ТВЕРДОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИАНАЛИТНЫХ АНАЛИЗОВ, СПОСОБ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ И СИСТЕМА, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ТАКОЕ УСТРОЙСТВО Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к устройству и прибору для одновременного определения нескольких анализируемых веществ (аналитов).

Обычно различные по составу аналиты анализируются с помощью специальных способов, например ферментного иммуноанализа, жидкостной хроматографии высокого разрешения, газовой хроматографии, ферментных и колориметрических способов. Большинство из этих способов предназначены для анализа одного аналита во время одного теста.

Автоматизация аналитических способов в целом сосредоточена на серийных анализаторах и анализаторах для проверки произвольных проб, где многократные анализы отдельных образцов производятся с использованием отдельных последовательных способов анализа. Это требует использования многочисленных индивидуальных наборов для анализа. Кроме того, анализ требует использования нескольких видов оборудования, например анализаторы для клинического химического анализа, жидкостные хроматографы высокого разрешения, масс-спектроскопы с использованием газовой хроматографии, автоматические приборы для иммуноанализа или приборы с использованием атомного поглощения.

Мультианалитная система должна включать средства для обеспечения одновременного анализа нескольких аналитов в испытуемом образце. Этот анализ должен обеспечивать результаты, идентифицирующие отдельные аналиты и показывать количество каждого отдельного аналита в таком испытуемом образце. Способ мультианалитного анализа часто патентуют, однако обычно оба этих критерия не выдерживаются.

Типичный субстрат мультианалитной системы содержит большое количество различных связывающих лигандов. Испытуемый образец вносят в каждую реакционную зону и после этого для идентификации присутствующего аналита используют многочисленные методы обнаружения. Важно, чтобы используемый способ обнаружения определял количество каждого отдельного аналита.

Наиболее общим способом получения мультианалитных рядов пространственно-различных участков биологически активных лигандов на субстрате является фотолитографический метод. Субстрат покрывают фотолабильным сшивающим агентом. Теоретически этот сшивающий агент становится реактивным по отношению к связующему лиганду только после светового облучения с соответствующей длиной волны. Пространственное разрешение достигается путем нанесения на субстрат физического покрытия (обычно изготавливаемого из хрома). Конфигурация отверстий в покрытии определяет конфигурацию связующих участков на субстрате.

Для каждого иммобилизуемого биологического лиганда общая схема такова: облучение первых сайтов, инкубирование облученного субстрата с первым иммобилизуемым лигандом, промывание с целью удаления плохо связанных лигандов, блокирование непрореагировавших сайтов, активированных на стадии облучения, и облучение участков, где должен быть иммобилизован второй биологический лиганд, после которого повторяются те же стадии, что и для первого лиганда. Пространственное разрешение регулируется путем контроля участка облучения: либо посредством когерентного УФ-лазерного источника света, либо количеством физических покрытий и некогерентного источника света. Это превращает задачу иммобилизации множества биологических лигандов в длительный процесс. Другим недостатком фотолитографического метода является использование дорогих физических покрытий или лазерного источника света. Далее, уровень неспецифического связывания является высоким.

Например, использование арилазидов, фторарилазидов и бензофенонов приводит к высокой степени неспецифического связывания. Высокий уровень неспецифического связывания на высоком фоне анализа значительно снижает динамический диапазон каждого мультианалитного анализа. Неспецифическое связывание происходит в основном из-за пассивной адсорбции молекул неактивированной поверхностью фотолабильного сшивающего агента через ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и т.д.

WO-A-9516204 описывает фотолитографический подход к уменьшению проблемы, связанной с высоким неспецифическим связыванием. В соответствии с этим подходом поверхностно-сшивающей молекулой является авидин, а фотолабильной молекулой является фотобиотин или его производное. Несмотря на то что заявлено уменьшение неспецифического связывания, этот метод требует вышеуказанной длительной последовательности действий. Иммобилизация 20 отдельных биологических лигандов требует в целом 80 этапов при выполнении основных требований к облучению, связыванию, блокированию и промыванию для каждого отдельного иммобилизуемого лиганда.

Пространственное разрешение также может быть достигнуто пассивной адсорбцией. Например, заявка США-А-5432099 описывает связывание лиганда с поверхностью субстрата путем сочетания ионного взаимодействия, гидрофобного взаимодействия и сил Ван-дер-Ваальса. Пассивная адсорбция зависит от изменений pH, температуры, ионной концентрации и от типа используемого субстрата, затрудняя контроль над процессом связывания. Основным недостатком этого подхода является чувствительность пропорции слабоиммобилизированного лиганда, подлежащего десорбции, во время стадий промывания или инкубирования биологического анализа, что приводит к плохой интра- и интерточности анализа.

Поперечно-сшивающим агентом, описываемым во многих публикациях, является глютаральдегид. Этот сшивающий агент приводит ко многим недостаткам, включая тенденцию белков к поперечному сшиванию, что, возможно, изменяет функции белка. Следующим недостатком является то, что процедура соединения должна включать стадию восстановления, которая является длительной и потенциально очень опасной, например, если в качестве восстановителя используют цианоборогидрид натрия. Используются гетеробифункциональные сшивающие агенты, однако во многих случаях это требует связывания свободных сульфидрильных групп с белком. Это вызывает необходимость модификации белка перед иммобилизацией.

При проведении мультианалитного анализа желательно получать как качественные, так и количественные результаты.

Например, мультианалитные анализы можно проводить с антибиотиками. В большой степени они основаны на анализах с использованием микробного ингибирования, в которых антибиотик, присутствующий в образце, подавляет бактериальный рост и образует очищенную зону, пропорциональную концентрации антибиотика, присутствующего в образце. Однако этот способ не может обеспечить идентификацию антибиотика или точное определение его концентрации. Способы микробного ингибирования также очень медленны, весь процесс занимает несколько дней.

Методы химического скрининга, такие как жидкостная хроматография высокого разрешения или масс-спектроскопия с использованием газовой/жидкостной хроматографии, соперничают в определении крайних членов пропорции: структурное разнообразие/полярность каждой антибиотической группы, например пенициллины, сульфамиды, аминогликозиды, тетрациклины и т.д. Кроме того, хроматографические методы требуют большой работы по приготовлению образца с целью обеспечения такого соотношения сигнала к шуму, при котором могут быть достигнуты пределы обнаружения.

Известные мультианалитные устройства включают Triage (см. Clinical Chemistry 38 (9): 1678-1684 (1992)) и Advisor (см. Clinical Chemistry 39 (9): 1899-1903 (1993)). Эти устройства пригодны только для количественного анализа.

Устройство Triage служит для одновременного обнаружения набора из семи элоупотребляемых лекарственных средств в моче человека. Каждое устройство может анализировать только один образец мочи. В конце процедуры оператор визуально осматривает каждую исследуемую лекарственно-специфическую зону на наличие красной полосы. Все стадии процедуры анализа должны выполняться оператором вручную. Также отсутствует распечатка результатов теста.

