СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОМ-АЛЬФА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано при определении показаний для лечения интерфероном-альфа больных хроническим миелолейкозом.

Известен способ определения показаний для лечения интерфероном -альфа больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) (Nicolson N.L, Talpaz М., Nicolson G. L. Interferon-alpha directly inhibits DNA polymerase activity in isolated chromatin nucleoprotein complexes: correlations with INF- α treatment outcome in patients with CML, Gene, 1995, vol. 159, p. 105-111), основанный на определении активности ДНК-полимеразы. Данный способ не дает адекватного определения показаний для лечения интерфероном-альфа больных ХМЛ, так как нет строгой зависимости между подавлением активности ДНК- полимеразы и эффективностью терапии интерфероном-альфа больных ХМЛ.

Известен способ определения показаний для лечения интерфероном-альфа больных ХМЛ (J.Hasford, M.Pfirrmann, R.Hehlmann et al. A new prognostic score for survival of patients with CML treated with IN - α. //J. of the National Cancer lnstitute. -1998. - Vol.90, 11, p. 850-858), согласно которому в качестве клинико-биологических показателей определяют возраст пациента, размер селезенки, процентное содержание в крови бластов, эозинофиллов, базофиллов, число тромбоцитов, по определенной формуле вычисляют показатель выживаемости больного ХМЛ и определяют показания для лечения интерфероном-альфа.

Известный способ не имеет прямого отношения к патогенезу ХМЛ и механизму действия интерферона-альфа. Прогноз оценивается по расчетам математической формулы и носит вероятностный характер.

Задачей изобретения является создание способа определения показаний для лечения интерфероном-альфа больных хроническим миелолейкозом, обладающего высокой точностью.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения показаний для лечения интерфероном-альфа больных ХМЛ, включающем определение клинико-биологических показателей, в качестве клинико-биологического показателя определяют тип хромосомной транслокации t(9;22)(q34;q11) и при выявлении химерного транскрипта b3a2 лечение интерфероном-альфа считают показанным.

Характерным признаком ХМЛ является хромосомная транслокация t(9;22)(q34; q11), которая выявляется у 95% больных. В результате транслокации t(9; 22)(q34;q11) образуется химерный ген bcr-abl, транскрипция которого приводит к появлению химерной мРНК трех основных типов: b3a2, b2a2, e1a2. Первые два типа транскриптов мРНК (b3а2 и b2а2) характерны, как правило, для ХМЛ, лишь в редких случаях (2-3%) встречается тип e1a2. Транскрипт bcr-abl определяет основные патогенетические механизмы ХМЛ. Молекулярно-генетическая оценка хромосомной транслокации t(9; 22)(q34;q11) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (РТ-ПЦР) позволяет выявить тип хромосомной транслокации.

Авторами было обследовано 65 больных ХМЛ с использованием метода РТ-ПЦР по методике Кавасаки (Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne M.Y., Smith S.D., Champlin R. , Witt O.N., Me Cormick F.P. Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphoblastic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1988. - Vol. 85.- P. 5698-5702) в модификации по Мейеру (Meyers T. W., Gelfand D.H. Reverse transcription and DNA amplification by Thermus thermophilus DNA polymerase // Biochemistry. - 1991. - Vol. 30. - P. 7661-7666). У всех 65 больных ХМЛ была обнаружена хромосомная транслокация t(9;22)(q34;q11): у 42 больных ХМЛ был обнаружен тип транскрипта b3a2, у 23 больных - тип транскрипта b2a2. Всем больным было назначено лечение стандартными дозами интерферона-альфа 5 млн. ME х м² поверхности тела.

Для оценки эффективности лечения интерфероном-альфа больных ХМЛ с типами транслокации b3a2 и b2a2 рассматривали следующие показатели: достижение полной гематологической ремиссии, достижение цитогенетической ремиссии (редукция Ph-позитивного лейкозного клона), продолжительность хронической фазы ХМЛ и общую продолжительность жизни больных ХМЛ.

Результаты статистического анализа в группе больных ХМЛ с типом транслокации b3a2 показали, что достижение полной гематологической ремиссии (ПГР) при терапии интерфероном-альфа происходит достоверно чаще, чем у больных с типом транслокации b2a2 (χ² =0.001; F=0.002; p<0.05). Нами было показано, что в группе больных ХМЛ с типом транслокации b3a2 достижение редукции Ph-позитивного лейкозного клона при терапии интерфероном-альфа происходит достоверно чаще, чем у больных с типом транслокации b2a2 (χ² =0.013; F= 0.035; р<0.05).

