Настоящее изобретение относится к альфа-амидирующим ферментам, производству альфа-амидирующих ферментов и их использованию в производстве альфа-амидированных продуктов путем воздействия ферментов на удлиненные глицином субстраты. В определенных предпочтительных вариантах осуществления альфа-амидирующий фермент согласно изобретению может быть использован при получении полезных альфа-амидированных гормонов и других продуктов, используемых в сельском хозяйстве и медицине, включая кальцитонины, факторы освобождения гормонов роста, пептид, связанный с геном кальцитонина.
Внутриклеточное превращение (расщепление и/или изменение функциональных групп) предшественников нативных белков после их трансляции из кодирующей последовательности нуклеиновых кислот ясно представлено в различных документах.
Обычно клетки млекопитающих или других эукариотов могут осуществлять определенные операции пострансляционной обработки, тогда как прокариоты этого делать не могут. Некоторые прокариоты, например такие как E-coli, широко используются в качестве хозяев для получения белков млекопитающих с использованием технологии рекомбинантной ДНК (rДНК), поскольку они могут легко наращиваться путем ферментации и поскольку они генетически точно охарактеризованы. Однако многие белки млекопитающих, полученные с помощью генной инженерии, требуют посттрансляционной обработки, и это часто заставляет обращаться к использованию сложных химических операций in vitro, которые из-за их высокой стоимости ограничивают широкомасштабное промышленное применение.
Один из видов изменения активности включает в себя амидирование аминокислот, расположенных на карбоксильном конце белков. Многие встречающиеся в природе гормоны и пептиды содержат такое изменение, которое часто является существенным для их биологической активности. Примером является кальцитонин, где замещение неамидированного пролинового остатка на амидированный пролин нативной формы приводит к 3000-кратному уменьшению биологической активности.
Агент, который влияет на амидирование С-конца (альфа), узнает глициновый остаток, который следует непосредственно за аминокислотой, подвергаемой амидированию (R-X-гли, где R - основная последовательность белка, Х - остаток, который подвергается амидированию и гли - глициновый остаток). Глицин расщепляется и фактически отдает аминосоставляющую в предпоследнюю аминокислоту, в результате чего происходит ее амидирование.
Первыми авторами, сообщившими приблизительный молекулярный вес для альфа-амидирующего фермента, были Брэдбари и др. (Narure 298, 1982, 686-88). Они высказали предположение, что минимальная кажущаяся молекулярная масса, определенная на сефадексе G-100, составляет приблизительно 60000 Дальтон (1 Дальтон 1,6601×10-27 кг).
Последующие исследования показали, что молекулярная масса такого фермента, определенная методом гель-фильтрации, составляет от 60000 до 70000 Дальтон. Эти исследования включают в себя работы Хусайни и Тайта С.С. (FEBS. Letters, 152 №2, 1983, 277-281), Эйпер и др. (PNAS, 80, 1983, 5144-5148), Гомес и др. (FEBS Letters, 167, №1, 1984, 160-164) и Кайзер Дж. С. и др. (PNAS 81, 1984, 3228-3232).
Эйпер и др. (PNAS 80, 1983, с.5144-48) сообщил, что помимо молекулярного кислорода требуется два кофактора для максимальной активности фермента амидирования; ими являются аскорбиновая кислота и ион меди (11).
Химическая реакция, приводящая к амидированию карбоксильного конца пептида, требует источника аминогруппы. Брэдбари А.Ф. и др. (Nature 298, 1982, 686-688) показал, что глицин расщепляется и отдает аминосоставляющую предпоследней амино кислоте, приводя к амидированию последней. Требование в отношении глицина как донора аминогруппы было подтверждено другими авторами.
Лэндимор и др. (ВВRС 117, №1, 1983, 289-293) показали, что D-аланин также может служить в качестве донора аминогруппы в реакции амидирования. Проведенная Кайзером и др. (PNAS, 81, 1984, 3228-3232) последующая работа показала две различные ферментные активности в мозгу крысы, которые способны обеспечивать катализацию реакции альфа-амидирования. Образцы с большей молекулярной массой (70000 Дальтон) обладают специфичностью, ограниченной глицином у карбоксильного конца субстрата. Фермент с более низкой молекулярной массой принимает субстрат с β-аланином в качестве С-концевой аминокислоты.
Оптимальное значение рН для альфа-амидирующего фермента, экстрагированного и частично очищенного из свиного гипофиза, по сообщению Брэдбари А.Ф. и Смита Д.Дж. (ВВRС, 112, №2, 1983, 372-377) составляло приблизительно 7.0. Эйппер и др. (PNAS 80, 1983, 5144-5148) подтвердили эти результаты сообщением об оптимальном рН величиной 7,0 для альфа-амидирующего фермента, который был частично очищен от крысиного гипофиза. Они также отметили, что ферментативная активность быстро спадает при рН ниже 6,5 или выше 7,5.
Во всех вышеуказанных публикациях (включенных здесь путем ссылки на них) экстракты и частично очищенные ферментативные смеси содержат дополнительно протеолитические ферменты, способные вызывать разрушение потенциальных субстратов и продуктов, а также и самих альфа-амидирующих ферментов, таким образом замедляя амидирование с помощью таких ферментов пептидов и полипептидов, выделенных очисткой из природных источников или полученных с использованием технологий получения рекомбинантной ДНК.
Ранее измерение амидирующей активности было основано на преобразовании D-субстратов, таких как трипептиды, D-Тир-Вал-Гли-СООН, в D-Тир-Вал-CONH2. Однако использование формы "D" другими исследователями было связано с необходимостью нейтрализовать присутствие посторонних протеолитических ферментов в загрязненных препаратах амидирующих ферментов, использованных этими экспериментаторами. Эти посторонние ферменты могут иметь ярко выраженное протеолитическое влияние на субстраты с L-аминокислотой, одновременно оказывая слабое влияние на D-субстраты. Никто до настоящего времени не смог показать, что их ферментативные препараты с α-амидирующей активностью могут эффективно амидировать любые физиологически соответствующие им субстраты, т.е. L-субстраты, с получением биологически активных альфа-амидированных L-продуктов.
Как показано здесь, препараты согласно настоящему изобретению могут эффективно амидировать L-субстраты, а в отношении D-субстратов иметь активность от 60 до 1000 раз более высокую, чем наивысшая активность, указанная в любом ранее опубликованном источнике, который известен заявителям.
Ферментативные препараты, которые способны амидировать карбоксильные концы пептидов и белков, известны из различных опубликованных источников. Например, Брэдбари А.Ф. (Nature 298, 1982, 686-688) сообщает, что альфа-амидирующая активность присутствует в гипофизе свиней. Препарат из свиного гипофиза был способен преобразовывать пептиды, которые оканчиваются глицином, в соответствующий безглициновый пептидил-амид. Брэдбари и др. указывают, однако, что препараты не будут амидировать пептиды или полипептиды, выделенные очисткой из природных источников.
Отмечается, что описанные препараты содержат другие протеолитические ферменты, которые разрушают природные пептиды или полипептиды, и что неприродный D-тирозиновый остаток был использован специально, чтобы свести к минимуму такое разрушение.
Далее авторы указывают, что несмотря на использование после гомогенизации субклеточного фракционирования и гель-фильтрующей хроматографии для очистки амидирующего фермента, он остается загрязненным протеолитическим ферментом.
Хусайн И. и Тэйт С.С. (FEBS Letters, 152, №2, 1983, 277-281) описывает альфа-амидирующую активность в нейросекреторных железах гипофиза быка.
Эйпер и др. (PNAS, том 80, 1983, стр.5144-5148) сообщили о наличии альфа-амидирующей активности фермента в передней, промежуточной и задней долях крысиного гипофиза, промежуточном гипофизе быка. Однако в этой ссылке также имеется указание на применение синтетического D-Тир-Вал-Гли субстрата для исследования альфа-амидирующей активности и признание наличия загрязнений получаемых препаратов.
Гомес и др. (FEBS Letters 167, №1, 1984, 160-164) определили, что гипоталамус крыс также обладает альфа-амидирующей ферментативной активностью.
Брэдбари А.Ф. и Смит Д.Дж. (Сообщения Восьмого американского симпозиума по пептидам, стр.249-252 (1983), редакторы Хруби В.Дж. и Рич Д.Х.) описывают наличие активности альфа-амидирующего фермента в щитовидных железах крыс.
Мэйнс и др. (Endocrinology, 114, 1984, 1522-1530) сообщили, что клеточная линия, полученная из передней доли гипофиза мыши (АТТ-20), обладала альфа-амидирующей ферментативной активностью, которая явно снижалась с течением времени в культуре.
Некоторые низшие формы, например, морская собака (Squalus acanthias), по сообщению Одонохью Т.Л. и др. (Peptides 3, 1982, 353-395) содержат амидированные пептиды в экстрактах гипофиза. Шеллер Р.Х. и др. (Cell 32, 1983, 7-22) сообщили о наличии сигнальных пептидов амидирования у морских улиток. Несмотря на кажущееся всемирное распространение этого вида активности в природе, имеется мало информации по вопросу о физико-химических свойствах ферментов.
Это может быть связано с очень низкими уровнями присутствия ферментов в этих нейроэндокринных органах.
Наличие амидированных пептидов в определенных тканях не обязательно связано с высокими уровнями альфа-амидирующего фермента. Например, ткань передней части гипофиза крыс обладает высокой альфа-амидирующей активностью, но не содержит подходящих субстратов (Эйпперт и др. PNAS, 80, 5144-5148 /1983/). Ткань задней части гипофиза крыс содержит амидированные пептиды (окситоцин и вазопрессин), но обладает очень низкой альфа-амидирующей активностью (Эйперт и др., Endo, 116, 2497-2504 (1985)/. Поэтому, пока отдельные ткани не будут испытаны в отношении альфа-амидирующей активности, существующие или потенциальные уровни фермента не могут быть предсказаны.
Краткое изложение сущности изобретения
Целью настоящего изобретения является получение альфа-амидирующих ферментативных препаратов, которые могут обеспечить эффективное производство полезных альфа-амидированных продуктов, в т.ч. из субстратов, содержащих L-аминокислоты, например, пептидных или полипептидных субстратов, выделенных очисткой из природных источников или полученных с помощью технологии рекомбинантной ДНК.
Дополнительной целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа производства таких препаратов.
Дополнительной целью является также создание моноклональных антител, специфичных в отношении альфа-амидирующего фермента, иммобилизированных антител, смол для очистки, колонок для проведения хроматографии по иммуносродству и им подобных, которые при использовании указанных антител эффективно очищают альфа-амидирующий фермент.
Дополнительной целью является создание клеток-хозяев с помощью генной инженерии, которые способны обеспечить высокопродуктивную экспрессию альфа-амидирующего фермента.
Дополнительной целью настоящего изобретения является получение альфа-амидированных продуктов из субстратов, содержащих на С-конце глициновый остаток путем обработки их α-амидирующим ферментом по изобретению.
Эти и другие цели станут очевидны из рассмотрения последующего описания. Согласно настоящему изобретению, заявители предусматривают новые альфа-амидирующие ферментативные препараты достаточной чистоты, чтобы проявить удельную альфа-амидирующую активность, по меньшей мере, 25 мЕ на мг белка и предпочтительно выше 50 или выше 150 мЕ/мг протеина. Все единицы удельной активности, указанные здесь, приведены в пересчете на преобразование Дансил-D-Три-Гли-СООН в Дан-сил-D-Тир-Вал-СОNН2. Одна мЕ определяется как величина активности, необходимая для преобразования одного наномоля (нмоль) Дансил-D-Тир-Вал-Гли-СООН в один наномоль Дансил-D-Тир-Вал-Гли-СОNН2 за минуту при 37°С и рН 7,0 в присутствии ионов аскорбиновой кислоты (в конечной концентрации 3 мМ), молекулярного кислорода в молярном избытке относительно субстрата и ионов меди в концентрации достаточной, чтобы получить максимальную активность (обычно около 2 мм, в зависимости от чистоты фермента).
