежуточного продукта, содержащего целевую фракцию 1 с преимущественно неполярными примесями, посредством SMB-метода в системе нормальная фаза/этилацетат.

По сравнению с примером 1 перестановкой мест отбора экстракта/рафината достигается более высокое обеднение неполярными примесями и обеспечивается экономия растворителя.

Такое тонкое разделение тем удивительнее, что еще несколько лет назад невозможно было даже с помощью аналитической HPLC разделить хроматографически чрезвычайно похожие, сопутствующие циклоспорину A вещества.

После перекристаллизации полученный циклоспорин A соответствует требованиям, предъявляемым к качеству как в USP XXIII, так и в EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2-е издание, 1995 г.

Описание фиг. 1.

Проточный агент циркулирует между зонами 1 и 4. Загрузка проб происходит между зонами 2 и 3. Свежий элюент подают между зонами 4 и 1. Рафинат (циклоспорин A) отбирают между зонами 3 и 4, экстракт (циклоспорин A + примеси) - между зонами 1 и 2. Каждая колонка снабжена 4 вентилями для загрузки (загрузки веществ), элюента, экстракта (целевой продукт + примеси) и рафината (целевой продукт). "Движение" носителя имитируется смещением места отбора и загрузки против направления элюирования. В результате обеспечивается непрерывное распределение вещества между фазами в системе колонок, концентрация элюата в местах отбора сохраняется постоянной.

В ходе экспериментального тестирования неожиданно было установлено, что разделение сопутствующих циклоспоринов U и L, с одной стороны, и G и D, с другой стороны, посредством SMB-метода происходит более полное, чем при использовании традиционной хроматографии, и что одновременно обеспечивается более высокий выход продукта на стадиях. В результате возможно применять установки с меньшими габаритами для обеспечения сопоставимой производительности, которые тем самым характеризуются меньшим расходом материала для заполнения колонок и элюента.

В принципе возможно естественно применение SMB-метода и на первой стадии хроматографии (схема 3, см. в конце описания). В этом случае при наличии пригодных сырых экстрактов (низкая загруженность балластными материалами прежде всего липофильного происхождения) в принципе можно проводить SMB-разделение, а также первую стадию в системе инверсная фаза/ацетонитрил, вода (схема 4, см. в конце описания). Поскольку, как было установлено позже, и полярные примеси можно отделять от циклоспорина A в системе инверсная фаза/ацетонитрил, вода после перестановки позиций рафинат/экстракт, то затем возможно также проводить очистку циклоспорина A только с применением системы инверсная фаза/ацетонитрил, вода в две стадии посредством SMB-метода или отделять также от циклоспорина A более неполярные примеси в системе нормальная фаза/этилацетат при перестановке позиций рафинат/экстракт, тогда становится также возможным проводить очистку циклоспорина A только при использовании системы нормальная фаза/этилацетат в две стадии посредством SMB-метода.

Пример 1
Отделение преимущественно полярных циклоспоринов (циклоспорины C, B, L, U) от циклоспорина A на второй стадии хроматографии с помощью SMB-метода в системе нормальная фаза/этилацетат (см.табл. 3).

Пример 2
Отделение преимущественно неполярных циклоспоринов (циклоспорины G, D) от циклоспорина A с помощью SMB-метода в системе RP-18/ацетонитрил, вода (см. табл. 4).

Пример 3
Отделение преимущественно неполярных циклоспоринов (циклоспорины C, G, D) от циклоспорина A на второй стадии хроматографии с помощью SMB-метода в системе нормальная фаза/этилацетат путем перестановки мест отбора экстракта и рафината (см. табл. 5).

Изобретение относится к новым способам хроматографии, предназначенным для очистки сырых экстрактов, содержащих циклоспорины, для использования в фармацевтической промышленности. При этом полностью или по меньшей мере частично традиционные препаративные методы хроматографического разделения полностью или частично заменяют методом подвижного слоя (SMB). Хроматографический способ получения высокочистого циклоспорина А и родственных циклоспоринов включает двухстадийное хроматографическое разделение с использованием силикагеля в качестве адсорбента, причем на первой стадии используют препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) или метод подвижного слоя (SMB), а на второй стадии полученные на первой стадии фракции (рафинад и экстракт) подвергают дополнительной очистке с помощью SMB-метода. Способ обеспечивает получение высокочистых продуктов разделения с высокой степенью очистки и высоким выходом. 5 з.п.ф-лы, 1 ил., 5 табл.

1. Способ очистки циклоспорина А и родственных циклоспоринов из циклоспоринсодержащего сырого экстракта хроматографическими способами с использованием силикагеля в качестве адсорбента, отличающийся тем, что а) на первой стадии хроматографии посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или метода подвижного слоя сырой экстракт разделяют путем деления на фракции с определенным профилем концентраций на целевую фракцию 1, содержащую более неполярные примеси, и на целевую фракцию 2, содержащую более полярные примеси; б) целевую фракцию 1 (рафинат) и целевую фракцию 2 (экстракт) подвергают на последующей второй стадии хроматографии дополнительной очистке посредством метода подвижного слоя (SMB-метода). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что а) как первую стадию хроматографии, так и вторую стадию хроматографии проводят в системе нормальная фаза/этилацетат или инверсная фаза, ацетонитрил/вода; б) целевую фракцию 1 (рафинат) обрабатывают согласно SMB-методу в системе инверсная фаза, ацетонитрил/вода и целевую фракцию 2 (экстракт) подвергают второй стадии хроматографии в системе нормальная фаза/этилацетат;
в) целевую фракцию 2 (экстракт) обрабатывают согласно SMB-методу в системе инверсная фаза, ацетонитрил/вода и целевую фракцию 1 (рафинат) подвергают второй стадии хроматографии в системе нормальная фаза/этилацетат. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при введении пятой зоны проводят промывку сначала спиртом, затем проточным средством и при наличии нескольких колонок в пятой зоне их протекание осуществляется по параллельной схеме. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что разделение на второй стадии хроматографии проводят в системе инверсная фаза, ацетонитрил/вода при соотношении ацетонитрил/вода 40 : 80 - 20 : 60, предпочтительно 60 : 40 (об.%). 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что температуру в колонках и температуру проточного средства в установке согласно методу подвижного слоя поддерживают в диапазоне 40 - 80^oC, предпочтительно при 60^oC. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в системе инверсная фаза/ацетонитрил, вода значение рН проточного средства устанавливают 2 - 5, предпочтительно 3.