Сравнение двух независимых распределений позволило выявить большую общую продолжительность жизни в группе 42 больных ХМЛ с типом транслокации b3a2 при терапии интерфероном-альфа по сравнению с 23 больными, которые имеют тип транслокации b2a2. Различия между вышеназванными группами больных ХМЛ оказались статистически достоверными (p=0.046). Кроме того, проведенный статистический анализ данных в отношении длительности хронической фазы свидетельствует, что в группе больных ХМЛ с типом транслокации b3a2 при терапии интерфероном-альфа длительность хронической фазы была достоверно больше по сравнению с больными, которые имеют тип транслокации b2a2 (p=0.026).

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что химерный транскрипт b3a2 является необходимым признаком способа определения показаний для лечении больных ХМЛ интерфероном-альфа. По-видимому, это связано с особенностями доменной организации и высокой иммуногенностью слитного белка p210^{BCR-ABL/b3a2/}. Вероятно, отсутствие некоторых антигенных детерминант у белка p210^{BCR-ABL/b2a2/} по сравнению с белком p210^{BCR-ABL/b3a2/} приводит в конечном итоге к неодинаковому иммунному ответу против клеток, экспрессирующих разные формы химерного белка bcr-abl.

Способ осуществляют следующим образом.

Из периферической крови больного ХМЛ выделяют лейкоциты. Из выделенных лейкоцитов по классической методике, предложенной Гомзинским и Сачи (Chomczynski P. , Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. - 1987. - Vol. 162. - P. 156-159), выделяют РНК. Для определения варианта химерной мРНК гена bcr-abl используют метод РТ-ПЦР, основанный на обратной транскрипции выделенной из клеток РНК и амплификации полученного продукта кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукт РТ-ПЦР анализируют с помощью электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК в 1,2% агароэном геле согласно методике Кавасаки. При обнаружении в периферической крови больного химерного транскрипта b3a2 лечение интерфероном-альфа считают показанным и назначают терапию интерфероном-альфа в количестве 5 млн. ME х м² поверхности тела.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больной Л., 42 лет: диагноз ХМЛ, в момент постановки диагноза выявлена Ph-хромосома в 100% проанализированных метафаз, обнаружен b3a2 тип транскрипта химерного гена bcr-abl. Больному назначена терапия интерфероном-альфа в дозе 5 млн. ME х м² поверхности тела. Анализ крови (клинико-гематологические показатели) до начала терапии: Hb 130 г/л, Er 4.2•10¹²/л, L 15.0•10⁹/л (мц10, мета15, п10, с38, лф15, мон10), Tr 250•10⁹/л. Через 1.5 месяца терапии была достигнута полная клинико-гематологическая ремиссия: Hb 136 г/л, Er 4.3•10¹²/л, L 4.0•10⁹/л (п4, с65, лф21, мон10), Tr 340•10⁹/л. Через 12 месяцев от начала терапии была достигнута полная цитогенетическая ремиссия (2n = 46XY в 100% проанализированных метафаз), которая продолжается по настоящее время. Таким образом, в настоящее время длительность хронической фазы составила 2860 дней, общая продолжительность жизни составила 2860 дней.

Пример 2. Больной К., 18 лет: диагноз ХМЛ, в момент постановки диагноза выявлена Ph-хромосома в 100% проанализированных метафаз, обнаружен b2a2 тип транскрипта химерного гена bcr-abl. Больной получал терапию интерфероном-альфа в дозе 5 млн. ME х м² поверхности тела. Анализ крови (клинико-гематологические показатели) до начала терапии: Hb 124 г/л, Er 4.2•10¹²/л, L 12.0•10⁹/л (мц10, мета15, п10, с38, лф15, мон12), Tr 258•10⁹/л.

Проведение больному курса химиотерапии интерфероном-альфа не позволило достичь полной гематологической ремиссии: Hb 120 г/л, Er 4.0•10¹²/л, L 28.0•10⁹/л (пмц2, мц16, мета5, п12, с35, лф16, мон14), Tr 180•10⁹/л. Кроме того, не было достигнуто и цитогенетической ремиссии у больного, получающего интерферон-альфа: обнаружена хромосомная транслокация t(9;22)(q34;q11) в 100% проанализированных метафаз. Через 1 месяц больной умер. Длительность хронической фазы составила 180 дней, общая продолжительность жизни составила 259 дней.

Предлагаемый способ определения показаний для лечения интерфероном-альфа позволяет повысить точность способа за счет предварительного определения признака, имеющего прямое отношение к патогенезу ХМЛ и механизму действия интерферона-альфа.

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии. Способ заключается в определении типа хромосомной транслокации t(9,22)(q34,q11) и при выявлении химерного транскрипта b3а2 лечение интерфероном-альфа больных хроническим миелолейкозом считают показанным. Технический результат - повышение точности способа.

Способ определения показаний для лечения интерфероном-альфа больных хроническим миелолейкозом, включающий определение клинико-биологических показателей, отличающийся тем, что в качестве клинико-биологического показателя определяют тип хромосомной транслокации t(9,22)(q34,q11) и при выявлении химерного транскрипта b3a2 лечение интерфероном-альфа считают показателем.