Альфа-амидирующие ферменты согласно изобретению, обладающие активностью пептидил глицин альфа-амидирующей монооксигеназы, способны обеспечивать катализацию превращения пептидильного соединения, имеющего глициновый остаток у, по меньшей мере, С-конца пептидной цепи, в соответствующее пептидил амидное соединение, имеющее аминогруппу вместо глицина. Используемый здесь термин "пептидная цепь" означает любой полипептид, имеющий, по меньшей мере, две аминокислоты, соединенные между собой с помощью пептидной связи. Термин "пептидильное соединение" включает в себя любое соединение, имеющее пептидную цепь. Термин "соответствующий пептидил амид" касается любого продукта реакций, в котором глицин на С-конце пептидной цепи замещен аминогруппой.
Целесообразно, чтобы реакция альфа-амидирования происходила в присутствии кислорода и восстанавливающего вещества. Такие восстановители могут включать в себя, но не ограничиваются этим, аскорбиновую кислоту, соли аскорбиновой кислоты, дигидроксифумарат, металлические соединения цианида, тетрагидроптерин. Было установлено, что определенные кофакторы способствуют течению реакции или замедляют снижение активности фермента. Эти кофакторы включают, но не ограничены этим, каталазу, этанол, калий иодид и ионы меди. Очищенные ферментативные препараты согласно изобретению предпочтительно свободны от протеолитической активности, способной вызывать разрушение альфа-амидирующего фермента, продуктов или реактантов реакции альфа-амидирования, за счет чего они могут обеспечивать катализ реакции альфа-амидирования, когда субстрат и продукт содержат L-аминокислоты.
Как будет подробно описано здесь далее, заявители провели очистку огромного количества образцов специфических белков, которые обладают альфа-амидирующей активностью. "Альфа-амидирующая активность" в том смысле, как она здесь используется, означает любую активность, имеющую тенденцию оставлять только одну аминогруппу в положении, ранее занимаемом глицином на С-конце пептидного субстрата.
"Альфа-амидирующий фермент" в том смысле, как он здесь используется, относится к любому препарату или индивидуальному соединению, которое проявляет альфа-амидирующую активность и к активным гомологам и их фрагментам.
Ферментативные препараты, выделенные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть очищены до однородности. Термин "однородный" здесь относится к ферментативным препаратам, проявляющим единственную четко определенную полосу после электрофореза в полиакриламидном геле с Nа-ДС и демонстрирующим единственную последовательность аминокислот в соответствующих исследованиях.
Определенные альфа-амидирующие ферменты, очищенные до однородного состояния в соответствии с настоящим изобретением, проявляли удельные ферментативные активности выше 1500 мЕ/мг белка.
Ферментативные композиции, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы при производстве полезных альфа-амидированных пептидных продуктов. В качестве субстрата используется пептидное соединение, имеющее глициновый остаток у по меньшей мере С-конца пептидной цепи, где замещение глицина на С-конце аминогруппой приводит к получению требуемого продукта. Субстрат вводится в реакцию предпочтительно в присутствии кислорода и восстанавливающего агента и контакт с ферментативным препаратом, полученным в соответствии с настоящим изобретением, в течение времени, достаточного для преобразования пептида в соответствующий пептидиламид. Скорость реакции в значительной мере зависит от рН, температуры, сродства субстрата, концентрации кофакторов и других параметров, которые могут изменяться известным образом, чтобы оптимизировать реакцию. Реакция обычно должна развиваться в течение времени, выбранного с учетом требуемого процента преобразования (субстрата в продукт). В предпочтительных вариантах осуществления используются кофакторы, такие как те, что рассмотрены выше, чтобы способствовать развитию реакции и/или повышению и стабилизации активности фермента.
Огромное количество полезных продуктов, включая природные гормоны и им подобные, для которых альфа-амидирование предпочтительно или необходимо, может быть получено путем проведения реакции удлиненных глицином пептидильных соединений с альфа-амидирующим ферментативным препаратом в соответствии с настоящим изобретением. Эти продукты включают в себя, но не ограничиваются этим, различные кальцитонины, факторы высвобождения гормонов роста, пептиды, связанные с геном кальцитонина, и им подобные. Гормоны, на которые здесь приводится ссылка, включают в себя разновидности амидированных на С-конце белков, которые проявляют характерную активность указанных гормонов, как это ясно сведущим в этой области специалистам. Например, кальцитонин включает все виды, которые проявляют способность регулировать усвоение кальция в костных тканях, что является характеристикой известных кальцитонинов. Любые нуклеотидные последовательности или последовательности аминокислот, заявляемые здесь, включают в себя последовательности гомологов, в которых замещения, добавления или исключения не оказывают физического влияния на функции, выполняемые указанной последовательностью. Целесообразно, чтобы, по меньшей мере, 40%, а наиболее целесообразно, чтобы 50% аминокислот соответствовали тем, что заявлены. В отношении нуклеотидной последовательности кодоны могут, конечно, быть замещены эквивалентными кодонами, кодирующими те же аминокислоты.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления, реакция альфа-амидирования может быть облегчена путем иммобилизации фермента на твердом носителе, который является нерастворимым в водной среде и стойким к разрушению в условиях реакции, и пропускания субстрата через иммобилизованный фермент, предпочтительно в присутствии кофакторов. В том смысле, как здесь используется термин "иммобилизация", он подразумевает связь фермента с подложкой или носителем. Носители, которые могут оказаться полезными для этой цели, включают в себя, но вовсе не ограничены этим, пористое стекло или активированный абсорбент, сефарозу, активированную бромцианом. Иммобилизированные таким образом ферменты могут быть многократно использованы путем удаления реакционной смеси с твердотельного носителя, который продолжает удерживать фермент для последующего использования.
Заявители открыли, что ферментативные препараты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены и очищены с помощью целого ряда способов. Установлено, что мягкая сердцевинная ткань пораженной раком (карциномой) щитовидной железы, предпочтительно полученная от крыс, клеточные линии ее и/или среда культуры клеток из указанных клеточных линий являются особенно желательными источниками исходного нативного альфа-амидирующего фермента. Загрязненный альфа-амидирующий фермент может быть очищен путем воздействия на исходную сырую композицию как хроматография исключения, так и анионобменной хроматографии, предпочтительно сильной анионобменной хроматографии. В том смысле, как здесь используется термин "сильная" анионобменная хроматография, он относится к анионобменной хроматографии, проводимой на любой смоле, которая сохраняет постоянный средний положительный заряд в диапазоне рН 2-12. В определенных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения хроматография исключения по размерам предшествует сильной анионобменной хроматографии, а хроматография исключения может предваряться другой анионобменной хроматографией. В одном предпочтительном варианте осуществления одна сильная анионобменная хроматография проводится при основном рН, тогда как другая проводится при кислотном рН.
При использовании проб фермента, очищенных до достижения однородности в соответствии с настоящим изобретением, в качестве антигена были получены моноклональные и поликлональные антитела, специфичные в отношении фермента. Антитела, полученные таким образом из любых видов, могут быть очищены и иммобилизованы на твердом носителе с целью получения колонки для проведения хроматографии по иммуносродству. Эта колонка может быть использована для очистки исходного ферментативного материала.
Фермент, очищенный в соответствии с настоящим изобретением, был подвергнут триптическому перевариванию; фрагменты были упорядочены известными способами, и полученные данные о последовательности использовались для синтеза олигонуклеотидных проб. Используя маркированные олигонуклеотидные пробы, полученные таким образом, заявители выделили ген, кодирующий альфа-амидирующий фермент из библиотеки кДНК, полученной из поли А+ РНК, извлеченной из срединной мягкой ткани карциномы щитовидной железы крысы. Этот ген, который более точно характеризован в разделе подробного описания этой заявки, может быть вставлен в соответствующий экспрессионный вектор и перенесен в любую клетку-хозяина, способную его экспрессировать. Соответствующие хозяева включают в себя, но не ограничиваются этим, E.coli дрожжевые штаммы, как S. cereviside, или клетки высших эукариотов, такие, как клеточная линия, из которой фермент был первоначально получен путем очистки. Можно ожидать, что промышленное массовое производство будет существенно облегчено созданием таких микроорганизмов.
Массовое промышленное производство ферментов может быть облегчено и с помощью методов очистки, включающих в себя как вытеснительную хроматографию, так и анионобменную хроматографию, где формы фермента, удерживаемые анионобменной хроматографической колонкой, элюируются с использованием физиологического раствора, имеющего концентрацию около 250 мМ и предпочтительно выше 350 мМ или 500 мМ. При высокой концентрации физиологического раствора даже наиболее сильноудерживаемые виды фермента будут элюированы. Хроматография исключения по размеру должна быть проведена так, чтобы отделять виды с кажущимся молекулярным весом от около 58000 до 67000 дальтон и предпочтительно от около 60000 дальтон до около 65000 дальтон. Очищенный препарат способен амидировать пептидильное соединение, которое было получено путем очистки из природных источников или получено с использованием технологий рекомбинантной ДНК, т.е. пептиды содержали L-аминокислоты.
Краткое описание чертежей
Фиг.1-4 относятся к примеру 1 и поясняют его.
Фиг.5-9 относятся к примеру 2 и поясняют его.
Фиг.10 относится к примеру 7 и поясняет его.
Фиг.11 относится к примеру 4 и поясняет его.
Подробное описание отдельных предпочтительных вариантов
Нами показано, что однородный альфа-амидирующий фермент (пептидил-глицин α-амидирующая монооксигеназа) может быть получен с помощью многоэтапного способа, использующего сочетание хроматографии исключения по размеру и ионообменной хроматографии из экстрактов твердых тканей твердых опухолей, клеточных линий опухолей и тканевой культуры из таких клеточных линий.
Фермент экстрагировали из мозговидной карциномы щитовидной железы крыс (МТС), полученной от крыс Вистар, описанных Рузом В.А. и др. (Endocrinology 1979, 150, №1, 27-32). Эта ткань депонирована как 1У1-10028. Фермент также экстрагировался и из других источников, в частности из линий клеток карциномы щитовидной железы крыс. Линия клеток (СА-77) была получена из опухолей карцином щитовидной железы крыс с помощью нескольких пассажей, как описано Мужинским и др. (JВС 1983, том 258, стр.11678-83). Эта линия клеток депонирована как 1У1-10029. Линия клеток человека (НТТ 54(34)) была разработана Рузом в медицинском центре Кливленда, штат Огайо, с использованием мозговидной карциномы щитовидной железы человека для первичной культуры. Эта линия (НТТ 54(34)) человека была депонирована в качестве экспоната 1У1-10031. (См. "Признание депозита микроорганизмов для целей патентования", свидетельствующее об этих депонентах, и "Будапештские свидетельства" №34, 3 ноября 1983, включенные в настоящее описание полностью путем ссылки).
Было показано, что определенные среды тканевых культур как от линий клеток человека, так и крыс, обладали значительными уровнями активности альфа-амидирующего фермента, указывая, что часть фермента выделена из клеток. Фермент может быть получен и очищен предварительной обработкой исходного материала анионобменной хроматографией. Проба, например, может быть помещена на препаративный анионобменник, такой, как патрон с диэтиламино этилом ("ДЕАЕ"), таким как CUNO 250, поставляемым в продажу фирмой CUNO Корп.
