СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ЛЕЙКОЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно гематологии, и может быть использовано для ранней диагностики острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом (МДС).

Наиболее распространенным и применяемым в клинической практике способом диагностики острого лейкоза у больных МДС является исследование пунктатов костного мозга. При этом ведущим признаком в диагностике острого лейкоза является содержание бластных элементов в костном мозге. Диагностика острого лейкоза основывается на данных морфологического исследования субстрата костного мозга, при наличии в котором более 30% бластов устанавливают диагноз острого лейкоза.

При содержании бластов в пунктате костного мозга менее 30% , но более 10% диагностируют так называемый малопроцентный острый лейкоз.

При содержании бластов в костном мозге менее 10% диагноз острого лейкоза, как правило, не ставят. У больных с различными нарушениями гемопоэза, в том числе и с незначительным бластозом, диагностируют миелодиспластический синдром. Однако, у части этих больных нельзя исключить наличие ранней стадии острого лейкоза, но доказать морфологически, что обнаруженные в небольшом количестве бласты являются патологическим лейкозным клоном клеток, не представляется возможным.

Применение иммунных клеточных маркеров для идентификации бластных клеток не всегда дает положительные результаты, так как изменения в экспрессии мембранных антигенов затрудняют интерпретацию полученных данных. Метод проточной цитофлюориметрии и электронно-микроскопических исследований не обладает достаточной степенью достоверности, требует дорогостоящих реактивов и оборудования, а также высокой техники исполнителя, что не всегда возможно в клинической практике.

Предлагается использовать биохимические параметры для утверждения, что выявленное минимальное увеличение бластов (менее 10% ) является лейкозным клоном клеток. Использование биохимических подходов в диагностике начальной, ранней стадии острого лейкоза основывается на выявлении специфических особенностей обмена опухолевых клеток, а также на выявлении субстанций, продуцируемых трансформированными клетками в плазму.

Известен биохимический способ исследования крови, принятый за прототип и выявляющий изменения содержания липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК) и специфической активности ДНК-связывающих белков при развернутой стадии острого лейкоза.

Недостатком этого способа является поздняя констатация отклонений от нормы биохимических показателей ЛСК и СА ДСБ, определяемых в развернутой стадии острого лейкоза, где отмечаются большие изменения показателей относительно нормы.

Указаний о возможности использования минимальных изменений этих показателей одновременно с изменением ДНК для ранней диагностики острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом нет.

Цель изобретения - раннее выявление острого лейкоза у больных миеолодиспластическим синдромом.

Поставленная цель достигается тем, что у больных миелодиспластическим синдромом с наличием минимального патологического клона клеток (менее 10% бластов) определяют в сыворотке (плазме) крови содержание липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК), специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ). а также дополнительно определяют содержание ДНК, и при одновременном изменении всех трех показателей, причем содержание ЛСК увеличивается до 0,2 г/л и более, ДНК - до 7,5 мкг/мл и более, а специфической активности ДНК-связывающих белков снижаются до 14 ед. /мг белка и более, диагностируют острый лейкоз.

Определение содержания липидно-связанных сиаловых кислот в крови проводят по методу Katopodis.

К 150 мл дистиллированной воды добавляют 50 мкл сыворотки крови, перемешивают в течение 5 с и пробирки помещают в лед. Экстракцию липидной фракции проводят 3 мл охлажденной смеси хлороформа и метанола при соотношении 2: 1 об. /об. в течение 30 с, затем в эти же пробирки приливают 0,5 мл охлажденной дистиллированной воды и пробирки перемешивают в течение 30 с. После проведения экстракции пробирки центрифугируют 5 мин при комнатной температуре при 2500 об. /мин и верхний слой отсасывают. Затем к 1 мл верхнего слоя добавляют 50 мкл фосфорно-вольфрамовой кислоты (1 г/мл). После пятиминутного осаждения пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об. /мин при комнатной температуре, супернатант удаляют. Осадок растворяют в 1 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл резорцинового реагента. Пробы затем помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, охлаждают и добавляют 3 мл смеси бутилацетата и н-бутилового спирта при соотношении 85: 15 об. /об. , перемешивают и центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 мин при 2500 об. /мин. Верхний слой отсасывают и определяют в нем оптическую плотность на спектрофотометре Сф-4 при длине волны 580 нм. Расчет количества сиаловых кислот проводят по калибровочной кривой.