Использование устройства Advisor сходно с использованием устройства Triage. Устройство Advisor проверяет пять различных классов злоупотребляемых лекарственных средств. Устройство действует на основе принципов агглютинационного анализа, при этом каждому лекарственному средству предназначен отдельный канал. Все стадии процедуры анализа выполняются оператором. Негативные образцы имеют склеенные частицы, в то время как позитивные образцы лекарственного средства показывают раздельное расположение частиц.

В основном в биосенсорах/микроизготовленных устройствах для биологического использования в качестве субстрата применяют кремний. Иногда субстратом является стекло или кварц. Кремний имеет легко контролируемую кристаллографическую структуру с четко определенными кристаллическими плоскостями. Равномерность кремниевого субстрата идеально подходит для использования в мультианалитном испытательном устройстве.

Однако темные субстраты, такие как кремний, дают так называемый эффект черного тела. При использовании для обнаружения флуоресценции, во время которой фторофор возбуждают, используя свет с определенной длиной волны, темный субстрат может поглощать случайно возбужденную световую энергию, таким образом уменьшая излучение света фторофором.

В соответствии с настоящим изобретением устройство для проведения мультианалитных анализов включает субстрат и множество дискретных реакционных сайтов, каждый из которых имеет лиганд, ковалентно связанный с субстратом, и в котором поверхность субстрата между реакционными сайтами является инертной по отношению к аналиту. Таким образом, данное изобретение обеспечивает твердое мультианалитное устройство, не способное или почти не способное к неспецифическому связыванию.

Заявленное устройство может быть получено активированием поверхности подходящего субстрата и нанесением ряда лигандов на дискретные сайты этой поверхности. При желании другие активные участки могут быть заблокированы. Лиганды могут быть нанесены в водной системе, при этом предпочтительно придание другим участкам гидрофобных свойств. Лиганды могут быть связаны с субстратом посредством сшивающего агента. В частности, предпочтительно, чтобы активированная поверхность реагировала последовательно с органосиланом, бифункциональным сшивающим агентом и лигандом.

Данное изобретение также предусматривает обеспечение используемыми бифункциональными поперечно-сшивающими агентами высокоэффективного химического соединения между органосиланами, ковалентно иммобилизованными на микроизготовленных кремниевых или керамических субстратах. Биологические лиганды могут быть, таким образом, иммобилизованы в мультианалитные ряды.

Данное изобретение устраняет необходимость использования большого количества индивидуальных наборов для реактивного анализа, а также нескольких видов приборов, тем самым облегчая одновременное проведение множественных анализов одного образца. Данное изобретение обеспечивает единый общий анализатор, способный к одновременному обнаружению широкого спектра химических веществ. Кроме того, можно подбирать реактивы для тестирования определенного набора аналитов.

Данное изобретение также предусматривает иммобилизацию большого количества биологических лигандов в пространственно-определенный рисунок, состоящий из точек или линий, путем микрожидкостного распределения лиганда по химически активированному, субстрату. Биологический лиганд ковалентно прикреплен к субстрату. Эффективность присоединения биологического лиганда может быть такова, что химическая реакция завершается в течение нескольких минут. Процедура иммобилизации обеспечивает сохранение биологической активности биологического лиганда на протяжении как короткого, так и длительного времени.

Данное изобретение также обеспечивает единый анализатор для одновременного обнаружения большого числа аналитов в мультианалитной системе. Этот анализатор предусматривает максимальное удобство конечного потребителя, идентифицируя мультианалит и давая количественное определение каждого испытуемого образца. Предпочтительная система для анализа включает трансляционную платформу X-Y, аппарат для обработки образца, средство для контроля жидкой обработки/течения, темную коробку, контролируемую с помощью температуры, камеру устройства с зарядовой связью, а также математическое обеспечение для обработки изображения. Платформа может быть связана с соответствующим мотором для достижения заданной точности, например 10 μм, для расположения устройства (устройств) на каждой стадии аналитической процедуры.

На прилагаемых чертежах:
фиг. 1 показывает образование неравномерной поверхности субстрата,
фиг. 2 показывает химическое активирование групп на поверхности субстрата,
фиг. 3, 5 и 6 показывают ковалентную иммобилизацию лиганда на поверхности субстрата,
фиг. 4 показывает использование латексных частиц на поверхности субстрата,
фиг. 7-11 иллюстрируют устройства для введения субстратов, осуществляющих изобретение,
фиг. 12-14 - схематические виды системы, служащей для анализа устройства по данному изобретению,
фиг. 15 показывает калибровочные кривые для аналитов, исследуемых с помощью данного изобретения.

Субстрат, используемый в устройстве по данному изобретению, может, например, включать кремний, кварц, стекло или керамический материал. Керамические субстраты (окись алюминия) являются хорошей альтернативой кремниевым субстратам, поскольку позволяют успешно применять как флюоресцентные, так и хемилюминесцентные методы обнаружения. Это открытие было неожиданным, потому что кристаллография керамических материалов не предполагает их ближайшего выбора в качестве субстрата.

Керамический субстрат может быть изготовлен таким образом, чтобы обеспечить интервал размера гранул 1 - 30 μм. Предпочтительный размер частиц керамического субстрата, используемого в данном изобретении, составляет менее 20 μм, предпочтительно менее 10 μм. Уменьшенный размер частиц способствует значительному улучшению равномерности поверхности, что, в свою очередь, улучшает проведение биологических анализов. Другие важные свойства керамических субстратов включают допуск топографии поверхности, пористость, вакуумную герметичность и нулевое поглощение воды.

Предпочтительный керамический материал состоит из 94% окиси алюминия (Al₂O₃) с размером частиц в интервале 4-8 μм. Материал является вакуумно герметичным и после измельчения имеет топографию поверхности 0,6-0,8 μм. Равномерность поверхности может быть улучшена благодаря процессу шлифования, в результате которого получают поверхность с отклонением 0,4-0,5 μм. Дальнейшее улучшение достигается полировкой и шлифованием с получением поверхности с отклонением 0,05-0,1 μм.
Было найдено, что характеристика некоторых керамических субстратов зависит от характеристик размера гранул. Было найдено, что наилучшие результаты анализа достигаются при размере гранул керамических материалов до 8 μм, например 4-8 μм. Было найдено, что результаты для материалов с большим размером гранул неудовлетворительны. Проверка керамических субстратов с размером гранул приблизительно 1 μм не привела к улучшению результатов по сравнению с результатами, полученными для субстрата с размером гранул 4-8 μм. Это является преимуществом, поскольку стоимость керамического материала с очень маленьким размером частиц значительно выше (приблизительно в 5 раз).

Подходящие кремниевые субстраты изготавливают с пленкой окиси, имеющей точную толщину, например допуск ±2 нм для пленки окиси толщиной 100 нм. Пленка окиси может иметь толщину 50-500 нм, предпочтительно менее 200 нм, более предпочтительно в районе 100 нм.

Субстрат может быть получен как часть твердого микроизготовленного и микрообработанного устройства, разработанного для широкого круга панель-тестов для проведения ветеринарных и клинических диагнозов. Каждое твердое устройство для тестов имеет ряд реакционных участков. Каждый реакционный участок является специфическим для отдельного аналита. Реакционный участок может иметь вид пятна, желоба, углубления, выемки, впадины или камеры. Реакционные участки образуются с помощью иммобилизующих биологических молекул на субстрате.