Удаляемая с колонки композиция, обладающая альфа-амидирующей активностью, затем подвергается обработке хроматографией исключения на смоле соответствующего разрешения, например, сверхтонкой колонке Сефакрил S-200, которая поставляется фирмой Фармация Фаин Кемикал.
Обладающая активностью выделенная фракция затем подвергается ионообменной хроматографии с использованием сильной анионобменной матрицы. Смола, которая может быть в этом случае использована, - это сильная анионобменная смола Моно Q НR5/5 фирмы Фармация Файн Кемикал, и для однородной очистки фермента может потребоваться одно или более пропускание через колонку. Колонка Моно Q HR5/5 имеет размер частиц 10 μm, объемы пор 40% и гель, заряженная группа которого СН2-N+(СН3)3, а ионообменная емкость составляет 0,28-0,36 ммоль/мл.
Каждый этап очистки может контролироваться как в отношении содержания белка, так и уровня альфа-амидирующей активности. Эта информация используется для вычисления удельной активности фермента, которая служит индикатором относительно его чистоты.
Пептидил-глицин альфа-амидирующая монооксигеназа, очищенная в соответствии с настоящим изобретением, фермент, полученный из крыс 1У1-10032; фермент, полученный от человека 1У1-10033, имеет кажущийся молекулярный вес около 60000-65000 дальтон (при определении гельфильтрацией).
Фермент был очищен так, что он проявлял удельную ферментативную активность, по меньшей мере, приблизительно 25 мЕ/мг белка и предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 50 мЕ/мг белка. Удельная активность выше около 150 мЕ/мг белка особенно целесообразна. Альфа-амидирующий фермент был также очищен так, что проявлял единственную однородную точно определенную полосу после электрофореза на SDS-PAGE.
Очищенная пептидил-глицин альфа-амидирующая монооксигеназа используется для амидирования альфа-карбоксильной группы полипептида, имеющего концевой глициновый остаток, где глицин работает в качестве донора аминогруппы. Субстрат может быть выделен путем очистки из природных источников, синтезирован из аминокислот или получен с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Полипептид с глициновым концом соединяется с кислородом в присутствии эффективного количества фремента. Количество фермента, которое требуется при этом, зависит от нескольких переменных, хорошо известных в этой области, включая в себя в частности, но не ограничиваясь ими, следующие: удельную активность данного ферментативного препарата, количество и химическую природу преобразуемого субстрата, время, в течение которого преобразование должно происходить, температуру и рН реакционной смеси. Сведущим в этой области специалистам известны другие переменные, которые могут оказать влияние на точное количество фермента, требуемого в данной ситуации. Кислород обычно присутствует в молярном избытке в реакции относительно концентрации субстрата. Требуемая концентрация ионов меди может быть обеспечена с помощью любой соли, содержащей анион, которая не оказывает вредного влияния на реакцию. Для фермента, имеющего удельную ферментативную активность только около 1 мЕ/мг белка, максимальное альфа-амидирование имеет место при относительно высокой концентрации (около 4 мМ) ионов меди. Когда чистота фермента увеличивается, требования к концентрации для экзогенного (внешнего) иона меди снижается. Ферментативная активность может быть также усилена за счет наличия аскорбатионов, которые могут быть получены с помощью любой соли аскорбиновой кислоты с катионом, который не оказывает ухудшающего воздействия на реакцию. Для очищенного фермента, имеющего удельную ферментативную активность приблизительно 50 мЕ/мг белка, максимальная активность альфа-амидирования наблюдается при концентрации аскорбата около 5 мМ. Альфа-амидирующая активность может быть увеличена путем добавления каталазы. Оптимальное значение рН для преобразования биологически соответствующего субстрата в амидированные продукты составляет от 6,5 до 7,5.
Моноклональные и поликлональные антитела, направленные против фермента, были получены иммунной реакцией с использованием однородного фермента в качестве антигена у мышей и цыплят, соответственно. Как моноклональные, так и поликлональные антитела были получены и очищены заявителями, как это показано в примере 8. Антитела, специфичные к альфа-амидирующему ферменту по изобретению, хранятся в лабораториях заявителей.
Антитела могут быть иммобилизированы на твердой матрице, нерастворимой в среде, в которой она используется. Целесообразно, чтобы матрица была стойкой к разрушению. Иммобилизация антител облегчает отделение α-амидирующего фермента из природных и/или рекомбинантных источников. Оно осуществляется путем смешивания иммобилизированных антител с исходными препаратами фермента. Антитела будут связывать только молекулы альфа-амидирующего фермента. Загрязняющие белки не соединяются с антителами и легко удаляются путем элюирования или легкого центрифугирования. После удаления загрязнений α-амидирующий фермент может быть удален с иммобилизованных антител путем изменений в ионной силе или рН или путем добавления хаотропных ионов ("Хроматография сродства: Принципы и Способы, Руководство, Фармакия Файн Уппсала, Швеция) и извлечен в высоко очищенном виде.
Фермент был также достаточно очищен, чтобы определить его аминокислотную последовательность. Эта информация использовалась для выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент.
Последующее введение данной НК в соответствующий одноклеточный организм или клетку эукариотического хозяина осуществляется с использованием стандартных способов получения рекомбинантной ДНК, например приведенных в работе Маниатис и др. (Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, Колд спринг Харбор, 1982, или By P. редактор. Способы ферментологии, том 68. Академик Пресс 1979, введена в описание путем ссылки). Полученные клетки, содержащие гетерогенную ДНК, кодирующую альфа-амидирующий фермент, обеспечивают производство достаточных количеств фермента, чтобы осуществить посттрансляционное альфа-амидирование in vitro, а также теоретически предполагают возможность их использования для осуществления этой модификации пептида или полипептида in vivo.
Хотя настоящее изобретение описывается предпочтительными вариантами его осуществления, многие изменения и модификации станут очевидны сведующим в этой области специалистам. Предпочтительные варианты осуществления изобретения далее приведены на примерах.
Сравнительные примеры
А. Сравнение испытательных систем для определения удельной активности заявляемых препаратов
Ранее уже использовалось несколько систем испытания активности. Большинство работ, указанных в известном уровне техники, использовали исследования, основанные на преобразовании D-Тир-Вал-Гли в D-Тир-Вал-амид. Это исследование является количественным и использует радиоизотопное соединение (125 I-D-Тир-Вал-Гли), которое смешано с избыточным немеченного материала (D-Тир-Вал-Гли). Измеренное преобразование меченого атома обеспечивает экстраполяцию относительно немеченного материала и это, в свою очередь, позволяет произвести расчет активности.
Хотя это исследование было использовано Заявителями, определения активности заявляемых препаратов были основаны на прямом измерении преобразования Дансил-Тир-Вал-Гли в Дан-сил-Тир-Вал-амид.
Для того чтобы обеспечить сравнение удельной активности препаратов, известных из уровня техники, с теми препаратами, которые заявляются согласно настоящему изобретению, были проведены эксперименты по сравнению систем исследования.
Экспериментальные протоколы сведены следующим образом.
I. Монодансил L-Тир-Вал-Гли
Альфа-амидирующий ферментативный препарат, выделенный из опухоли карциномы щитовидной железы крыс и из среды тканевой культуры, выделенной после культивирования СА-77, был использован в качестве источника фермента в этих экспериментах. Концентрация фермента, использованного во всех экспериментах, оставалась постоянной, за исключением тех случаев, где это указано.
Реакционная смесь для преобразования заместителя монодансила содержала
5 μл фермента
5 μл 30 мМ аскорбата
5 μл 20 мМ CuSO4
5 μл 100 μг/мл панкриатической каталазы быка
5 μл, содержащих 2 наномоля субстрата
25 μл 150 мМ ТЕS рН 7,0
Образцы были подготовлены в двух экземплярах и инкубированы при 37°С в течение 10, 20 и 30 минут. Ферментативная реакция прерывалась при добавлении 10 μл 500 мМ ЕDТА. Субстрат и продукт были разделены с использованием обратно-фазовой хроматографии на оборудовании для жидкостной хроматографии высокого давления фирмы Хюллет Паккард 1090, количественная оценка осуществлялась с использованием интегратора HP-392. Преобразование монодансил L-Тир-Вал-Гли в альфа-амидированный продукт оказалось линейным во времени.
II. 125I-D-Тир-Вал-Гли
D-Тир-Вал-Гли и D-Тир-Вал-CONH2 были иодированы с использованием иода фирмы Пирси Кемикал Компани. Меченый субстрат и продукт были использованы для калибровки катионообменной колонки с сульфил-пропилом. 125I-D-Тир-Вал-Гли добавляли к 650 μ М D-Тир-Вал-Гли и использовали в качестве субстрата. Реакционная смесь для преобразования субстрата содержала
5 μл фермента
5 μл аскорбата (30 мМ)
5 μл 100 μг/мл каталазы
5 μл 20 μM CuSO4
5 μл субстрата, 600 μМ конечной концентрации
25 μл 150 мМ ТЕS рН 7,0
Пробы были инкубированы на 10, 20 и 30 минут при 37°С. Реакция останавливалась путем добавления 500 мМ ЕДТА. Проба была разбавлена 10 мМ натрий-фосфатным буфером рН 5.2 и помещена на катионообменную колонку с сульфил-пропилом. Субстрат не присоединялся к колонке, амидированный продукт был элюирован 500 мМ NaCl. Преобразование меченого субстрата в продукт имело линейный характер во времени.
III. D-Тир-Вал-Гли
Условия реакций, использованные для амидирования D-Тир-Вал-Гли, были идентичны тем, что описаны для дансилового и иодированного субстратов. Концентрация субстрата в реакционной смеси была 650 μМ. Разделение субстрата и продукта достигалось градиентной элюацией после НРLС с обращенной фазой, использующей систему HP-1090 для жидкостной хроматографии. Вытекающая из колонки жидкость контролировалась на длине волны 280 нм. Уровень чувствительности для этого исследования значительно ниже, чем чувствительность при исследовании дансиловых или иодированных субстратов. Для того чтобы соответствовать этому более низкому уровню чувствительности, реакции альфа-амидирования осуществлялись в течение более длительных отрезков времени и/или с увеличенным количеством альфа-амидирующего фермента.
Анализ данных фракционного преобразования 125I-D-Тир-Вал-Гли в 125I-D-Тир-Вал-амид и Дансил-Тир-Вал-Гли в дансил-Тир-Вал-амид показывает, что в каждый момент времени приблизительно в 1,55 раза больше иодинированного субстрата было преобразовано, чем дансилового субстрата. Таким образом, при сравнении системы исследования, известной из уровня техники, с системой исследования с дансиловым субстратом, используемой Заявителем, уже должен быть использован коэффициент преобразования приблизительно 1,5.
Кроме того, был использован более строгий кинетический анализ для сравнения исследования с дансил-Тир-Вал-Гли (Заявителей) с исследованием D-Тир-Вал-Гли (ранее известный). Этот анализ показал:
/ранее известный/
Как можно видеть при сравнении максимальной скорости /Vмакс = пмол продукта/мин/μл/ для двух субстратов, D-Тир-Вал-Гли (ранее известный) дает приблизительно 1,48 активности дансил-Тир-Вал-Гли /Заявителя/. Это подтверждает и согласуется с указанными выше сведениями.
