СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/68 G01N33/559 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, конкретно к способам диагностики инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Метод ПЦР применяют для выявления в исследуемых образцах специфических фрагментов нуклеиновых кислот микроорганизмов. Метод позволяет выявить единичные клетки возбудителей инфекционных заболеваний независимо от их природы, так как основан на многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК), характерного для исследуемого организма.

Метод ПЦР состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемого материала, которая обычно сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно проведения ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).

Реакцию обычно проводят в пробирках Эппендорфа. Все компоненты реакции вносят автоматической микропипеткой со съемным наконечником. Перед внесением в реакцию исследуемый материал обычно подвергается предварительной обработке. Тип обработки зависит как от вида возбудителя, так и от вида клинического материала. В простейших случаях достаточно прокипятить пробу в течение 5-10 минут, в более сложных время обработки может составить 3-4 часа. При постановке реакции в пробирку последовательно вносят определенные количества: деинонизированной стерильной воды; буфер для проведения реакции; стабилизатор реакции (бычий сывороточный альбумин или желатин); смесь всех четырех типов дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (элементов, из которых происходит синтез новых нитей ДНК); водный раствор обоих праймеров, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом; материал исследуемого клинического образца и термостабильную ДНК-полимеразу Tag. Сверху на пробу наслаивают стерильное вазелиновое масло для предотвращения испарения реакционной смеси во время проведения ПЦР.

Пробирки помещают в термоциклер (амплификатор) и проводят реакцию по заданной программе в автоматическом режиме. Контроль реакции осуществляют одновременно с постановкой ПЦР на клиническом материале путем внесения в две дополнительные пробирки всех компонентов реакции, но в одну из них вместо материала клинического образца вносят контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя - положительный контроль, а в другую - вместо клинического материала вносится соответствующее количество деинонизированной воды - отрицательный контроль.

Заключительной стадией ПЦР является детектирование продуктов ПЦР. Присутствие специфического ПЦР-продукта в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле. Используемый для разделения смеси гель должен обладать строго определенными физико-химическими характеристиками: низкой токсичностью по отношению к культуре клеток, хорошими диффузионными свойствами, высокой прозрачностью, иметь определенные показатели прочности студня, электроэндоосмоса (ЭЭО), зольности и содержания серы, как показателя присутствия сульфат-групп, что обеспечивается применением гелеобразователя определенного вида.

В настоящее время для детектирования продуктов ПЦР известно применение только двух типов гелеобразователей: агарозы и полиакриламида с различными добавками.

Известно использование полиакриламида для приготовления 4-6% геля, используемого в качестве инертного носителя для проведения электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК с последующим окрашиванием зон их локализации бромистым этидием или нитратом серебра (з. РФ N 97101436, опубл. 27.02.99).

Однако при приготовлении вышеназванного геля требуется соблюдать осторожность, избегать попадания сухого гелеобразователя или раствора на слизистые и кожные покровы из-за токсичности используемого мономера акриламида, что приводит одновременно и к повышенной нейротоксичности полученного геля, а, кроме этого, полученный полиакриламидный гель используется для разделения и извлечения коротких фрагментов ДНК.

Наиболее близким к заявляемому является способ детекции продуктов ПЦР посредством электрофоретического разделения ПЦР - амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле, приготовленном из агарозы (Федоров И.А., Суханов Ю. С., А.Х. Асади Мобархан, Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция(ПЦР).- М.,- 1996,- с.14).

Электрофорез ДНК в агарозном геле является стандартным методом разделения и идентификации ДНК, особенно для высокомолекулярной ДНК. Детекцию осуществляют следующим образом. Готовят агарозный гель, растворяя навеску агарозы в буферном растворе при нагревании, затем вносят краситель, заливают полученный раствор в пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют до застывания геля. Гребенки поднимают и промывают полученную пластину с лунками электрофорезным буфером. В лунки геля вносят продукты ПЦР клинического образца, положительного и отрицательного контроля, пластину помещают в аппарат для электрофореза. После окончания электрофоретического разделения продуктов ПЦР гель помещают на стекло трансиллюминатора и просматривают его в УФ-свете. По появлению в исследуемом образце светящейся полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля, говорят о наличии искомой ДНК.

Агароза является составной частью природного гелеобразователя агара и получается выделением из агара путем его ацетилирования. В зависимости от свойств исходного агара и от способа выделения агарозы из него получают различные марки агароз, отличающиеся друг от друга по физико-химическим свойствам.