Обычно устройство по данному изобретению имеет площадь до 1 см². Площадь каждого реакционного сайта обычно меньше 1 мм².

Твердые субстраты предпочтительно изготавливают таким образом, чтобы обеспечить сложную сеть отверстий, камер, желобков, впадин, углублений и т. д. Также предпочтительным является создание столбиков внутри желобков или впадин. Такие неровности могут помочь в достижении максимального взаимодействия участков поверхности между связанными биологическими лигандами и реактивами анализа, в значительной степени уменьшая инкубационный период для похожих сравнительных иммуноанализов и слоистых иммуноанализов.

В качестве альтернативы или помимо, например, углублений или желобков на кремниевом или керамическом субстрате поверхность может быть также микроизготовлена таким образом, чтобы на ней имелись камеры/резервуары/желобки для смешивания объемом от нанолитра до микролитра. Например, кремниевую поверхность вначале окисляют для образования слоя окиси. Затем наносят слой фоторезиста, на котором образуют желаемый рисунок. После образования рисунка на слое окиси фоторезист удаляют. Кремний затем протравливают, например, с помощью HF, а затем пленку окиси удаляют. Наконец, пленку окиси равномерно выращивают на всей поверхности кремниевой пластинки.

Иллюстрация процесса приводится на фиг. 1. На стадии (i) кремниевую пластинку 1 окисляют для получения слоя окиси 2, на стадии (ii) наносят фоторезистентный слой 3, на стадии (iii) с помощью света наносят рисунок, на стадии (iv) фоторезист удаляют, на стадии (v) пластинку 1 протравливают, на стадии (vi) удаляют пленку окиси и на стадии (vii) вновь образуется постоянная пленка окиси 2а.

Предпочтительна ковалентная иммобилизация биологических лигандов. Можно использовать пассивную адсорбцию, однако на такое взаимодействие влияют изменения pH, температуры и концентрации ионов, оно также может в некоторых случаях привести к освобождению слабосвязанных лигандов во время стадий инкубирования и промывания, ухудшая, таким образом, воспроизводимость анализа. Конечно желательно, чтобы после процедуры иммобилизации биологический лиганд сохранял максимальную активность.

Перед любым химическим активированием поверхность субстратов должна быть тщательно очищена. Первая стадия, предпочтительно, включает очищение поверхности ультразвуком в щелочном детергенте с последующим истощающим промыванием дважды деионизированной водой. Субстраты затем обрабатывают кислотным раствором хрома. Этот раствор продолжает очистку поверхности и открывает поверхностные эпоксидные группы, как показано на фиг. 2. Эпоксидные группы могут быть также открыты другими способами, например, воздействием ультразвука в течение 1 ч.

Образованные, таким образом, поверхностные гидроксильные группы готовы для дериватизации. Например, как показано на фиг. 3, последовательность реакций включает использование органосилана, затем бифункционального поперечно-сшивающего агента Z-R-Y для образования высокореактивного промежуточного соединения, и, наконец, функционализированного лиганда для достижения ковалентной иммобилизации.

Более подробно, в органосиланах формулы (RO)₃Si-(CH₂)_n-X каждый из R представляет собой алкильную или иную гидрокарбильную группу, такую как CH₃ или CH₂CH₃; n является целым числом. Например, от 1 до 18; а X представляет собой функциональную группу, такую как эпоксициклогексил, NH₂, CHO, ОН, SH, р-хлорбензил, m-хлорбензил, Br, Cl, -NH-CH₂-CH₂-NH₂, 2,3-эпоксипропокси, -N= C= 0, -N= C=S или р-хлорсульфонилфенил. Эти органосиланы могут быть выбраны для получения либо реактивной терминальной группы, способной образовывать ковалентную связь с биологической молекулой, либо менее реактивный остаток, такой как NH₂, где необходимо дальнейшее активирование с помощью бифункционального агента для получения соответствующей конечной группы. Органосиланы, обладающие терминальными электрофильными функциональными группами, не требуют активирования с помощью бифункционального поперечно-сшивающего агента, поскольку биологические лиганды могут быть иммобилизованы ковалентно через нуклеофильные группы на биологическом лиганде.

В том случае, если органосиланы имеют нуклеофильные группы, любой из многочисленных бифункциональных поперечно-сшивающих агентов может быть использован для получения в высшей степени реактивной химической группы, через которую биологическая молекула или лиганд могут быть присоединены ковалентно. Данное изобретение включает использование бифункциональных сшивающих агентов, которые могут быть использованы для массового производства химически активированных субстратов, являясь достаточно устойчивыми для длительного хранения до ковалентной связи биологической молекулы или связующего лиганда. Предпочтительные сшивающие агенты являются инертными в обычных атмосферных условиях, тем не менее, они также достаточно реактивны для того, чтобы образовывать ковалентные связи с функциональными группами иммобилизуемого биологического лиганда в течение очень короткого периода времени (обычно < 10 мин).

Бифункциональным сшивающим агентом может быть, например, фосген, тиофосген, N, N-дисукцинимидил карбонат, ксилилендиамин, 1,6-диаминогексан, 1,12-диаминододексан, 1,6-диизоцианатогексан, 1,12-диизоцианатододекан, 1,4-фенилендитиоизоцианат, цианурхлорид, терефтальдегид, р-нитробензоил хлорид, сульфаниловая кислота, 2-фторометилпиридин р-толуолсульфонат, 3-аминофенилбороновая кислота, р-бромфенилбороновая кислота, диэтилпирокарбонат, этил хлорформат, р-бромоаланин, р-бромфенил гидразид, р-бромбензальдегид, 1,2-этиленгликоль р-бромбензальдегида, N,N'-карбонилдиимидазол, терефталоил хлорид, эпихлоргидрин, 1,4-дииодобензол, 1,4-дибромбензол или производное N-гидроксисукцинимида, например, р-аминобензойной кислоты, р-бромбензойной кислоты, р-бромфенилуксусной кислоты, р-бромэтилбензойной кислоты, р-бромметилбензойной кислоты, р-формилбензойной кислоты, р-гидроксиметилбензойной кислоты, 1,2-этиленгликоль р-формилбензойной кислоты, р-бромфенилпропионовая кислота или р-гидроксифенилпропионовая кислота. Для реакции с органосиланом, имеющим нуклеофильную или электрофильную терминальную группу, может быть использован фотолабильный перекрестно-сшивающий агент. Таким агентом является, например, N-гидросукцинимид р-азидобензойной кислоты или р-аминобензофенон.

Вместо или помимо использования бифункциональных сшивающих агентов предпочтительно также ковалентно иммобилизовать слой латексных частиц. Диаметр латексных частиц предпочтительно менее 500 нм, а более предпочтительно менее 150 нм. Латексные частицы могут иметь ряд функциональных групп, например, -CH₂Cl, -CHO, р-хлорфенил, р-хлорстирил, -N=NH, -NH-NH₂ или -NH₂. Латексные частицы могут быть инкубированы при концентрации приблизительно 0,5-1% вес. /об., при этом субстраты модифицируют подходящим органосиланом в присутствии или в отсутствие гетеробифункционального сшивающего агента, как описано выше.