Б. Сравнение активности
Эйперт и др. /PNAS/ определяет на странице 5147, фиг.4, Vмакс = 39 пикомолей/микрограмм/час, что эквивалентно удельной активности 0,65 мЕ/мг белка минуту. Это наивысшая активность, о которой сообщалось ранее. При делении этой величины на вышеуказанный коэффициент преобразования, равный 1,5, получим удельную активность 0,4 мЕ/мг белка в минуту. Эта величина может непосредственно сравниваться с удельной активностью фермента, достигаемой заявителями. Заявители, как указано ранее, достигли активности, по меньшей мере, 25 мЕ/мг белка и более 1500 мЕ/мг белка. Заявители, таким образом, достигли активности в 60-3750 раз более высокой, чем активность, о которой сообщал Эйперт (РNАS).
Пример 1
Очистка и исследование альфа-амидирующих ферментов, полученных из опухоли МТС крыс
Замороженную ткань опухоли МТС крыс измельчали и гомогенизировали в водном буфере, используя гомогенизатор Политрон. После низкоскоростного центрифугирования супернатант был слит, а осадок был повторно экстрагирован с помощью свежего буфера. Этот второй гомогенат вновь был подвергнут низкоскоростному центрифугированию и новый супернатант был соединен с первым. Два собранных и соединенных супернатанта были затем осветлены с помощью высокоскоростного центрифугирования, и полученный при этом супернатант был использован в качестве исходного материала для очистки фермента.
Было проведено фракционирование этого полученного при высокоскоростном центрифугировании супернатанта аммоний сульфатом. Было установлено, что большая часть активности фермента оседала во фракции 26-40% сульфата аммония, осадок из той фракции был очищен дополнительно, как описано ниже.
Была проведена хроматография на колонке Сефакрил S-300. При этих условиях элюирования наблюдался основной пик активности, но за ним следовал небольшой дополнительный пик, который мог бы соответствовать ферменту с более низким молекулярным весом. Возникает вопрос, существует ли фермент с низким молекулярным весом in vivo или образуется за счет частичного протеолитического переваривания во время экстрагирования и очистки.
Основной пик активности с колонки S-300 был разделен с помощью хроматографии на колонке Моно Q при рН 6,0. Элюирование осуществлялось с использованием некрутого линейного солевого градиента. Было обнаружено четыре пика альфа-амидирующей активности фермента, при элюировании NаСl 160 мМ, 200 мМ, 220 мМ и 240 мМ. (Пики I, II, III и IV, соответственно, фиг.1). Это показывает, что существует множество форм фермента и что эти формы обладают определенной неоднородностью. Анализ белков из пиков активности фермента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле показывает, что пики II, III и IV включают альфа-амидирующий фермент с приблизительным молекулярным весом одного порядка (73000-75000 Дальтон), тогда как пик I содержит фермент отличного, возможно, меньшего молекулярного веса. Активность пика III была пересчитана на однородное вещество следующим образом.
Фермент пика III был собран и подвергнут хроматографической обработке на колонке Моно Q HR, 10/10 при рН 8.0 (фиг.2). Фермент, элюированный с этой колонки в виде единственного пика при 250 мМ NаСl, как показал анализ в геле, был очищен до однородного состояния (фиг.3а, полоска 6). Следующие экспериментальные исследования были проведены на очищенном ферменте пика III.
1. Молекулярный вес фермента пика III был определен с помощью анализа на 7% полиакриламидном геле и составлял около 75000 Дальтон (фиг.3в).
2. Оптимальная величина рН для активности фермента составила 5.0-5.5 при использовании N дансил Тир-Вал-Гли в качестве субстрата (фиг.4). Однако, благодаря повышенной устойчивости фермента при нейтральном рН, может оказаться успешным осуществление реакции амидирования и при таком рН.
3. Определено, что количество меди, необходимой в качестве кофактора для активности фермента, было обратно пропорционально чистоте фермента. Очищенный до однородного состояния фермент требовал 0,1 μМ (или менее) Сu++ для максимальной активности, тогда как исходные препараты фермента требовали 2 μM Cu++.
4. Изоэлектрическая точка (рI) фермента составляла 4,8.
5. Удельная активность гомогенного (однородного) фермента пика III составляла 2,100 мЕ/мг белка.
Фермент пика II был также очищен до однородного состояния. Однако для этого фермента оказалось, что хроматография на Моно Q при рН 8.0 была недостаточной для получения однородного препарата. Поэтому фермент пика II после колонки Моно Q, рН 6.0 (фиг.1) был отдиализован против 1 М Трис рН 7.0 и загружен на колонку с фенил-сефарозой, уравновешенную таким же буфером. Большая часть загрязняющих белковых примесей удалялась пропусканием через колонку, а амидирующий фермент, элюируемый на последней стадии, был по существу чистым. Дополнительная очистка фермента, собранного с колонки с фенил-сефарозой, на колонке Моно Q, НR 10/10 рН 8.0 привела к получению гомогенного препарата фермента пика II, элюирующего из колонки при 220 мМ NаСl и выше.
Исследование фермента пика II показало, что
1. Молекулярный вес фермента пика II при электрофорезе с использованием 7% полиакриламидного геля составлял около 73000-75000 Дальтон. Таким образом, ферменты пиков II и III были неотличимы при сравнении их молекулярных масс.
2. Оптимальное значение рН для активности фермента пика II составляло 5.0-5.5. И вновь, эта характеристика фермента пика II является такой же, что и для фермента пика III.
3. Изоэлектрическая точка (рI) пика II была приблизительно 5,8.
Пример 2
Очистка и исследование альфа-амидирующего фермента, полученного из среды тканевой культуры клеток СА-77
Клеточные линии СА-77 карциномы щитовидной железы крыс были выращены в виде монослоя при наличии 8% СО2. Культура выдерживалась в определенной среде, состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла: F - 10(1:1), 3,7 г/литр NаНСО3, 5 μг/мл трансферрина, 10 μг/мл инсулина, 30 нМ селена, 4 μг/мл пентамицин сульфата. Культуры, выращенные таким образом, могли храниться неограниченное время, если среда заменялась каждые 48 часов. Для стимуляции наращивания клеток, они были предварительно дополнительно культивированы и выращены в среде, содержащей сыворотку крови (5% лошадиной и 2,5 фетальной телячьей), в течение трех дней. Клетки были затем промыты дважды физиологическим раствором с фосфатным буфером с последующей заменой указанной средой.
Среда тканевой культуры была собрана с соблюдением асептики по 48-часовой программе и хранилась при -20°С до очистки. Культуральная среда (обычно 6 литров) была разбавлена 2 литрами деионизированной воды (3:1) и подана при расходе 50 мл/мин на анионобменный патрон (Куно №250), который был предварительно уравновешен 1,0 литром 20 мМ бис Трис: НСl рН 6,0 при температуре 4°С. Альфа-амидирующий фермент ("альфа-АЕ") был элюирован ступенчато с помощью 50 мМ Трис НСl рН 7,0, содержащего 500 мМ NaCl при расходе приблизительно 50 мл/мин. Фракции, обладающие активностью альфа-АЕ (удельная активность 10-15 мЕ/мг), из двух полученных с использованием анионообменника препаратов были собраны и концентрированы 4-5-кратно при пониженном давлении с использованием ротора предварительной обработки Савант RH-100.
Этот материал вводился непосредственно в колонку 5×50 см с Сефакрил 300 - SF (Фармацея). Подвижная фаза представляла собой 100 мМ Трис: НСl рН 7,0 с расходом 1.0 мл/мин. Вся гель-фильтрационная хроматография была осуществлена при 4°С (фиг.5).
Препарат амидирующего фермента на этой стадии очистки свободен от неспецифической протеолитической активности и имеет активность, по меньшей мере, 50 мЕ/мг белка. Препарат амидирующего фермента, полученный на этом этапе, был использован успешно для амидирования рекомбинантного удлиненного глицином человеческого кальцитонина и фактора высвобождения гормона роста. Начиная с плотности клеток 1-1,5×106 клеток/мл, мы постепенно получили выход 200-350 мЕ активности амидирующего фермента/литр среды, проходящей эти два этапа очистки. Фермент устойчив и пригоден для использования в растворе или после иммобилизации его на твердой подложке.
Объединенные фракции колонки, содержащие активный альфа-АЕ, были диализованы против 6 литров 20 мМ бис Трис: НСl рН 6.0. Диализат был введен в колонку для сильной анионобменной хроматографии Моно Q НR 10/10, предварительно уравновешенную 20 мМ бис ТРис: НСl рН 6.0. Фермент был элюирован с колонки с использованием линейного градиента 0-300 мМ NаСl за три часа при расходе 2,5 мл/мин. Четыре хроматографически различимые формы альфа-амидирующего фермента были разделены на этих трех этапах. Пики были пронумерованы в порядке элюирования с колонки (фиг.6). Пики III и IV представляют формы с более высокими молекулярными весами ферментов и соответствуют пикам II и III, полученным из опухолей МТС. Пики I и II представляют собой формы с более низкими молекулярными весами ферментов, которые могут быть протеолитическими фрагментами пиков III и IV.
Четыре формы альфа-амидирующего фермента, идентифицированных в лаборатории, отличаются друг от друга их средним поверхностным зарядом, что доказывается их различными временами удержания в ходе сильной анионобменной хроматографии (фиг.6). Оптимальные значения рН для этих четырех хроматографически отличных форм фермента также различны. Результаты, приведенные на фиг.7, показывают, что пики III и IV имеют идентичное значение оптимума рН между 5.0 и 5.5. Эти результаты согласуются с оптимумом рН, определенным для пиков II и III, полученных выделением и очисткой из опухоли МТС. Пики I и II имеют более широкий диапазон активности с оптимумом рН от 5 до 8.5 (фиг.7). Эти результаты согласуются с оптимумом рН, о котором сообщали Эйперт и др. (Peptides 4, 921-28, 1983) и Марти и др. (Biochemistry 261, 1815-22, 1986).
Мечение фермента из пиков II и IV изотопом Nа125I и последующий электрофорез в SDS-PAGE подтвердил, что активность фермента пика IV характеризуется приблизительной молекулярной массой 73-75 кД, тогда как активность фермента пика II имела молекулярную массу ниже 55 кД. Точный молекулярный вес для фермента из пика II неизвестен, поскольку он не был очищен до однородного состояния (несколько белковых линий проявляются в диапазоне 45-55 кД).
Ферменты пиков III и IV могут быть очищены до однородного состояния с использованием сочетания гидрофобной и сильной анионобменной хроматографии при рН 8.0. Фермент пика IV (фиг.6) был собран, концентрирован до приблизительно 2 мл in vacuo и непосредственно введен в колонку 1,3×8 см с фенилсефарозой (Фармация), уравновешенную 500 мМ Трис: НСl рН 7.0. Фракции, обладающие активностью альфа-АЕ, были элюированы уравновешивающим буфером при расходе 0,5 мл/мин (фиг.8). Фракции пиков, обладающих альфа-амидирующей активностью, были собраны, отдиализованы против 50 мМ Трис: НСl рН 8.0, а затем введены в колонку Моно Q HR 10/10, уравновешенную 50 мМ Трис: НСl рН 8.0. Фермент был элюирован с использованием линейного градиента 0-300 мМ NaCl в течение трех часов при расходе 2,0 мл/мин (фиг.9). Фракции, обладающие альфа-АЕ активностью, элюированные при 240 мМ или выше, были собраны, доведены до содержания 0,001% (в объемном отношении) в Тритон Х-100 и хранились при 4°С. Удельная активность очищенного фермента составляла по результатам измерений приблизительно 1500 мЕ/мг белка при рН 7,0. Пик III α-амидирующей активности очищен до гомогенного состояния с использованием таких же операций, что описаны для пика IV.