Определение специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ) проводят флюориметрическим методом.

К образцам сыворотки крови (разведение (1: 1)-(1: 8) объемом 25 мкл добавляют по 20 мкл смеси, содержащей 7 нмоль блеомицина, 1 мкг ДНК плазмиды РРВ, 5 мм β -меркаптоэтанола в 50 мкл натрий-боратного буфера (рН 9,5). Смесь инкубируют 30 мин при 37^оС. Аликвоты (50 мкл) добавляют к 450 мкл денатурирующего буфера (0,09 М Na₃PO₄ : 0,01 M ЕДТА : 0,01 M NaCl, рН 12,1), а затем приливают по 25 мкл этидиум бромида (56 мкм). Флюоресценцию ДНК определяют на флюорометре фирмы "Gitachi" при экстинкции 530 нм и эмиссии 590 нм.

Определяют процент угнетения деградации ДНК, индуцированной блеомицином, как функцию концентрации белка в сыворотке. Значения IC₅₀получают пробит-анализом 5 концентраций белка, имеющих результатом ингибицию в интервале 10-80% . Рассчитывают значения специфической активности (ед. /мг белка), учитывая, что 1 ед. ингибирной активности эквивалентна количеству белка, требующегося для получения 50% ингибиции деградации ДНК, индуцированной блеомицином. Белок в сыворотке крови определяют методом Лоури.

Для определения уровня ДНК кровь у больных берут на гепарине (конечная концентрация 25 ед. /мл) и центрифугируют при 3000 об. /мин при 4^оС. С целью депротеинизации к образцам плазмы объемом 0,2 мл добавляют равный объем 20% -ного раствора NaCl и помещают в кипящую водяную баню на 3 мин. После охлаждения пробы центрифугируют при 3000 об. /мин 30 мин. Концентрацию ДНК измеряют по флюоресценции комплекса ДНК-бис-бензимид (Hoechst 33258 "Serva") на флюориметре фирмы "Hitachi" при экстинции 365 нм и эмиссии 470 нм. В кюветы вносят 2,5 мл буфера, содержащего 1,3 М NaCl из 0,05 М Na-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 1,3 М NaCl и 25 мкл раствора бисбензимида (60 мкг/мл), далее добавляют несколько раз по 20 мкл супернатанта исследуемой плазмы и снимают показания флюоресценции. Затем в эту же кювету вносят коммерческую ДНК тимуса теленка по 250 нг и измеряют флюоресценцию при тех же длинах волн. Коммерческую ДНК, используемую в качестве стандарта, предварительно прогревают при 100^оС в 10% -ном растворе NaCl в течение 3 мин.

Расчет концентрации ДНК производят по формуле, составленной следующим образом: неизвестному количеству ДНК супернатанта А соответствует флюоресценция С, а поскольку известное количество ДНК тимуса теленка В добавляли в ту же самую кювету, что и анализируемые образцы, то суммарному содержанию ДНК 4 В + А будет соответствовать флюоресценция Д. Следовательно
А/С = (В+А)/Д.

Применяемые методики не сложны. Каждая из указанных методик занимает по времени около двух часов, требует небольшого количества исследуемого материала - 0,2-0,5 мл крови, используются в основном доступные, отечественные реактивы и отечественное оборудование. Чувствительность и достоверность тестов выше 90% .

Эти методики апробированы у доноров (контрольная группа) и у больных острым лейкозом.

Заявляемый способ диагностики был использован для выявления ранней стадии острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом.