Фиг. 4 показывает две реакционные схемы иммобилизации латекса. За каждой из них может следовать активация латекса вторым сшивающим агентом и иммобилизация биологической молекулы или прямая ковалентная иммобилизация, например, антитела.

Альтернативой использованию полистироловых латексных частиц является ковалентная иммобилизация биологических лигандов к производным этиленгликоля, уже связанным с силанизированным субстратом. Например, производные полиэтиленгликоля с двумя электрофильными группами, такими как эпокси или карбонилимидазол, вступают в реакцию с силаном, имеющим терминальную группу -NH₂, такую как APTES на выбранном субстрате. Подходящая последовательность реакции показана на фиг. 5.

Предпочтительной может также явиться ковалентная иммобилизация биологического лиганда прямо к силановому слою, таким образом устраняя необходимость активирования силана полимерными материалами или бифункциональными сшивающими агентами. Органосиланы должны быть чувствительны к нуклеофильной атаке химической группой (например, NH₂, SH, ОН или NH=NH₂ на биологическом лиганде). Органосиланы, пригодные для прямого присоединения биологического лиганда, могут иметь галидные, эпокси-, изоцианато-, альдегидные или тозилатные функциональные группы. Такая реакция показана на фиг. 6, где E представляет собой электрофильную группу на органосилане. Примерами E являются Br, Cl, -O-CH₂-CH=CH₂, -NCO, -CHO и р-хлорсульфонилфенил.

Органосиланы, имеющие электрофильные группы, например глицидокси, также имеют то преимущество, что они менее чувствительны к полимеризации во время процедуры силанизирования благодаря отсутствию нуклеофильных групп, способных атаковать метокси- или этоксифункцию органосилана. Поэтому поверхность субстрата не должна содержать полимеризованного органосилана.

Химия поверхностей обеспечивает средство достижения пространственного разрешения благодаря быстрой кинетике образования ковалентных связей между химической функциональной группой поверхности и подходящей химической группой, находящейся в стерически выгодной позиции на иммобилизуемой биологической молекуле. Биологическую молекулу предпочтительно наносят на поверхность субстрата с помощью микрожидкостной пипетки в виде отдельной капли или ряда капель, образующих линию. Объем наносимой жидкости составляет порядка 1 - 100 нл, предпочтительно менее 50 нл, например ближе к 10 нл. Скорость образования ковалентных связей такова, что ковалентная иммобилизация достигается в течение нескольких минут, до того как нанесенная капелька или линия испарятся с поверхности. Позиционная точность, с которой наносится капелька или линия жидкости, должна иметь допуск ± 20 μм.
Особенно, если лиганды наносят в воде, также желательно сделать поверхность гидрофобной с целью предотвращения боковой диффузии нанесенной капельки или линии. Это свойство обеспечивает хорошее качество пятна и воспроизводимость, а также обеспечивает ковалентную иммобилизацию большего количества пятен биологических молекул на единицу площади поверхности.

Настоящее изобретение устраняет проблемы, связанные с обычной фотолитографией, обеспечивая возможность образования пространственно различных пятен биологических лигандов без необходимости использования УФ-света или физических покрытий. Как указано выше, пространственное разрешение может быть достигнуто с помощью методов микронанесения. Важным фактором является быстрая кинетика реакции ковалентного соединения, необходимая для высокоэффективного соединения биологического лиганда на пространственно отличном участке, устраняющая боковую дигрессию иммобилизованного биологического лиганда.

Затем непрореагировавшие химические остатки на субстрате могут быть заблокированы, например, с помощью блокирующих молекул, известных специалистам в данной области. Такие подходящие молекулы включают белки, такие как казеин, бычий сывороточный альбумин, лактальбумин и т.д., или блокаторы с низким молекулярным весом, такие как глицин, глютамин и т.д.

Могут быть также использованы фотолабильные сшивающие агенты. Например, органосилан на поверхности субстрата в темноте вступает в реакцию с фотолабильным сшивающим агентом (например, бензофеноном, арилазидами и т.д.). Затем по желанию на поверхность наносят биологические лиганды в виде пятен, и после короткого периода облучения УФ-светом или более длительного периода облучения видимым светом осуществляют ковалентное присоединение. Оставшиеся участки поверхности субстрата блокируют, используя блокаторы, подобные вышеописанным молекулам в присутствии УФ- или видимого света.

Иммобилизованные биологические молекулы на субстрате могут быть стабилизированы, например, инкубированием в сахарном растворе (например, трегалозе) в течение короткого периода времени (1 ч), а затем высушиванием при 37^oC в течение 16 ч. Затем стабилизированные субстраты могут быть для хранения запечатаны в пакеты из фольги с осушителем. Иммобилизованные биологические молекулы сохраняют стабильность в течение 6-12 месяцев и более, например до и свыше 2 лет при хранении при 2 - 8^oC.

Устройства могут быть помещены в различные носители, обеспечивающие способность контролировать эффективность смешивания реактивов теста. Текучесть жидких реактивов можно контролировать капиллярным притяжением, центробежной силой, вакуумной силой или электроосмотическим течением. Использование такого течения может устранить необходимость использования клапанов, таким образом, отпадает необходимость использования механических частей.

Связывание стеклянной пластинки с микроизготовленной поверхностью обеспечивает образование закрытых каналов. До связывания стеклянной пластинки биологические молекулы ковалентно связываются на поверхности. Многие процедуры связывания, например анодное связывание, требуют высоких температур и могут разрушить биологическую молекулу. Поэтому методы связывания должны быть натурированными по отношению к иммобилизованным биологическим молекулам. Одним из подходящих методов является непрямое связывание, например, когда вафлю связывают со стеклянной пластинкой с помощью подходящего клея, например эпоксидного клея.

Затем устройства могут быть помещены в подходящие носители. Различные носители такого рода показаны на фиг. 7 и 8. В качестве примера, размеры устройства, показанного на фиг. 8, составляют 48,62 • 48,62 мм, включая впадины, имеющие внутренний диаметр 10 мм и наружный диаметр 12,82 мм. Расстояние впадин от центра до центра составляет 15,36 мм.

Устройства могут включать детали для улучшения смешивания реагентов теста, образцов и т.д. Это показано на фиг. 9, где устройство включает сайт для введения реагента 11, желобки для реагента 12 и сайты для тест-реагентов 13.

На фиг. 10 устройство включает резервуары для реагентов 21, коллектор для распределения 22, канальные тест-сайты для распределения реагентов 23 и резервуар для отходов 24. Фиг. 11 показывает четырехканальную структуру для теста с похожими частями.

Данное изобретение обеспечивает полностью интегрированную систему для одновременного количественного определения аналитов, имеющих различные молекулярные массы, структуры и полярность. Наборы аналитов могут быть использованы для проведения клинической/ветеринарной диагностики или скрининга лекарственных средств.