Физико-химические характеристики фермента опухолевого пика (из примера 1) и фермента пика IV тканевой культуры (из примера 2), включающие молекулярную массу (73000-75000 Дальтон), оптимум рН (5.0-5.5), последовательность аминоконцов и условия элюирования (более чем 240 мМ натрий хлорида при сильной анионобменной хроматографии, проводимой при рН 8.0) показали, что эти два пика могут представлять один и тот же фермент.
Пример 3
Альфа-амидирование биологически релевантных пептидных гормонов с использованием альфа-амидирующего фермента
Несколько субстратов, представляющих собой рекомбинантные пептиды, включая те, что предназначены для лососевого и человечьего кальцитонина, фактора высвобождения гормона роста человека и пептида, связанного с геном кальцитонина человека, были получены и успешно альфа-амидированы препаратом альфа-амидирующего фермента согласно настоящему изобретению. Для целей иллюстрации ниже приведены процедуры, использованные для производства активного рекомбинантного кальцитонина лосося, пептида, связанного с геном кальцитонина, и фактора высвобождения гормона роста человека.
Такие же подходы к решению задачи могут быть использованы для других рекомбинантных пептидов.
Кальцитонин лососевых представляет собой 32-членный пептидный гормон, имеющий альфа-амидированный пролиновый остаток у его карбоксильного конца. С помощью генной инженерии были созданы микроорганизмы для получения рекомбинантного слитого белка, который содержал аминокислотную последовательность, соответствующую кальцитонину лосося. Ген слитого белка был сконструирован так, чтобы последовательность лососевого кальцитонина была заключена между метиониновым остатком на аминоконце и глициновым остатком на С-конце, который также оканчивал весь рекомбинантный слитый белок. После связывания гена кальцитонина лосося в плазмиду микроорганизм был трансформирован с помощью этой плазмиды и была достигнута экспрессия слитого белка. Этот кальцитонинсодержащий белок был выделен из лизата рекомбинантного микроорганизма путем осаждения и его цистеиновый остаток преобразован в S-сульфонаты. Поскольку лососевый кальцитонин не содержит метионина, цианоген-бромидное расщепление рекомбинантного слитого белка приводило к созданию пептида, содержащего последовательность лососевого кальцитонина с глициновым продолжением карбоксильного конца. Этот пептид был выделен с помощью или жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой, или ионобменной хроматографии, и его структура была установлена с помощью аминокислотного состава и анализа микропоследовательностей.
Предпоследний пролиновый остаток был преобразован в пролинамид под действием альфа-амидирующего фермента. Пример условий, использованных для альфа-амидирования этого пептида, приведен ниже. Лиофилизированный пептидный субстрат (удлиненный глицином предшественник кальцитонина лосося 200-300 наномолей) был разведен в 200 мл буфером 150 мМ Трис: НСl рН 7,0, содержащим приблизительно 750 uE альфа-амидирующего фермента. Фермент мог быть извлечен или из опухоли МТС, или из среды культуры ткани клеточной линии крыс МТС СА-77. Фермент должен быть очищен в такой степени, чтобы вся примесная протеолитическая активность была устранена. Аскорбиновая кислота и сульфат меди были затем добавлены в эту смесь в количествах, достаточных чтобы обеспечить конечные концентрации приблизительно 3 мМ и 2 μМ, соответственно. Каталаза (7,5 г/мл), этанол (1% по объему) и йодид калия могут быть введены в реакционную смесь, чтобы повысить выход кальцитонина. Полученный раствор был смешан и инкубирован при 37°C в течение 5-6 часов.
После удаления S-сульфонатных групп с помощью бета-меркаптоэтаноловой обработки, рекомбинантный лососевый кальцитонин был очищен с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой. Конечный продукт был охарактеризован его удержанием в процессе жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой, количественным распределением триптического перевара и аминокислотным анализом. Во всех примерах рекомбинантный кальцитонин лосося не отличался от синтетического кальцитонина лосося.
Человеческий пептид, связанный с геном кальцитонина, представляет собой 37-членный гормон, имеющий альфа-амидированный фенилаланиновый остаток у его карбоксильного конца. Был сконструирован ген слитого белка, аналогичный гену кальцитонина лосося (см. выше) в том отношении, последовательность пептида была заключена между метиониновым остатком и глициновым остатком, который также оканчивал рекомбинантный слитый белок. Освобождение, очистка, альфа-амидирование и исследование рекомбинантного предшественника пептида, связанного с геном кальцитонина человека, были осуществлены аналогично тому, как было это сделано в связи с рекомбинантным кальцитонином лосося.
Фактор высвобождения гормона роста человека (hGHRF) - это 44-членный пептидный гормон, имеющий альфа-амидированный лейциновый остаток у его карбоксильного конца. Ген слитого белка для hGНRF был сконструирован так, что аминокислотная последовательность для пептидного гормона была заключена между триптофановым остатком на его аминоконце и глициновым остатком у его карбоксильного конца, который также оканчивал рекомбинантный слитый белок. Содержащий hGНRF слитый белок был выделен из лизата рекомбинантного микроорганизма путем осаждения. Не содержащая hGНRF часть слитого белка была денатурирована путем преобразования цистеиновых остатков в S-сульфонат-производные. Поскольку hGНRF не содержит триптофан, химическое переваривание рекомбинантного искусственного белка реактивным BNPS-скатолом вызывало окислительное расщепление слитого белка, в результате чего образовался неадимированный hGНRF с глициновым удлинением карбоксильного конца. Одновременно метиониновый остаток в позиции 27 в молекуле hGНRF был окислен до метионин-сульфоксида. Этот удлиненный глицином пептид был выделен с использованием гель-фильтрации и жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Его структура была установлена с помощью аминокислотного анализа пептидных фрагментов, полученных посредством трипсинового переваривания.
Предпоследний лейциновый остаток был преобразован в лейцинамид под действием альфа-амидирующего фермента согласно настоящему изобретению. Пример условий, использованных для получения альфа-амидированного hGНRF, приводится ниже. Лиофилизированный пептидный субстрат (20-40 наномолей) был разбавлен в 150 μл деионизированной воды и смешан с 90 μл (500 μE) (рН 7.0) препарата альфа-амидирующего фермента из опухоли МТС или культуральной среды клеточной линии СА-77 крыс. Фермент был очищен до полного удаления всех видов примесной протеолитической активности путем использования гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Аскорбиновая кислота и сульфат меди были добавлены в эту смесь фермента и субстрата в количествах достаточных, чтобы конечная концентрация составляла 3 μМ и 2 μМ, соответственно. Полученный раствор был перемешан и инкубирован при 37°С в течение 4-6 часов. Обычный процент преобразования субстрата в продукт составляет 95% в пересчете на аминокислотный анализ фрагментов, выделенных при переваривании трипсином. Наконец, метионил-сульфоксидный остаток был восстановлен до метионина 4 М бетамеркаптоэтанолом, забуференным при рН 4 10 мМ натрий-ацетатом, при 80°С в течение одного часа. Конечный продукт был очищен с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой и исследован по времени удержания, анализом переваривания трипсином и аминокислотным анализом. Рекомбинантный альфа-амидированный продукт был также испытан в отношении биологической активности. Во всех примерах рекомбинантный hGНRF был не отличим от синтетического hGНRF.
Помимо вышеприведенных примеров, еще два промышленно важных пептидных гормона, удлиненных глицином, были оценены в отношении их способности использоваться в качестве субстрата альфа-амидирующего фермента. Эти материалы являлись предшественниками альфа-меланоцит стимулирующего гормона и субстанции Р. В обоих случаях результаты показывают, что оба пептида являются пригодными субстратами для альфа-амидирующего фермента по изобретению.
Пример 4
Анализ последовательностей очищенного альфа-амидирующего фермента, Фракции, содержащие очищенный альфа-амидирующий фермент, были получены или из опухолевой ткани МТС крыс, или супернатантов клеточной культуры СА-77; сульфгидрильные группы фермента были подвергнуты восстановлению, за которым последовало карбоксиметилирование. Полученная реакционная смесь была затем введена в колонку для жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (размер частиц 5 μм, размер пор 33 нм), которая была уравновешена 0,1% водным раствором трифторуксусной кислоты. Колонка была промыта этим раствором для удаления избыточных буферных солей. Обессоленный фермент был удален с колонки путем элюирования с помощью 80% ацетонитрила, содержащего 0,08% трифторуксусной кислоты. Вытекающий поток (эффлюент) колонки контролировался по УФ излучению при длине волны 220 нм. Полученные белковые фракции были собраны, объединены и лиофилизованы. Этот материал был затем повторно разбавлен в 100 мл 0,1% SDS и затем введен в устройство для исследования последовательности белка (Апплайд Виосистемс модель 470А). Операции, используемые для анализа микропоследовательностей, осуществлялись так, как указано изготовителем. Полученные фенилтиогидрантоиновые аминокислоты анализировались с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Гиперсил С18 (размер частиц 5 μм, размер пор 10 нм) с контролем поглощения на длинах волн 269 нм и 313 нм на системе жидкостной хроматографии Хьюллет Паккард 1090. Амино-концевая последовательность для основного составляющего пика фермента (пик 111) из опухолевой ткани была следующей
Аминоконцевая последовательность для основного компонента фермента (пик IV) из супернатанта культуры тканей клеток СА-77 показывает, что она идентична той, что имеет место для фермента тканей опухоли (пик III). Однако, небольшая компонента была также обнаружена во время анализа микропоследовательностей этого фермента, которая, по-видимому, содержит продолжение аминоконца при сравнении с основной формой альфа-амидирующего фермента. Наличие этой компоненты, вероятно, обусловлено различием посттрансляционной обработки фермента. Последовательность аминоконца этой компоненты была следующей:
Дополнительные данные об аминокислотной последовательности были получены для альфа-амидирующего фермента из опухолевой ткани МТС крыс с помощью следующих операций. Приблизительно 400 μг очищенного фермента было подвергнуто восстановлению и карбоксиметилированию. После этой процедуры раствор фермента был перенесен для экструзионного диализа, и диализ провели в течение 18 часов на 25 мМ Трис-НСl рН 8.0/0,5М мочевины. Осадок затем было пересен в 1,5 мл центрифужную пробирку и концентрирован до объема 600 μл при пониженном давлении. К раствору фермента добавили 2 μл (2 μг) трипсина и смесь инкубировали один час при температуре 37°С. В этот момент добавили вторую дозу трипсина (2 μг) и продолжали инкубацию еще два часа при 37°С. Переваривание оканчивали путем добавления 200 μл 4М мочевины /10% уксусной кислоты. Продукт переваривания был затем введен в хроматографическую колонку для жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (размер частиц 5 μм, размер пор 33 нм), которая была уравновешена 0,10% водным раствором трифторуксусной кислоты. Колонка была затем элюирована линейным градиентом ацетонитрила до концентрации 50% в течение четырех часов, и фракции собирались с двухминутным интервалом. Полученные пики элюции жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой для продукта триптического переваривания фермента графически изображены на фиг.11. Три полученных с использованием трипсина пептида прошли автоматизированный анализ последовательностей, описанный выше, и полученные результаты приводятся ниже. (Пептиды обозначены их номером фракции).
Триптический пептид №65
-Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-Gln-Pro-Thr-
Триптический пептид №58
-Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg-
Триптический пептид №86
-Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Cly-Clu-
Пример 5
Молекулярное клонирование последовательности ДНК, кодирующей альфа-амидирующий фермент мозговидной карциномы щитовидной железы крысы или клеток СА-77.