Для получения электрофоретического геля, используемого при детекции ПЦР, применяют только определенные марки агароз, которые пригодны для биомолекулярного разделения. Качество очистки этих агароз достаточно высокое, а их количество ограничено. Так, например, фирма "Sigma" выпускает 12 марок агароз, однако для ПЦР- детектирования пригодны только две. Фирмой ICN выпускается более 15 типов агароз, но для ПЦР детектирования используют только агарозу марки "HGT"(high genetictechnology grade). Такое же соотношение и на фирмах "Serva" и "Difco", специализирующихся на выпуске биопрепаратов. Выпускаемые зарубежными фирмами агарозы нетоксичны, обладают высокими показателями прочности и прозрачности образуемого геля, имеют показатель ЭЭО 0,17 - 0,23 и зольность 0,46 ± 0,1.

Получение агароз данных марок (electrophoresis grade и genetictechnology grade) сопряжено со значительными материальными затратами первоначально на очистку агара, используемого для дальнейшей переработки, а затем на выделение из него агарозы путем его ацетилирования и последующей либо экстракцией агарозы либо осаждения агаропектина и неагаровых примесей. Стоимость агароз такого типа составляет от 135 до 350 $ за 100 г. В России агароз подобного качества не выпускается. Высокая стоимость тест-систем, в состав которых входит и агароза, является одним из недостатков, препятствующих в настоящее время широкому использованию ПЦР в клинической практике диагностики заболеваний (Ж.микроб., эпидемиол. и иммунологии, -1997, N 5, с. 87).

Опыты по использованию агароз других марок для приготовления электрофоретической среды с целью детектирования продуктов ПЦР показали их низкую эффективность и неэкономичность. Применение агароз различной степени очистки требует подбора их концентрации для приготовления геля необходимой прочности, прозрачности и электрофоретической подвижности ДНК для качественного учета результатов. При этом прочность и прозрачность гелей из агароз находится в обратнопропорциональной зависимости с подвижностью детектируемой ДНК. Испытанные гели из агароз других марок дают либо низкую прозрачность, либо высокую диффузию полос, что затрудняет учет результатов, повышает вероятность ошибок и ведет к повторному проведению анализа, т.е. удлинению и удорожанию анализа.

Технической задачей изобретения является увеличение числа способов электрофоретического детектирования продукта ПЦР за счет использования нового гелеобразователя.

Поставленная задача решается способом детектирования продукта ПЦР, включающим приготовление геля с использованием гелеобразователя и проведения электрофореза реакционной смеси в геле с последующим просмотром его в УФ-свете, при этом в качестве гелеобразователя используют агар, содержащий серы и азота не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, имеющий зольность не более 1,2%, прозрачность и прочность 1% геля не ниже 80% и 500 г/см², соответственно, а показатель ЭЭО составляет 0,34 ± 0,01.

Применение заявляемого агара с вышеприведенными характеристиками приводит к получению высокопрозрачного, прочного геля, обладающего высокой разрешающей способностью при разделении фрагментов ДНК, что позволяет использовать такой агар как гелеобразователь в предложенном способе детектирования продуктов ПЦР.

Агар представляет собой смесь двух полисахаридов: агарозы - линейного нейтрального галактанового гидроколлоида и агаропектина. Кроме этих двух основных компонентов природные агары содержат значительное количество неагаровых примесей органического и неорганического происхождения. Органические примеси, как правило, азотистые соединения (белки), а минеральные вещества представлены солями кальция, магния, железа, алюминия, сульфатами. В зависимости от степени очистки агар используется в пищевой, фармацевтической, текстильной, бумажной и других отраслях промышленности. Очищенный агар является незаменимым препаратом, используемым для приготовления питательных сред в микробиологии, для вирусологических, иммунологических и иммунохимических исследований, а также специальных исследований в области молекулярной биологии и генетики, генной инженерии и биотехнологии.

Существует большое количество марок агаров, отличающихся по своим свойствам из-за качества исходного сырья и применения различных способов его выделения. Так, для проведения вирусологических, иммунохимических, генетических и специальных бактериологических исследований агар должен быть максимально очищенным от всякого рода органических и минеральных загрязнений, что позволяет получить предельно осветленный, прозрачный и прочный гель. Для оценки качества агаров используют следующие показатели: содержание серы и азота, зольность, прозрачность и прочность образуемого ими геля, а также величина ЭЭО.

Увеличение содержания в агаре серы (более 0,3%) приводит к образованию геля, в котором вследствие выраженного эндоосмоса и адсорбции при электрофорезе искажается картина полос ДНК. Кроме того, повышенное содержание сульфатированных полисахаридов (повышенное содержание серы) вызывает гидролиз нуклеиновых кислот, что также ведет к снижению качества ЭЛЕКТРОФОРЕЗА и тем самым затрудняет идентификацию ДНК. Наличие сульфогрупп является также причиной низкой прочности и прозрачности агарового геля. Присутствие в агаре неагаровых примесей, характеризуемое зольностью, ведет к таким же последствиям, что и повышенное содержание серы (Rees D.A. "Advan. Carbohyd. Chem. - 1969. - N.25 - P.321 - 328).

Использование агара с более высоким показателем ЭЭО (выше 0,34) приводит к ухудшению разрешающей способности геля при электрофорезе, увеличивая диффузию и размытость полос.