В зависимости от аналитов соответственно выбирают связывающие лиганды. Это зависит от умения и опыта специалистов. Подходящие аналиты включают: антибиотики, например тетрациклины, сульфамиды, ионофоры, аминогликозиды, пенициллины или фторхинолоны;
- гормоны, например лютеинизирующий гормон, пролактин, фолликулостимулирующий гормон или тиреостимулирующий гормон;
- маркеры, сердечных нарушений, например миоглобин, карбоновую ангидразу, тропонин 1, гликогенфосфорилазу ВВ, СК-МВ, связывающий белок жирной кислоты или тропонин Т;
- маркеры инфекционных заболеваний;
- маркеры аллергий;
- злоупотребляемые лекарственные средства;
- ферменты;
- вирусы;
- нуклеотиды и
- пептиды.

Например, один набор предназначен для определения сульфамидных антибиотиков. Данное изобретение обеспечивает способ одновременного количественного определения до 20 отдельных сульфамидов. Примерами других наборов являются панели для определения сердечных нарушений, фертильности и инфекционных заболеваний.

Данное изобретение обеспечивает возможность одновременного определения приблизительно 20 аналитов, которые могут не иметь структурного сходства. Матрицы тестируемых образцов могут включать сыворотку, плазму, мочу, желчь, фекалии, ткань, воду и пищу. Объем требуемого образца очень невелик, обычно < 1,5 μл/аналит. Тест-реагенты, например меченные ферментом антитела и гаптены, меченные флуоресцеином антитела и гаптены, могут содержаться в общем резервуаре для реагентов, значительно снижая требования по хранению жидкостей.

В слоистых анализах, например, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, пролактина, тиреостимулирующего гормона и т.д. образец добавляют вместе с буфером и инкубируют в течение короткого периода времени, обычно менее 30 мин, предпочтительно менее 10 мин. После стадии промывания добавляют смесь меченых определяющих антител и инкубируют дальше в течение определенного периода времени. Этот период также обычно составляет менее 30 мин, предпочтительно менее 10 мин. Затем устройство промывают для удаления несвязанных меток и определяют количество сигнала.

Для некоторых анализов предпочтительным может оказаться внедрение в микроизготовленное устройство средства для удаления потенциальных интерферентов, таких как интерференция ревматоидного фактора. Удаление ревматоидного фактора может быть осуществлено путем контакта тестируемого образца с участком иммобилизованного иммуноглобулина, например контакт исследуемого образца с участком для реакции.

Следующим примером является интерференция НАМА (человеческих антимышиных антител). Эти антитела могут вызвать серьезные проблемы при проведении анализов с использованием моноклональных мышиных антител. Обычно эта проблема решается путем включения в тест-реагенты дорогостоящих добавок. Преимуществом данного изобретения является устранение интерференции НАМА посредством контакта образца с участками на микроизготовленном устройстве с целью удаления этих антител до того, как образец будет помещен на реакционный участок.

В целом, лиганды могут быть нанесены на часть устройства, связывающего примеси. Это особенно важно, когда на поверхность устройства, т.е. в желобки, допустимо нанесение определенного вещества. Возможность удаления интерферентных компонентов увеличивает точность получаемых результатов.

Определяющие метки могут быть также иммобилизованы на поверхности дендримерных молекул. Дендримерные молекулы полимерны по своей природе, синтезированы повторяющимся соединением небольших строительных молекул. Такие молекулы с различной молекулярной массой промышленно изготавливаются Aldrich Chemicals (с различным набором терминальных функциональных групп, например NH₂ или COOH). В соответствии с обычными методами соединения для приготовления определяющих меченых конъюгатов могут быть использованы гетеробифункциональные сшивающие агенты. При использовании небольших гаптеновых молекул, например β-агонистов, анаболических стероидов или антибиотиков предпочтительно соединение небольших дендримеров (предпочтительно не более 16 поверхностных групп) с большими дендримерами (обычно более 64 поверхностных групп). Гаптен с малой молекулярной массой (менее 1000 дальтон) соединяют с химическими группами небольшого дендримера с последующим ковалентным присоединением определяющей метки. Конъюгат дендримера может быть очищен с помощью диализа и гель-проникающей хроматографии.

Тест-реагенты содержат много компонентов (например, меченные ферментами антитела, меченные флуоресцеином антитела, иммобилизованные латексом антитела, дендримерные антитело-фторофорные конъюгаты, дендримерные антитело-ферментные конъюгаты, меченные ферментами гаптены, меченные флуоресцеином гаптены и т.д.), необходимые для конкретных наборов тестов. Наборы возможных тестов очень разнообразны и могут выбираться исходя из клинического диагноза (или ветеринарного анализа) по мере необходимости. Например, нужный набор для определения инфекционных заболеваний (таких как гепатит, ВИЧ, сифилис и т.д.). Другие наборы включают гормоны фертильности, сердечные маркеры, белки аллергии и т.д. Так же, как и клинические параметры, можно определить широкий набор остатков лекарственных средств.

Настоящее изобретение позволяет идентифицировать отдельные соединения, такие как антибиотики. Например, на устройстве, имеющем площадь поверхности 1 см², одновременно, обычно в течение нескольких минут, можно получить количественный результат, относящийся к до 20 антибиотикам, с чувствительностью, превышающей чувствительность методов жидкостной хроматографии высокого разрешения и масс-спектроскопии с использованием газовой хроматографии, и сравнимой с чувствительностью обычных ферментных иммуноанализов c одним параметром. Этот подход может быть легко применен к анаболическим стероидам, бета-агонистам, бета-блокаторам, пестицидам, терапевтическим лекарственным средствам и т.д.

При проведении анализов может быть использована хемолюминесценция, биолюминесценция или флюоресценция. Система для определения предпочтительно представляет собой камеру с зарядно-соединительным устройством с оборудованием для измерения как флюоресцентного, так и хемолюминесцентного света. Вкратце, указанная камера принимает световой сигнал, исходящий из испытуемых участков на микроизготовленном устройстве и превращает его в относительные световые единицы.

Использование систем для определения, основанных на флюоресценции, с подходящими оптическими фильтрами для меченых фторофоров дает прямые результаты.

Подходящим хемолюминесцентным реактивом является люминол, который может быть подвергнут анализу при длине волны 433-445 нм. Можно также наблюдать хемолюминесценцию, исходя из определения щелочных, меченных фосфатазой биологических молекул, и используя 1,2-диоксетан.

Для облегчения определения аналитов данное изобретение предпочтительно применяет хемолюминесцентную систему определения с использованием устройства с зарядовой связью. Предпочтение отдается черной освещенной камере для улучшения эффективности захвата при длине волны света, излучаемого хемолюминесцентной световой реакцией (приблизительно 433-445 нм в случае с люминолом).

Вся система может контролироваться с помощью персонального компьютера, где специально составленная программа контролирует таблицу X-Y, распределительное устройство, обработку образца, наблюдение за температурой, время инкубирования и камеру с зарядно-соединительным устройством. Фиг. 12-14 показывают организацию такой системы.