В ходе изучения предлейкозных состояний в Ленинградском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови проводилось всестороннее клинико-лабораторное обследование больных с миелодиспластическим синдромом (МДС). Под наблюдением находилось 107 больных с МДС, у 17 из них в пунктатах костного мозга было выявлено небольшое ( < 10% ) содержание бластов.

Признаки лейкемизации процесса по клинико-лабораторным тестам были выявлены у больных МДС с рефрактерной анемией и избытком бластов (РАИБ). Результаты исследования выявили изменения клинического статуса, появление моно-, ди-, панцитопении с лимфоцитозом и/или моноцитозом, дисгемопоэз с признаками анаплазии клеток всех трех ростков кроветворения, с небольшим увеличением бластов (6,7 ±0,56% ), атипичное интрамодуллярное расположение скоплений бластов - по данным трепанобиопсии, снижение цитохимических показателей активности ряда ферментов в зрелых клетках нейтрофильного ряда, нарушение созревания органоидов цитоплазмы клеток на ультраструктурном уровне и др. изменения.

Выявленные цитологические признаки, особенно выраженные явления анаплазии бластов, указывали на тенденцию к лейкемизации процесса. По мере усугубления нарушений гемопоэза увеличивалась частота появления биохимических маркеров лейкемизации - уменьшение специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке крови, значительное повышение липидно-связанных сиаловых кислот и содержания ДНК в плазме крови.

Сопоставление клинических показателей с биохимическими параметрами представлено в таблице.

Как видно из данных таблицы: у 17 больных с МДС содержание бластов колеблется от 5,0 до 9,8% , составляя в среднем 6,7 ±0,56% .

Повышение уровня ЛСК в сыворотке крови обнаружено у всех 17 больных МДС в (N 0,1-0,2 г/л), повышение уровня ДНК в плазме крови - у 13 больных (N 2,8-7,5 мкг/мл) и снижение специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке крови (N 14,1-25,5 ед. /мг) - у 15 больных.

В зависимости от количества измененных биохимических показателей (три показателя, два, один) больные условно разделены на три группы.

У 12 больных имело место одновременное нарушение всех трех биохимических параметров. При этом у 10 из них (наблюдения 1-10) диагностирован острый лейкоз, подтвержденный посмертно патологоанатомическими данными; у 2 больных (наблюдения 11, 12) также диагностирована ранняя стадия острого лейкоза, начата интенсивная полихимиотерапия острого лейкоза и лечение их продолжается.

У остальных 5 из 17 больных МДС с изменением только двух биохимических параметров (наблюдения 3-16) или с изменением только одного биохимического теста (наблюдение 17) до настоящего времени трансформации в острый лейкоз не наблюдается.

Следует отметить, что в отличие от развернутой стадии острого лейкоза, где имеют место выраженные изменения ЛСК и СА ДСБ по сравнению с нормой, у больных миелодиспластическим синдромом (с минимальным бластозом костного мозга) любое одновременное минимальное изменение уровня содержания ЛСК, СА ДСБ и ДНК позволяет выявить раннюю стадию острого лейкоза.

При этом констатация изменений биохимических параметров имела место за 6-17 мес до установления диагноза острого лейкоза.

П р и м е р 1. Выписка из истории болезни N 713/87. У больной Г. с рефрактерной анемией в пунктате костного мозга 4/VIII-86 г. - содержится 5% миелобластов. В VIII 1986 г. впервые выявлено одновременное изменение трех биохимических показателей: ЛСК 0,28 г/л; ДНК 7,6 мкг/мл; СА ДСБ 7,2 ед. /мг белка. Далее в XI-86 г. усугубляются нарушения биохимических тестов: отмечается увеличение ЛСК до 0,34 г/л; ДНК - до 7,84 мкг/мл; уменьшение СА ДСБ - до 6,95 нд. /мг белка. Т. е. биохимические показатели приближаются к изменениям, характерным для острого лейкоза. Было высказано предположение, что у больной - начальная стадия острого лейкоза. Однако, на основании международной ФАБ-классификации миелодисплазий было право поставить только диагноз рефрактерной анемии с избытком бластов (РАИБ).