Прежде всего, необходимо найти надежный источник ферментного протеина, который в свою очередь может быть источником информационной РНК /мРНК/ и в конечном счете - комплементарной ДНК /кДНК/. Изолирование гена фермента или кДНК также требует молекулярной пробы, специфичной по отношению к рассматриваемому ферменту. Обычно эта молекулярная проба принимает одну из двух форм; она представляет собой либо олигонуклеотид, чья последовательность является комплементарной к части гена, кодирующего фермент, либо молекулу антитела /или коллекцию молекул антител/, которая специфично распознает белок фермента. Получение таких молекулярных проб требует разработки такого метода очистки фермента, чтобы могли быть получены специфичные антитела фермента или могли бы быть определены аминокислотные последовательности фермента для последующего конструирования олигонуклеотидных проб. Эти условия были выполнены для альфа-амидирующего фермента согласно настоящей заявке.
Альфа-амидирующий фермент был очищен из ткани мозговидной карциномы щитовидной железы крысы и из кондиционирования среды СА-77 клеток крысы. Это указывало на то, что эти источники будут содержать кодирующую фермент мРНК. Методы, которые мы использовали для приготовления кДНК альфа-амидирующего фермента, хорошо известны в области молекулярной биологии. Специальные протоколы для этих различных методов могут быть найдены в лабораторных руководствах, таких как Molecular Cloning /1982/, DNA Cloning /V.1/ a Practical Approach /1985/ или первоисточниках, таких как Гублер В. и Гоффман В.Дж. (gene 25, 262-69 /1983/; или Янг Р.А. и Дэвис Р.В. (PNAS, 80, 1194-98, /1983/). Эти процедуры имеют общую применимость с критической переменной, которой является источник используемой мРНК. Для приготовления специфичной кДНК амидирующего фермента мы использовали мРНК ткани мозговидной карциномы щитовидной железы крысы и мРНК клеток СА-77. Образцы двухнитевой кДНК, которые были синтезированы, в свою очередь использовались для приготовления отдельных генных библиотек при помощи хорошо известных процедур.
Как описано выше, идентификация определенных кДНК для мРНК альфа-амидирующего фермента требует наличия молекулярных проб, которые могут различить эти формы от других форм определенной библиотеки. Примеры 1 и 2 детализируют методы очистки, использованные при приготовлении фермента, необходимого для создания молекулярных проб. Пример 4 описывает использование этого протеина для определения аминокислотных последовательностей, в то время как пример 6 описывает использование очищенного протеина для приготовления специфичных антител фермента.
Аминокислотные последовательности примера 4 достаточны для получения специфических селективных олигонуклеотидных проб. При приготовлении олигонуклеотидных проб несколько факторов являются особо важными для того, чтобы сделать их селективными. Полное описание этих рассуждений может быть найдено в Лазе Р.Дж. (Y. Mol. Biol., 183, 1-12, /1985/). Поскольку обычно одну и ту же аминокислотную последовательность можно кодировать более чем одной нуклеотидной последовательностью /принцип, известный как дегенерация генетического кода/, любая единственная нуклеотидная последовательность будет представлять только одну из ряда потенциальных генетических последовательностей. Для того чтобы гарантировать, что олигонуклеотидная проба будет идентифицировать интересующий ген, можно приготовить эквимолярную смесь всех возможных последовательностей, которые могут кодировать специфическую последовательность аминокислот амидирующего фермента. Сложность таких смесей часто делает их не абсолютно селективными, и поэтому, для получения абсолютно специфичной селективности для заданного гена должны быть использованы олигонуклеотидные смеси для более чем одной области аминокислотной последовательности.
Альтернативная возможность состоит в том, что олигонуклеотид, селективный для интересующего гена, может быть приготовлен посредством создания уникальной нуклеотидной последовательности достаточной длины, которая даже будучи неполностью комплементарна желаемому гену, ведет к образованию стабильного гибрида. Эта уникальная последовательность будет иметь очень маленькую вероятность формирования стабильного гибрида с другими генными последовательностями. Уникальная последовательность составляется из наиболее часто используемого кодона для каждой аминокислоты белковой последовательности. Частота использования кодона для заданных образцов может быть определена из компилляции известных генных последовательностей и соответствующих аминокислотных последовательностей для образцов протеинов. Эти методы хорошо известны специалистам по молекулярной биологии.
Еще один подход, который может быть использован для приготовления специфичных олигонуклеотидных проб, предполагает включение дезоксиинозиновых остатков в олигонуклеотид в позициях максимальной дегенерации. Эта нуклеотидная замена служит для уменьшения дегенерации образца пробы и, таким образом, может иметь благоприятное воздействие на процесс селекции. /Использование деокси инозина в олигонуклеотидной пробе смотри в Отсука и др. Y. Biol., Chem., 260, 2605-08 /1985/.
Мы использовали последовательности белка альфа-амидирующего фермента для проектирования множества олигонуклеотидных проб, пригодных для изоляции кДНК амидирующего фермента. Использованные последовательности и приготовленные нами пробы показаны в таблице 2. Следует отметить, что при знании аминокислотных последовательностей для изоляции гена посредством гибридизации пробы специалистом по молекулярной биологии могут быть использованы и альтернативные стратегии.
Полученные таким образом олигонуклеотидные пробы были использованы в соответствии с известными методами (смотри Molecular Cloning, 1982/ для скрининга плазмидной и фаговой библиотек кДНК и для изоляции кДНК альфа-амидирующего фермента.
Таблица 1 иллюстрирует все возможные генные последовательности, соответствующие выбранным областям молекулы альфа-амидирующего фермента. Ниже спроектированных последовательностей показаны некоторые из дополнительных олигонуклеотидных проб, которые полезны для идентификации и изоляции к ДНК (см. в конце текста).
Пример 6
А. Получение мышиных моноклональных антител, специфичных для альфа-амидирующего фермента
Двенадцать мышей Ваlb/сJ были иммунизированы и реиммунизированы очищенными препаратами амидирующего фермента. У этих мышей была взята кровь, и сыворотка была обработана и оттитрована против очищенного фермента. Исследование было осуществлено посредством абсорбирования очищенного фермента на полистироловую пластину, которая затем была промыта и блокирована /для предотвращения постороннего прилипания антител к пластине/ бычьим сывороточным альбумином /BSA/. Разбавленная мышиная сыворотка /предпочтительно содержащая антитела против амидирующего фермента/ была затем инкубирована на покрытой амидирующим ферментом пластине и промыта. Вторичное антитело, помеченное маркером, щелочной фосфатазой, которая облегчает фиксацию связывания первого антитела с нанесенным на пластину ферментом, было затем инкубировано в ячейках. После промывания и добавления раствора субстрата сигнал был калориметрически измерен с помощью спектрофотометрического записывающего устройства. "Положительные" сыворотки показали отношение сигнала к шуму, по меньшей мере, 2:1.
Мышь №7, которая показала более высокий титр в ELISA-тесте, была умерщвлена через четыре дня после окончательной реиммунизации. Селезенка была асептически удалена и измельчена с получением 132,6×106 клеток селезенки, которые были слиты с 122,8×106 клеток миеломы NS-1 при помощи 1,28 Mls PEG /полиэтиленгликоль/ 4000. Клетки были разделены на пять 24-ячеистых пластин, которые заранее были покрыты тимоцитами и спленоцитами Balb/cJ, которые служили в качестве питающих клеток. Клетки содержались в селективной среде HAT, которая допускает выживание только гибридных клеток.
Супернатанты из 116 ячеек, которые показали клональный рост, были скринированы с помощью радиоиммунной пробы и метода ЕLISА для получения антител. Процедура радиоиммунной пробы была аналогична ELISA-пробе, описанной ранее, за исключением того, что второе антитело было помечено с помощью I125, и радиоактивный счет был измерен с помощью гамма-счетчика.
Пятьдесят шесть из 116 ячеек имели положительный результат на получение антитела и были скринированы на реактивность по отношению к альфа-амидирующему ферменту. Двадцать пять клонов, которые оказались положительными на альфа-амидирующие ферменты, были клонированы при помощи процесса последовательного разбавления. Первичные клоны были скринированы против альфа-амидирующего фермента и BSA /поскольку полистироловые пластины были блокированы с помощью BSA, антитела, которые оказались связаны с пластиной, вероятно, просто приклеились или были абсорбированы BSA - неспецифичным образом/ для определения, действительно ли они специфичны для амидирующего фермента. Клоны, которые показали сигнал на альфа-амидирующий фермент и который был, по меньшей мере, удвоен по сравнению с демонстрируемым для BSА, были клонированы с соотношением распределения 1 клетка/ 2 ячейки.
Двадцать одна положительная гибридома /см. таблицу 2/ была перенесена на стадию третичного клонирования, и двадцать из них характеризовались по отношению к классу антитела при помощи приемов. Ouchternoly и ЕLISA. Семнадцать клонов имело тяжелые цепи lg G2a и три имели тяжелые цепи lgG1. Все двадцать клонов дали отпечатки с каппа легкими цепями.
Каждая линия были индивидуально выращена в массовой культуре, и аликвоты клеток были заморожены в жидком азоте. Мышам Balb/cJ была сделана инъекция интраперитониально клеток гибридомы (5×106). Неделей позднее мышам, у которых не появились асцитные опухоли, была сделана усиленная инъекция клеток. Асцитная жидкость и кровь были удалены 1-2 неделями позднее. После обработки асциты и сыворотки были скринированы и оттитрованы против альфа-амидирующего фермента, а также против отрицательных антигенов /например, BSA, яичного белка, карбоновой ангидразы и фактора высвобождения гормона роста/ для обеспечения специфичности антитела.
Многоклональные линии клеток альфа-амидирующего фермента мышей Balb/c
В. Процедура очистки для моноклональных антител, продуцированных в мышах
Моноклональные антитела, специфичные для альфа-амидирующего фермента, приготовленные описанными выше методами, очищались следующим образом. Асцитная жидкость, собранная от нескольких мышей, привитых тем же самым клоном, была использована в качестве источника антитела. Асцитная жидкость была разбавлена /5-кратно/ 10 мМ MES рН 5,6. Разбавленная асцитная жидкость была помещена в 1,5×20 см колонку, содержащую 40 μм, АВХ-смешанной кремниевой смолы /Дж.Т.Бэйкер/, предварительно уравновешенной 10 мМ МЕS рН 5,6 буфером. Моноклональные антитела были элюированы с колонки с использованием 0-500 мМ градиента ацетата натрия рН 7,0. Фракции, содержащие очищенные антитела, были объединены, тестированы на удельную активность и помещены на хранение при 4°С до последующего использования.
С. Получение поликлональных антител, специфичных для альфа-амидирующего фермента, у цыплят.
Внутривенные, внутримышечные и подкожные инъекции были сделаны двум цыплятам (суммарно приблизительно 50 мг очищенного альфа-амидирующего фермента в Ribi адъюванте на каждого цыпленка). Ribi адъювант представляет собой полностью метаболизированную жировую эмульсионную систему, которая состоит из митогена для лимфоцитов цыпленка и адъюванта для усиления реакции антитела на антигены у домашней птицы /Ribi иммунохимическое исследование, Монтажа/. После начальной иммунизации были сделаны две усиленные инъекции с двухнедельным интервалом (приблизительно 50 мг фермента на цыпленка). У животных была взята кровь приблизительно на 21 день и 35 день, и сыворотки были обработаны и исследованы на присутствие специфических антител с помощью следующей процедуры: сыворотки от обоих цыплят, день 0 /преиммунный/, день 21 и день 35 были экранированы твердофазным ELISA-методом против 100 ng очищенного альфа-амидирующего фермента. BSA был использован в качестве отрицательного контроля для неспецифичного прилипания антител. Фермент-специфичное антитело было детектировано кроличьей маркировочной щелочной фосфатазной сывороткой против JgG цыпленка.