Фиг. 12 схематически показывает взаимодействие персонального компьютера, имеющего два контрольных узла 31 и 32. Узел 31 связан с системой изображения зарядно-соединительного устройства, обозначенного как 33. Узел 32 связан с распределительным узлом и трансляционной картой X-Y, при этом планшет для образца обозначен как 34 и 35 соответственно.

Фиг. 13 является схематическим изображением трансляционной карты X-Y. Этот чертеж показывает платформу для образца 41, установленную на линейный исполнительный механизм 42. Трансляция X-Y находится под контролем переходных моторов 43 и 44, соединенных с соответствующими приводами 45 и 46. Трансляция ограничивается "исходным положением" датчиков 47 и 48.

Чувствительность меченых биологических молекул и некоторых немеченых биологических молекул к свету может вызвать необходимость проведения анализов при отсутствии света. Отсутствие света достигается с помощью светонепроницаемой коробки. Температура светонепроницаемого пространства также предпочтительно контролируется, например, в диапазоне ±0,2^oC или предпочтительно ± 0,1^oC для обеспечения удовлетворительной точности анализа.

Фиг. 14 показывает прибор в перспективе, часть плана и усеченные боковые виды. В частности, фиг. 14A показывает контейнер 51 для хранения реагентов, светонепроницаемую дверь 52 и корпус камеры 53 со съемной крышкой 54. Основная часть камеры может находиться вне кожуха. Линзы камеры помещены в отверстие в кожухе.

Фиг. 14B показывает очертания образцов на пластинке для образца 55, участка для отходов 56, а также участок для изображения 57. Камера 53 установлена над этими участками. Фиг.14C показывает, помимо контейнера 51, камеру 53, карту X-Y 41, переходный мотор 43 и распределяющий насос 58.

Конструкция системы, показанной на фиг. 14, основана на 3 х 3 держателях штатива для образцов, которые могут одновременно содержать 20 образцов. Это означает, что если на каждом 1 см² микроизготовленного устройства находятся 20 отдельных реакционных участков, то на одном образце можно одновременно проводить 3600 анализов. Альтернативно, одновременно можно проводить анализ 180 образцов на 20 различных параметров теста.

Как указано выше, аналит может быть помечен. Лиганд также может быть помечен, обеспечивая проведение анализов при частичной занятости.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Анализ сульфонамида
В этом примере 12 отдельных антител (при этом каждое антитело специфично для одного сульфамида) иммобилизуют посредством ковалентного присоединения с помощью контактного взаимодействия к дискретным участкам плоского керамического (окись алюминия) субстрата, имеющего химически модифицированную поверхность. Используя сравнительный иммуноанализ, проводят мультианалитный анализ.

Более подробно, керамические субстраты (1 • 1 см) очищают с помощью ультразвука, используя щелочной детергент (RBS35, 5% об./об.), потом дважды деионизированную воду, а затем помещают в 6 М HCl на 16 ч. Потом субстраты помещают в хромовую кислоту на 1 ч в ультразвуковой бане.

Субстраты как можно тщательнее промывают двойной деионизированной водой и ацетоном, а затем высушивают в печи при 120^oC в течение 2 ч. После такой предварительной обработки субстраты силанизируют, используя органосилан гамма-глицидоксипропил триметоксисилан (10% об./об.) в безводном толуоле, 4-диметиламинопиридине (1,25 г/л) и триэтиламине (1% об./об.). Смесь подвергают дефлегмации в течение 4 ч, а
затем отстаивают в течение ночи при комнатной температуре. Перед отверждением в течение 4 ч при 120^oC субстраты промывают толуолом и ацетоном.

После отверждения субстраты помещают в контейнеры и хранят при комнатной температуре до тех пор, пока сульфамидные антитела не будут нанесены в качестве пятен. Сульфамидные антитела наносят в виде пятен, используя дозирующее устройство BIODOT XY3000. Анализу подвергают 12 сульфамидов: сульфадоксин, сульфаметиозол, сульфахлорпиридазин, сульфаметоксипиридазин, сульфамеразин, сульфапиридин, сульфисоксазол, сульфатиазол, сульфаметазин, сульфахиноксалин, сульфадиметоксин и сульфадиазин.

Для каждого сульфамидного антитела отмеряемый объем составляет приблизительно 20 нл. 12 сульфонамидных антител, образующих 12 дискретных участков на субстрате площадью 1 см², инкубируют в течение 2 ч при 37^oC. Субстраты промывают фосфатно-буферным солевым раствором (pH 7,2), содержащим 2% казеина (вес. /об. ), а затем блокируют в этом же буферном растворе в течение ночи при +2-8^oC. После промывания указанным раствором, содержащим PEG 300 (0,05% об./об.), устройства помещают в носитель.

Мультисульфонамидные стандарты (200 μл) и смесь сульфонамидных коньюгатов пероксидазы хрена (100 μл) помещают в реакционные выемки, содержащие устройство в установленном порядке, и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Стандарты содержат 5, 10, 50 и 100 нг/мл для каждого из 12 сульфамидов.

Затем мультисульфонамидные устройства промывают фосфатно-буферном солевым раствором и полиэтиленгликолевым буфером для удаления избытка реагентов и на каждое устройство наносят по 300 μл хемолюминесцентного субстрата [люминол (1,4 мМ)/перекись водорода мочевины (9,6 мМ)]. Устройства отображают, используя камеру устройства с зарядовой связью с выдержкой до 4 мин. Для каждого из 12 отдельных сульфамидов получают стандартные кривые. Калибровочные кривые для каждого из 12 отдельных сульфамидов показаны графически на фиг. 15. Процентная величина В/В₀, отложенная на оси Y, показывает % ингибирования величины нулевого стандарта относительной световой единицы, вызванного каждым отдельным сульфамидным стандартом (отложенным на оси X как log₁₀).

Пример 2. Анализ гормона
В этом примере мультианалитному анализу подвергают 3 гормона с высокой молекулярной массой, т.е. пролактин, фолликулостимулирующий гормон и лютеинизирующий гормон. Этот пример иллюстрирует мультианалитный анализ многослойного иммуноанализа. В процессе определения трех гормонов на одной и той же панели значительных перекрестных реакций не наблюдается.

Процедуры предварительной химической обработки и силанизирования проводят так же, как описано в примере 1. Моноклональные антитела пролактина, фолликулостимулирующего гормона или лютеинизирующего гормона (отмеривается приблизительно 20 нл антитела) иммобилизуют на дискретных участках химически модифицированного субстрата. Мультианалитные анализы проводят как на кремниевых, так и на керамических субстратах, при этом эпоксидная поверхность такая же, как описано в примере 1.

150 μл сложного стандарта, основанного на сыворотке трех вышеуказанных гормонов, и 150 μл буферного разбавляющего раствора добавляют к устройству и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. После стадии промывания добавляют 300 μл общей смеси конъюгатов пероксидазы из хрена лютеинизирующего гормона, пролактина и фолликулостимулирующего гормона и инкубируют в течение 15 мин. Затем устройство промывают для удаления избытка реагентов и наносят хемолюминесцентный реагент [люминол (1,4 мМ)/перекись водорода мочевины (9,6 мМ)] . Устройство отображают в камере устройства с зарядовой связью с выдержкой до 4 минут. После обработки изображений откладывают стандартные кривые для каждого из гормонов.