Больная умирает 17.01.87 г. , патологоанатомически подтвержден диагноз острого лейкоза.

Таким образом изменения биохимических показателей за 6 месяцев предшествовали установлению диагноза острого лейкоза.

П р и м е р 2. Выписка из истории болезни N 540/87.

У больного Б. с рефракторной анемией в костном мозге 17/IV-87 г. выявлено 9,8% бластов. Биохимические показатели в этот период имели изменения, близкие к таковым при остром лейкозе: ЛСК 0,40 г/л; СА ДСБ 8,2 ед. /мг белка; ДНК 12,1 мкг/мл.

Эти биохимические параметры свидетельствовали о наличии у больного острого лейкоза. Но согласно общепринятым международным критериям диагностики в клинике был установлен диагноз РАИБ. Диагноз острого лейкоза становится возможным 08.12.87 г. , когда в костном мозге содержание бластов возросло до 24,0% . Больной умер в IV-88 г. , диагноз острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) подтвержен патологоанатомически.

В данном наблюдении одновременное изменение биохимических показателей, характерное для острого лейкоза, обнаружено за 8 месяцев до установления диагноза острого лейкоза.

П р и м е р 3. Выписка из истории болезни 982/87. У больного А. с рефрактерной анемией в костном мозге 21/III-87 г. выявлено в пунктате костного мозга 7,0% миелобластов. Уровень содержания биохимических параметров в этот же период вреени оказался измененным: ЛСК 0,28 г/л; СА ДСБ 10,4 ед. /мл белка; ДНК 9,5 мкг/мл. Эти данные в совокупности с бластозом костного мозга позволяли диагностировать у больного раннюю стадию острого лейкоза.

Однако в клинике в III-87 г. был установлен диагноз РАИБ. Далее, 20.06.87 г. в костном мозге содержание бластов достигло 24% , что позволило установить диагноз острого лейкоза. Больной умер 27.07.88 г. , диагноз острого лейкоза подтвержден патологоанатомическими данными.

Одновременное изменение трех биохимических тестов при минимальном бластозе отмечалось за 10 мес до устагновления диагноза острого лейкоза.

Таким образом одновременное, даже минимальное по отношению к норме, изменение биохимических параметров, таких как уровень липидно-связанных сиаловых кислот, ДНК и специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке (плазме) крови у больных миелодисплапстическим синдромом при наличии минимального патологического клона клеток (6,7 ±0,56) позволяет диагностировать раннюю стадию острого лейкоза. (56) Лабораторное дело. 1988. N 6, с. 38-40.

Использование: в медицине, в частности в гематологии, для ранней диагностики острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом (МДС). Сущность изобретения: измеряют содержание липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК), ДНК и специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ) в крови больных миелодиспластическим синдромом с минимальным бластозом костного мозга (менее 10% бластов) и при одновременном изменении всех трех показателей: содержание ЛСК увеличивается до 0,2 г/л и более, ДНК - до 7,5 мкг/л и более, а специфическая активность ДНК-связывающих белков снижается до 14 ед/мг белка и более, диагностируют острый лейкоз. Способ позволяет осуществить раннее выявление острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом. 1 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ЛЕЙКОЗА, включающий изменение содержания липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК) и специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ) в крови, отличающийся тем, что, с целью раннего выявления острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом, дополнительно определяют в крови содержание ДНК и при одновременном изменении всех трех показателей, причем содержание ЛСК увеличивается до 0,2 г/л и более, ДНК - до 7,5 мкг/мл и более, а специфическая активность ДНК-связывающих белков снижается до 14 ед. /мг белка и более, диагностируют острый лейкоз.