Результаты описанных выше процедур продемонстрировали, что специфичные антитела могут быть обнаружены в сыворотках цыпленка 257 на 35 день. Разбавленная 1-10.000 сыворотка дала отношение сигнала к шуму приблизительно 4:1. Цыпленок 258 показал фермент-специфичные антитела на 21 день и 35 день. Для обеих проб крови, разбавленная 1:10.000 сыворотка дала отношение сигнала к шуму приблизительно 4:1. Сбор яиц от обеих куриц начался на 56 день. Изолированный полиэтиленгликолем /PEG/ IgY из преиммуннизированных яиц и из постиммунизированных яиц был проанализирован с помощью приемов Ouchterlony, а фермент-специфичные антитела были скринированы с помощью ELISA-пробы.
Д. Очистка цыплячьих lgY-антител
Поликлональные птичьи антитела, специфичные для альфа-амидизирующего фермента, были выработаны у цыплят, как описано выше. Яйца от иммунизированных цыплят были собраны и либо погружены в парафин, либо заморожены до использования для очистки lgY. Белки яиц были отделены от желтков, которые содержат специфические антитела для альфа-амидирующего фермента. Яичные желтки были разбавлены трехкратно с использованием 10 мМ фосфата натрия рН 7,5, содержащего 0,1М NaCl и 0,01% азида. Начальная ступень осаждения РЕG была осуществлена с использованием 3,5% от окончательной концентрации РЕG8000. Осаждение происходило в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим центрифугированием, и был оставлен супернатант /содержащий lgY/. К супернатанту был добавлен дополнительный полиэтиленгликоль для получения конечной концентрации 12,5%, PEG lqY антитела, осажденные при такой концентрации и полиэтиленгликоля, были отделены при помощи центрифугирования. lgY антитела этой стадии очистки очищались дальше с помощью двух методов:
1/. Осажденные lgY антитела были повторно суспендированы к 10 мМ MES pH 5,6, затем подвергнуты диализу в течение ночи при 4°С против того же самого буфера. Образец был затем помещен в 1,5×20 см колонку, содержащую 40 μм АВХ смешанной кремниевой смолы /Дж.Т.Бейкер/. Протокол последующей очистки был аналогичен описанному для асцитной жидкости.
2/. Альтернативно, осадок, содержащий lgY, был повторно суспендирован в начальном буфере и затем вновь осажден с использованием насыщенного сульфата аммония /3:1 V/V/.
Осадок, содержащий lgY, был повторно суспендирован в небольшом объеме дистиллированной Н2О и помещен на хранение при 4°С до дальнейшего использования. Процедура иммобилизации для lgY цыплят описана в примере 10.
Пример 7
Изоляция последовательности ДНК, кодирующей пик III α-амидирующего фермента
Приготовление РНК:
Тотальная РНК была приготовлена из ткани мозговидной карциномы щитовидной железы крысы с использованием гуанидин-тиоцианатной процедуры. Поли А+ РНК была выделена с помощью олиго d Т целлюлозы.
Синтез кДНК:
Двунитевая кДНК были приготовлена при помощи хорошо известных методов. Используя поли А РНК из ткани мозговидной карциномы щитовидной железы крысы в качестве матрицы и олиго dТ12-18 в качестве затравки, синтез первой нити был осуществлен ферментивной реакцией с обратной транскриптазой. кДНК и РНК были отделены и РНК разрушена с помощью щелочи. Синтез второй нити кДНК был самозатравлен с использованием ДНК полимеразы 1 E.coli. Переваривание нуклеазой S1 было использовано для удаления шпилечных петель в кДНК и для расщепления любых однонитевых областей кДНК. После реакции с ДНК полимеразой 1 для получения способствующих росту концов на кДНК, двунитевая кДНК была обработана метилазой EcoRI и S-аденозилметионином для метилирования сайтов EcoRI и защиты их от последующего ферментного расщепления. Линкеры ЕсоRI были лигированы к кДНК. Вслед за перевариванием ЕсоRI избыточные линкеры были удалены и кДНК была фракционирована по размеру на колонке с Сефарозой 4В. В результате первого синтеза были собраны молекулы размером более чем 500 п.о, в то время как во втором были объединены для клонирования молекулы размером более чем 1000 пар оснований.
Конструирование библиотеки кДНК λgtll:
Вслед за синтезом двойной спирали кДНК с адаптированными связями молекулы были использованы для создания библиотек кДНК в векторе λgt ll. Это было осуществлено посредством лигирования кДНК с ДНК λgt ll, которая была расщеплена EcoRI и обработана фосфатом для предотвращения самолигирования вектора ДНК. Вслед за лигированием ДНК, рекомбинантные ДНК были упакованы in vitro для образования частиц инфекционного бактериофага. (Экстракты для упаковки имеются в виде промышленных препаратов лабораторий Библиотек или Клонтекс или могут быть приготовлены стандартными методами).
После упаковки ДНК аликвоты упаковывающей смеси были проверены на предмет наличия рекомбинантных форм в коллекциях. Как было обнаружено, одна из библиотек содержала около 2,57×106 инфекционных частиц, приблизительно 78% из которых были явно рекомбинантными /давая ясные пятна на X-Gal пластинах при выращивании в присутствии IPTG/. Другая библиотека имела около 2,75×106 единиц, образующих бляшки, и приблизительно 81% очевидных рекомбинант.
Скрининг библиотеки.
Для того чтобы идентифицировать рекомбинантный бактериофаг, который включил кДНК альфа-амидирующего фермента, фаг был исследован с помощью радиомеченных олигонуклеотидных проб, сконструированных на основе данных о специфичной аминокислотной последовательности альфа-амидирующего фермента. /Смотри пример 5, таблица 2/. Скринирование было выполнено путем посева образцов бактериофага и переноса фага на нитроцеллюлозные фильтры. Процедуры иммобилизации фага на нитроцеллюлозных фильтрах хорошо известны. По два фильтpa от каждой пластины были гибридизованы Р32-олигонуклеотидом АЕ 9. Гибридизация была осуществлена при 37°C в течение 20-24 часов в 6x NЕТ, 0,5% NР40, 5х Денгардовском растворе, 100 μг/мл ДНК спермы лосося с олигонуклеотидной пробой 0,3-0,4 pmols/ml. Вслед за гибридизацией фильтры были промыты в 6х SCC при 44-45°С в течение нескольких часов и экспонированы на рентгеновской пленке. Положительно гибридизирующийся фаг был идентифицирован как совпадающие пятна на дублирующих фильтрах. Они были очищены путем последовательного обогащения через несколько этапов посева и гибридизации. Из примерно 4-5×104 проанализированных фагов 18 были идентифицированы при помощи АЕ 9.
Для подтверждения специфичности отбора была выполнена гибридизация со вторым олигонуклеотидом альфа-амидирующего фермента. Это испытание обнаружило, что, по меньшей мере, четыре из восемнадцати фагов несли кДНК для последовательностей альфа-амидирующего фермента. Это открытие было подтверждено дополнительной гибридизацией с АЕ 4 и АЕ 5, а также анализом последовательности ДНК.
Экспрессия α-амидирующего фермента
Для Пика III αАЕ /альфа-амидирующего фермента/, как мы определили, протеиновые последовательности имели молекулярный вес около 75000 дальтон. Если средний молекулярный вес аминокислоты принимается как 120 дальтон, то амидирующий фермент имеет, по крайней мере, 625 аминокислот. Ген для 625 аминокислот должен содержать, по меньшей мере, 1875 пар оснований. Все четыре кДНК, которые мы изолировали как специфичные для амидирующего фермента, слишком велики для того, чтобы полностью кодировать протеин альфа-амидирующего фермента. Один из клонов кДНК, λАЕ1, состоит из приблизительно 2200 нуклеотидов. В пределах первых 50 нуклеотидов от конца он начинает кодирование аминокислотной последовательности, которая была идентифицирована как N-конец фермента пика III. Поэтому можно заключить, что эта кДНК содержит всю информацию, необходимую для кодирования фермента пика III.
Одна из возможных процедур, которая может быть применена далее к кДНК λAE1, изображена на фиг.10. А именно, вставку кДНК λAE1 размером 2200 пар оснований изолируют вслед за перевариванием ДНК рекомбинантного бактериофага с помощью EcoR1 и электрофореза в агарозном геле. Она клонируется в сайте EcoR1 pBR322 с получением плазмиды рАЕ8-1, рАЕ8-1 содержит уникальный сайт расщепления Крn 1 внутри последовательности кДНК и уникальный сайт Hind III внутри последовательности pBR 322. Переваривание рАЕ8-1 с помощью Kpn1 и Hind III приводит к получению фрагмента около 2,15 т.п.о., который потерял около 62 пар оснований кДНК /на амино терминальном кодирующем конце кДНК/. Для восстановления аминокислот, обнаруженных на амино-конце пика III амидирующего фермента, и для адаптирования кДНК для клонирования в плазмиду экспрессии, фрагмент Kpn1-HindIII лигируется с олигонуклеотидными линкерными адаптерами. В приведенном примере для экспрессии в E.coli использовали плазмиду рКК233-2 фирмы фармация. Фрагмент кДНК размером 2,15 т.п.о., лигированный с линкер-адаптером, включал:
АЕ17/+/305' CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC 3'
и
АЕ18/-/225' CAAGGCATTCATTGGAAAATGA3'
Адаптированный фрагмент затем лигировали с ДНК плазмиды рКК233-2, которая была заранее расщеплена с помощью NcoI и Hind III для получения линейного вектора 4,6 т.п.о. Лигированный продукт, рАЕ12, содержит кДНК для альфа-амидирующего фермента с предшествующим ей начальным кодоном ATG и сайт связывания рибосомы, находящиеся под контролем гибридного IPTG индуцируемого промотора trc. За геном фермента следует ген 5S РНК и сайт окончания транскрипции. Индуцируемая IPTG экспрессия рекомбинантного фермента осуществлена вслед за трансформацией плазмидной ДНК pAE12 Е.сoli с генотипом laciq. Для определения активности использовали те же методы, что и в случае природной АЕ.
Частичная последовательность вставки кДНК 2,2 т.п.о. в λАЕ1.
Вставка размером 2,2 т.п.о была вырезана перевариванием λAE1 с помощью EcoR1 и была маркирована 32Р. После вторичного переваривания Hinc 11 результирующие фрагменты 1,6 т.п.о и 0.6 т.п.о. были соединены в последовательность посредством метода химического разложения Максама и Гилберта.
Полученная секвенированием по Максаму-Гилберту последовательность ДНК EcoRI-конца фрагмента SАЕ-1 размером 600 п.о;
Полученная сканированием по Максаму-Гилберту последовательность EcoRI конца фрагмента SAE-1 размером 1600 п.о.;
Исследование гомологии последовательности олигонуклеотидной пробы АЕ8/-/22
Компьютерное исследование было выполнено для определения гомологии между аминокислотами, использованными для получения пробы АЕ8 /Leu-Cty-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr/ и трансляции частичной последовательности ДНК 600 п.о. р фрагмента λAE1.