Пример 3. Анализ сульфамида
В отличие от примера 1 мультисульфамидный анализ также проводится с использованием микрожелобков. Устройство показано на фиг. 11. В этом примере резервуары 21 для добавления реагентов имеют размеры 2 • 2 мм и глубину 300 μм (объем 1,2 μл), каналы 23 имеют длину 5 мм, ширину 200 μм и глубину 100 μм (объем 100 нл), а резервуар 24 имеет размеры 1,9 • 8,6 мм и глубину 300 μм (объем 4,9 μл).

Химическое модифицирование поверхности осуществляется, как описано в примере 1. В каждый из желобков вносят по антителу и инкубируют в течение 2 ч при 37^oC. Затем субстраты блокируют и промывают, как в примере 1.

Смешивают мультисульфамидный стандарт (200 μл) и конъюгаты сульфамидной пероксидазы из хрена (100 μл). По 1 μл образующегося реагента добавляют с помощью пипетки в каждый резервуар, обеспечивая таким образом желобок, покрытый антителом, для каждого сульфамида. Стандарты, как и полагается, содержат 10 или 100 нг/мл всех сульфамидов.

Реагент течет благодаря капиллярному действию. После инкубирования в течение 2 мин устройство промывают 5 раз фосфатно-буферным солевым раствором/полиэтиленгликолем, затем добавляют хемолюминесцентный реагент [люминол (1,4 мМ)/перекись водорода мочевины (9,6 мМ)].

Устройство отображают в камере устройства с зарядовой связью с выдержкой до 4 минуют. Процентные величины В/В₀ для четырех сульфамидных кривых приводятся в табл. 1.

Полезность данного изобретения по сравнению с фотолитографией показана степенью неспецифической адсорбции биологических молекул на фотолабильном (обработанном бензофеноном) субстрате. Результаты показаны в табл. 2.

Мышиный IgG определяют, используя конъюгат антимышиной пероксидазы из хрена с применением хемолюминесцентного обнаружения с помощью камеры устройства с зарядовой связью. Кремниевые или керамические субстраты, имеющие иммобилизованный бензофеноновый фотолабильный сшивающий агент, не должен связывать мышиный IgG во время реакции при отсутствии света. Однако происходит неспецифическое связывание, поскольку приблизительно 80% средней относительной световой единицы, получаемой при проведении связывания мышиного IgG при УФ-свете, возникает благодаря пассивным взаимодействиям связывания. Ряд биологических молекул, иммобилизуемых через ковалентные взаимодействия, в соответствии с данным изобретением явно более четко определенный.

Очевидность ковалентного присоединения представлена в нижеописываемых примерах. В первом случае керамические субстраты силанизируют APTES, а затем подвергают реакции с биотин-LC-сульфо NHS. Контрольный керамический субстрат не силанизируют APTES, поэтому отсутствуют терминальные нуклеофильные NH₂-группы для реакции с сукцинимидиловым эфиром производного биотина. Эти субстраты затем подвергают реакции с конъюгатом авидина и флуорецинизоцианата, а флюоресценцию определяют с помощью камеры устройства с зарядовой связью. Результаты представлены в табл. 3.

Это ясно показывает специфическую иммобилизацию биотина-LC-NHS. Максимальная концентрация иммобилизованного биотина-LC-NHS составляет приблизительно 100 мг/мл, поскольку показатель относительной световой единицы для 500 мкг/мл субстрата не изменился.

В следующем примере керамические субстраты, силанизированные APTES, подвергают реакции с дигидразидным сшивающим агентом. Сульфамидные антитела обрабатывают перйодатом натрия для придания им реактивности по отношению к гидразидному сшивающему агенту. Контрольные сульфамидные антитела подвергают простому диализу против буферного раствора ацетата натрия, имеющего pH 5,5. Значения относительной световой единицы показаны в табл. 4 (необработанные) и табл. 5 (обработанные перйодатным способом). Результаты ясно показывают, что гидразидный сшивающий агент успешно связывается с керамической поверхностью. Контрольные антитела (без перйодатного активирования) дали очень плохие стандартные кривые по сравнению с ковалентно иммобилизованными сульфамидными антителами.

Процентные величины связывания благодаря ковалентным или пассивным взаимодействиям сравниваются в табл. 6 и 7. На ковалентное взаимодействие в среднем приходится 81,8% всего связывания, что ясно показывает ковалентное связывание сульфамидных антител.

Очевидно, что ковалентный метод дает более высокие результаты по сравнению с пассивным методом. Результаты пассивного метода могут быть увеличены приблизительно в два раза путем предварительной кислотной обработки сульфамидных антител, но они все-таки ниже, чем результаты ковалентного метода.

Также проводится подтверждающий анализ химически модифицированного кремния и керамических субстратов с использованием рентгенофотонной спектроскопии. Были записаны обзорные спектры двух произвольных участков каждого образца субстратов, которые служат для определения химического состава их поверхностей. Результаты приведены в табл. 8 (в атомных %).

Анализ атомного состава показывает очень хорошую конверсию родительского силикона и керамических субстратов с помощью органосилана APTES с хорошей воспроизводимостью состава поверхности двух участков, исследуемых для каждого образца. Субстраты, меченные ФИТЦ, показывают 70% и 77% маркирования кремния и керамического материала соответственно.

Количественные методы флюоресцентного измерения на темном кремниевом субстрате сравнивают с результатами, полученными на белом керамическом (окись алюминия) субстрате. Результаты по относительной световой единице, полученные при помощи устройства с зарядовой связью для флуоресцентных молекул (ФИТЦ), ковалентно связанных с каждым субстратом, сравнивают с количественным методом после удаления ФИТЦ-молекул, используя метод Hook et al. (Langmuir 1991, том 7, 142-151) (см табл. 9).

Количественный анализ флуоресцентной метки, полученной в результате удаления ФИТЦ-маркировки от субстрата и измерения сигнала с помощью камеры устройства с зарядовой связью показывает, что, несмотря на 1000-кратное увеличение сигнала керамического материала по сравнению в кремнием, действительно наблюдается значительно большее количество ФИТЦ-молекул на кремниевом субстрате.

Это явление далее иллюстрируется примерами, приведенными в табл. 10, полученными в результате анализа, проводимого на кремниевых и керамических субстратах с использованием флуоресцентных латексных частиц, связанных с пролактиновым антителом, используемым в качестве определяющей системы. Приводится также величина относительных световых единиц (выдержка 20 с).

Свойство керамического материала обеспечивают более высокие результаты по кремнию при использовании этого метода флуоресцентного определения. В дальнейшем проблемы действия темного тела на кремний при использовании флуоресценции могут быть решены использованием хемолюминесценции в качестве метода обнаружения. При сравнении идентичных анализов фолликулостимулирующего гормона, проводимых на кремнии и керамическом материале с использованием хемолюминесцентного определения, последний потребовал в 2 раза большего времени выдержки, чем керамический материал, для получения такой же величины относительной световой единицы.

В описании использованы следующие сокращения:
APTES - аминопропилтриэтоксилан;
СК-МВ - субъединица, создающая фермент MB (киназа);
HRPO - пироксидаза хрена;
LC - сульфо-NHS-сульфо-N-гидроксисукцинимид с длинной цепью;
FITC - изотиокарбамат флуоресцеина.

Изобретение относится к твердому устройству для проведения мультианалитных анализов, способам его формирования и системе, включающей это устройство. Твердое устройство для проведения мультианалитных анализов включает субстрат и множество дискретных реакционных сайтов. Каждый дискретный реакционный сайт имеет лиганд, ковалентно связанный с поверхностью субстрата. Участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются инертными по отношению к аналиту. Указанное устройство получено с помощью процесса, включающего активирование всей указанной поверхности субстрата. После чего указанным участкам между реакционными сайтами придают гидрофобность путем нанесения ряда лигандов. На указанные дискретные участки поверхности в воде наносят ряд лигандов таким образом, что указанные лиганды не наносятся на указанные гидрофобные участки между реакционными сайтами. Изобретение включает также систему, включающую это устройство и способ формирования твердого устройства для проведения мультианалитных анализов. Изобретение облегчает одновременное проведение множественных анализов одного образца, а также обеспечивает одновременное обнаружение широкого спектра химических веществ. 6 с. и 19 з.п.ф-лы, 15 ил., 10 табл.

1. Твердое устройство для проведения мультианалитных анализов, включающее субстрат и множество дискретных реакционных сайтов, каждый из которых имеет лиганд, ковалентно связанный с поверхностью субстрата, отличающееся тем, что участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются инертными по отношению к аналиту, при этом указанное устройство получено с помощью процесса, включающего активирование всей указанной поверхности субстрата, придание гидрофобности указанным участкам между реакционными сайтами и нанесение ряда лигандов на указанные дискретные участки поверхности в воде таким образом, что указанные лиганды не наносятся на указанные гидрофобные участки между реакционными сайтами. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что поверхность субстрата является неравномерной. 3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что указанный субстрат включает в себя ряд реакционных желобков, выступов, столбиков, пятен, камер, углублений, впадин или выемок. 4. Устройство по любому из пп.1 - 3, отличающееся тем, что субстрат состоит из керамического материала, стекла, кварца или кремния. 5. Устройство по любому из пп.1 - 4, отличающееся тем, что его площадь составляет менее 1 см². 6. Устройство по любому из пп. 1 - 5, отличающееся тем, что площадь каждого реакционного сайта составляет менее 1 мм². 7. Устройство по п.1, отличающееся тем, что получено с помощью процесса, включающего активирование всей указанной поверхности субстрата, придание гидрофобности указанным участкам между реакционными сайтами и нанесение ряда лигандов на указанные дискретные участки поверхности в воде таким образом, что указанные лиганды не наносятся на указанные гидрофобные участки между реакционными сайтами. 8. Устройство по п.7, отличающееся тем, что оно содержит лиганды, нанесенные на поверхность, активированную органосиланом. 9. Устройство по п.8, отличающееся тем, что органосилан имеет формулу (RO)₃Si-(СН₂)_n-X, где каждый R - гидрокарбильная группа, n - целое число, а X - функциональная группа. 10. Устройство по п.8 или 9, отличающееся тем, что оно содержит бифункционально-сшивающий агент для облегчения ковалентного присоединения биологических лигандов к органосилану. 11. Устройство по любому из пп.8 - 10, отличающееся тем, что в качестве бифункционально-сшивающего агента оно содержит фотолабильный сшивающий агент, который используют для реакции с органосиланом. 12. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит лиганды, иммобилизованные на поверхности, дериватизированной макромолекулами. 13. Устройство по любому из пп.1 - 12, отличающееся тем, что дополнительно включает лиганды, связующие материалы, присутствие которых мешает анализу аналита. 14. Устройство по п.1, отличающееся тем, что для обнаружения аналита оно содержит хемолюминесцентную систему определения с использованием устройства с зарядовой связью с задним освещением, пригодную для обнаружения света, излучаемого хемолюминесцентной световой реакцией, при которой длина волны обнаруживаемого света составляет менее 450 нм. 15. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве аналитов оно содержит антибиотики, гормоны, маркеры сердечных нарушений, маркеры инфекционных заболеваний, маркеры аллергии, лекарственные средства злоупотребляемых ферментов, вирусы, нуклеотиды и пептиды. 16. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит аналиты, которые вводят в образцы цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, кала, желчи, ткани или еды. 17. Система для мультианалитного анализа, отличающаяся тем, что включает устройство по любому из пп.1 - 13, трансляционную платформу, систему для обработки образца, систему для подачи жидкого реагента, темную коробку с контролируемой температурой, камеру устройства с зарядовой связью и прибор для обработки изображений. 18. Устройство по п.1, отличающееся тем, что субстрат является керамическим. 19. Устройство по п.12, отличающееся тем, что указанные макромолекулы выбраны из группы, состоящей из полистироловых латексных частиц, дендримеров и полиэтиленгликоля, содержащего химические группы, облегчающие ковалентное присоединение лигандов. 20. Способ проведения мультианалитного анализа, заключающийся в том, что вводят образец, подвергаемый мультианалитному анализу, в контакт с устройством по п.1 и определяют реакционные сайты, в которых аналит связан и/или не связан. 21. Способ формирования твердого устройства для проведения мультианалитных анализов, включающего субстрат и множество дискретных реакционных сайтов, каждый из которых имеет лиганд, ковалентно связанный с поверхностью субстрата, причем участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются инертными по отношению к аналиту, заключающийся в том, что активируют всю указанную поверхность субстрата, придают гидрофобность указанным участкам между реакционными сайтами и наносят ряд лигандов на указанные дискретные участки поверхности в воде таким образом, что указанные лиганды не наносятся на указанные гидрофобные участки между реакционными сайтами. 22. Способ формирования твердого устройства для проведения мультианалитных анализов, включающего субстрат и множество дискретных реакционных сайтов, каждый из которых имеет лиганд, ковалентно связанный с поверхностью субстрата, причем участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются инертными по отношению к аналиту, заключающийся в том, что активируют всю указанную поверхность субстрата, блокируют указанные участки между реакционными сайтами и наносят ряд лигандов на указанные дискретные участки поверхности в воде таким образом, что указанные лиганды не наносятся на указанные блокированные участки между реакционными сайтами. 23. Твердое устройство для проведения мультианалитных анализов, включающее субстрат, имеющий по меньшей мере одну активированную поверхность и множество дискретных реакционных сайтов, каждый из которых имеет лиганд, ковалентно связанный с поверхностью субстрата, отличающееся тем, что участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются инертными по отношению к аналиту. 24. Твердое устройство по п.23, отличающееся тем, что указанные участки поверхности субстрата, которые находятся между реакционными сайтами, являются гидрофобными. 25. Твердое устройство по п.23, отличающееся тем, что указанный субстрат является керамическим.