Была получена область совершенной гомологии, она выделена звездочками на последовательности ДНК и указана прописными буквами для аминокислот. Аминокислоты, идентифицированные как NН2 - концевая последовательность очищенного амидированного фермента, заключены в скобки. Название аминокислот, которые были найдены отличными от предписываемых последовательностью ДНК, указаны знаком "+".
Пример 8
Иммобилизация фермента
Очистка α-АЕ:
Перед иммобилизацией альфа-амидирующий фермент был очищен слабой анионобменной хроматографией и гель-фильтрацией /пример 2/. В некоторых случаях приготовление фермента может включать дополнительную очистку с использованием либо хроматографии иммунного сродства или хроматографии на фенилсефарозе. Процедура последовательной иммобилизации не зависима от процедуры очистки; однако специфическая активность должна быть, по меньшей мере, 25 мu и предпочтительно 50 мu или выше.
Иммобилизация α-АЕ:
Технология иммобилизации для альфа-амидирующего фермента может быть основана на одновременной реакции трех компонентов: фермента, растворимого в воде сополимера акриламида /PAN/ и имеющего небольшой молекулярный вес реагента с поперечными связями /ТЕТ/. Предварительно созданный полимер /РАN/ состоит из акриламида и N-акрилоксисукцинимида, который полимеризован в растворе THF с использованием термальной инициации азобизом /изобутиронитрилом/. Реагент с поперечными связями может быть α,ω-диамином, триэтилентетрамином /ТЕТ/, цистамином. Реакция диамина с активными эфирными группами PAN создает поперечные связи цепей полимера через амидную связь и образует нерастворимый гель. Амино функции фермента /предпочтительно ∈-амино группа лизина/ в то же самое время реагирует с остаточными активными эфирами на геле и образует стабильные ковалентные амидные связи. Процедура иммобилизации осуществляется в присутствии субстрата и кофакторов. Присутствие субстрата с высокой степенью сродства и кофакторов в концентрации более Кm запрещает реакции между активными эфирами PAN и нуклеофильными группами вблизи или у каталитического сайта фермента, защищая таким образом фермент от химической инактивации.
Условия иммобилизации:
Частично очищенный α-AE растворили в 30 мМ HEPES буфере с рН 7,0. Отношение РАN и ТЕТ устанавливается так, что 15% активных эфиров остаются непрореагировавшими, что служит в качестве связующих сайтов для альфа-амидирующего фермента. Стандартный раствор РАN представляет собой 20% /W/W/. Реактивная смесь альфа-амидирующего фермента состоит из 0,2 СuSO4, 40 μМ дансила His-Phe-Gly и 10 мМ аскорбата и 0,5-2,0 мг α-АЕ/грамм PAN. Концентрация ТЕТ вычисляется так, чтобы равняться 0,85 эквивалентам первичного амин/эквивалента активного эфира. Для определения оптимальных условий реакция запускается без фермента для установления времени образования геля, то есть продолжительности времени после добавления ТЕТ, необходимого для достижения образования геля. Оптимум, получаемый для иммобилизации альфа-амидирующего фермента, достигается, когда добавление фермента смещается ближе к точке образования геля. Общее правило заключается в том, что чем меньшее время фермент подвергнут воздействию PAN перед образованием геля, тем выше выход активного иммобилизированного фермента. Для большинства реакций α-АЕ /~ 2,0 мг/грамм РАN/ добавляется через 45-60 секунд после ТЕТ. Фермент-содержащий гель оставляется при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа, чтобы завершить реакцию соединения. После истечения 60 минут гель размельчается с помощью ступки и пестика, приводя к получению фрагментов в среднем с размером 100 μ. Эти частицы вымываются сульфатом аммония для удаления несвязанных реактантов и для преобразования остаточных активных групп эфира в амиды, тем самым покрывая реактивные группы. Выход активного альфа-амидирующего фермента после иммобилизации ожидается менее 60%. Смыв после иммобилизации может содержать от 30 до 40% начальной активности. Альфа-амидирующий фермент может быть восстановлен из смыва посредством увеличения концентрации сульфата аммония до 45%, что приводит к осаждению активного альфа-амидирующего фермента.
Частицы иммобилизованного геля подходят для реакции альфа-амидирования в смеси, где частицы находятся в суспензии с механической мешалкой. После завершения ферментной реакции частицы осаждаются и супернатант, содержащий продукт амидированного пептида, декантируется. Эта процедура не является оптимальной для реакций большего масштаба. Частицы содержащего фермент геля недостаточно прочны, чтобы паковаться в колонку и получить разумную скорость потока. Для обхода этой проблемы возможны два альтернативных подхода:
1. Гелю дается возможность полимеризации в присутствии стеклянных бус; обычно за минуту до достижения "гелевой" точки стеклянные бусы добавляются к реакционной смеси и перемешиваются в механической мешалке до покрытия бус слоем раствора PAN. Текучие свойства этого композитного материала значительно лучше, чем просто гелевых частиц.
2. Альтернативно, частицы РАN смешиваются с целью фильтрации с Celite 545. Обычно смесь РАN и Celite готовится при PAN, образующем менее 8% W/W /сухой вес/ смеси. Для получения этого типа колонки гелевые частицы взвешиваются в 50 мМ Tris:HCl pH 7,0 и при постоянном перемешивании к ним добавляется Celite 545 и смешивается в течение двух часов. Колонка упаковывается этим шламом /3×40 см/ и температура колонны поддерживается при 37°С для облегчения реакции амидирования. При использовании такого подхода достигается скорость потока 8-10 литров в день.
Привлекательной альтернативой колоночной хроматографии является использование системы с тангенциальным потоком. Полимер PAN перед гелевой точкой разливается по листу полисульфоновой пористой подложки 0,45 μм. После образования геля листы могут быть порезаны для использования в ультрафильтрационных установках с тангенциальным потоком системы Миллипор или Нью Брансвик. В этой конструкции композитные листы геля, иммобилизованного полисульфоном-РАN фермента, укладываются слоями, приводя к значительному увеличению площади поверхности. Этот подход может быть прямо масштабирован до скоростей потока, приближающихся к литрам в минуту. Этот тип системы также обеспечивает возможность повторного пропускания реакционной смеси с целью максимизации амидирования пептидного субстрата.
Преимущества, достигаемые посредством иммобилизации альфа-амидирующего фермента, включают восстановление и повторное использование фермента. Во-вторых, иммобилизованная матрица увеличивает стабильность фермента и обеспечивает рабочую форму энзима, пригодную для большемасштабных реакций амидирования /от грамм до килограмм субстрата по количеству/ в течение протяженных периодов времени.
Пример 9
Приготовление иммунно-аффинной колонки для очистки загрязненных композиций альфа-амидирующего фермента
А. Процедура иммобилизации:
Используемая матрица иммобилизации представляла собой цианоген бромид-активированную Сефарозу 4В /Формация/. Сухой гель был вначале промыт 1 мМ НСl /200 мл/грамм смолы/ для смывания твердой подложки. Приблизительно 40 мг очищенного поликлонального антитела, выделенного из желтков куриных яиц, подвергается диализу с использованием 100 мМ NаНСО3 рН 8,3, содержащего 0,5 М NaCl. Соединение осуществляется с использованием 8 мл предварительно промытой твердой подложки. Реакция осуществлялась в течение трех часов при комнатной температуре в ацетатном буфере с концентрацией 100 мМ и рН 8,3, содержащем 500 мМ NаСl, которая была включена для уменьшения неспецифической связи протеина с твердым основанием. Остающиеся активные группы геля были блокированы с использованием 0,2М глицина. После блокирования гель был смыт до пяти раз с использованием цикла буферов с высоким и низким рН /буфер с высоким рН; 100 мМ NаНСО рН 8,3+500 мМ NaCl, буфер с низким рН; 100 мМ ацетат с рН 4,0+500 мМ NаСl/. Эти ступени промывания удаляют любой несвязанный белок и блокирующий реагент /глицин/ со смолы. Смола с иммунным сродством была помещена при 4°С в базовый рН буфер, содержащий мертиолат в качестве бактериостатического агента. Вся последующая хроматография с иммунным сродством осуществляется при 4°С. Аналогичный метод может быть использован для иммобилизации очищенных моноклональных антител.
В. Иммунно-аффинная хроматография
Колонка с иммунным сродством используется как альтернативная ступень высокой эффективности в очистке α-АЕ. Среда тканевой культуры клеток СА-77 /смотри пример 2/ разбавляется дистиллированной водой и под давлением пропускается через DЕАЕ-анионообменный, предварительно уравновешенный 20 мМ Bis Tris-HCl pH 6,0. Альфа-амидирующий фермент элюируется с помощью 50 мМ Тris:НСl рН 7,0, содержащего 500 мМ NaCl. Фракции, содержащие α-АЕ активность, либо подвергаются диализу против буфера Тris:HCl. pH 7,0 или очищаются дальше с использованием гель-фильтрационной хроматографии /пример 2/ перед хроматографией иммуносродства. Образцы, содержащие α-АЕ, пропускаются через иммуноадсорбционную колонну с нейтральным рН. Антитела специфично свяжут альфа-амидируюший фермент, в то время как загрязняющие протеины не будут связаны и будут удалены в элюанте. Активность α-АЕ может быть элюирована с колонки с использованием 100 мМ глицина, НСl буфера с рН 3,0, /могут быть использованы другие десорбционные агенты, включая мочевину, диоксан, этиленгликоль, и Nа1/. Фракции собираются в 1,0 М Tris:HCl рН 7,0 для нейтрализации буферной системы, сохраняя тем самым активность α-АЕ.
Изобретение относится к области биохимии и генной инженерии и может быть использовано в производстве амидированных форм гормонов и других пептидов, применяемых в медицине и сельском хозяйстве. На основании результатов определения последовательностей пептидов, полученных при триптическом переваривании пептидилглицин-альфа-амидирующей монооксигеназы (РАМ) из мозговидной карциномы щитовидной железы крыс, синтезированы олигонуклеотидные последовательности, которые использованы для изолирования полноразмерных ДНК, кодирующих РАМ. Экспрессия полученных фрагментов ДНК в гетерогенных системах позволяет получить рекомбинантную форму РАМ, которая может быть использована в реакции амидирования пептидных субстратов с С-концевым глицином с тем же эффектом, что и нативный фермент. 12 ил., 2 табл.
Способ получения амидированного пептида, включающий контактирование предшественника пептида, имеющего С-концевой глицин, с пептидилглицин-альфа-амидирующей монооксигеназой, которая получена экспрессией в клетке-хозяине последовательности ДНК, кодирующей пептидилглицин-альфа-амидирующую монооксигеназу и способной гибридизоваться по меньшей мере с двумя зондами, выбранными из группы, состоящей из:
олигонуклеотидного зонда АЕ1
олигонуклеотидного зонда АЕ4
олигонуклеотидного зонда АЕ5
олигонуклеотидного зонда АЕ6
олигонуклеотидного зонда АЕ7
олигонуклеотидного зонда АЕ8
олигонуклеотидного зонда АЕ 9
олигонуклеотидного зонда АЕ10
и олигонуклеотидного зонда АЕ11
Конвенционный приоритет установлен от 14.08.1987 в соответствии с заявкой 86161, поданной в Патентное ведомство США.
| EIPPER ЕТ AL., Proc | |||
| Natl | |||
| Acad | |||
| Sci USA, v.80, p.5144-5148, 1983 | |||
| MURTHY ET AL., J | |||
| Biol | |||
| Chem, v.261 | |||
| Электрический конденсатор переменной емкости | 1925 |
|
SU1815A1 |