В случае, если агар имеет показатель прочности геля ниже 500 г/см², это приводит к быстрому разрыву геля.

Температура плавления агара с вышеперечисленными свойствами составляет (34,0 ± 0,3)^oC (как и у высококачественных агароз), что позволяет использовать высокое напряжение (от 1- до 20 В/см), тем самым увеличивая подвижность ДНК и снижая диффузию полос, получая узкие полосы, в целом добиваясь минимального времени электрофореза (8-15') и высокой разрешающей способности при идентификации ДНК.

В России в настоящее время выпускают микробиологический агар (ГОСТ 17206-84), однако он оказался непригодным для вирусологических и иммунохимических исследований из-за своего токсического воздействия на клетки и ингибирующего действия на вирусы, а кроме того, он дает искаженную картину распределения белков по фракциям и число фракций (Н.П. Дмитриенко. Лабораторное дело, -1973, - N 6, с.378).

Данный агар, содержащий 3,5 ± 0,005% золы и 0,63 ± 0,0005% серы (в пересчете на SO₄^-2), имеющий прозрачность образованного им 1% геля 45 ± 0,7 и прочность 320 ± 5,7 г/см², оказался непригодным и в качестве электрофоретического геля для детектирования продуктов ПЦР, т.к. образует малопрочный гель с низкой прозрачностью и высокой диффузией полос, что дает искажение полос ДНК при облучении УФ-светом.

Зарубежными фирмами "Serva", "Difco", "Ferak" и др. выпускается несколько типов агаров для микробиологических исследований, имеющих следующие физико-химические показатели: агар "Difco"(США): прозрачность и прочность 1,5% геля 51 ± 0,6 300 ± 5,1 г/см², соответственно, зольность 1,86 ± 0,003%; содержание серы 0,91 ± 0,0004%; агар "Ferak" (ФРГ) имеет зольность 4,06% и прочность 1% геля 440 г/см². Также как и для российского микробиологического агара, картина, которую получают при их использовании в качестве электрофоретической среды для детектирования продуктов ПЦР, искажена: полосы ДНК широкие, не имеют четкой границы за счет высокой диффузии.

Таким образом, способ получения и степень очистки агара изменяют его физико-химические показатели, что приводит к изменению областей его использования. При этом не удалось обнаружить сведений об использовании именно агара для приготовления геля, используемого в качестве электрофоретического носителя для детектирования амплификационных продуктов ПЦР.

Сочетание заявляемых физико-химических показателей агара позволило впервые применить данный высокоочищенный агар в качестве гелеобразователя для целей детектирования продуктов ПЦР и заменить им чрезвычайно дорогие импортные агарозу и полиакриламид.

В основу способа получения агара с заявляемыми свойствами положен принцип последовательного удаления неагаровых примесей и фракций кислых полисахаридов для снижения в нем содержания высокосульфатированных молекулл. Способ представляет из себя цикл со строгой хронологической последовательностью этапов экстракций и коагулирования неагаровых примесей в градиенте pH, экстракции сульфатных групп, освобождения коагеля от коагулянта, желировании агара, удаления из геля агара растворимых в воде примесей с последующим его дегидрированием методом прессования и сублимационного высушивания (Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1997. -N 5, с. 101-104; Технологическая инструкция по изготовлению высокоочищенного агара в производственных условиях, N 95-90; Фармокопейная статья 42 - 359 ВС - 90).

Для оценки качества агара определение физико-химических показателей производили по следующим методикам: прочность, оптическую плотность, зольность и температуру застудневания геля агара проводили в соответствии с ГОСТ-26185-84; содержание общего азота по Нееслеру; серу определяли путем сжигания пробы в хлорной кислоте с последующим турбидиметрическим определением сульфат иона модифицированным методом Dodgson и Pricce (Biochim.biophys. Acta, v.86, p.l69, 1964); содержание неорганических химических примесей - с помощью атомно-абсорбционного спектрометра фирмы Hitachi; качественное определение на присутствие химических элементов осуществляли методом оптической эмиссионной спектроскопии в дуге постоянного тока; электроэндоосмос (ЭЭО) - в качестве маркеров определения использовали реополиглюкин с содержанием декстрана (молекулярной массой 30-40 тыс) и бычий сывороточный альбумин ("Методические указания по применению физико-химических и химических методов контроля медицинских биологических препаратов", 1982).

Для детекции использовали гель, приготовленный из высокоочищенного агара, имеющего следующие физико-химические показатели: зольность - 1,20 ± 0,002%, содержание серы - 0,29 ± 0,0002% (в пересчете на SO₄^-2), содержание кальция - 0,19 ± 0,0001%, магния 0,02 ± 0,00001%; железа -0,02 ± 0,00001%; показатель ЭЭО 0,34 ± 0,001, прочность 1% геля 650 г/см² и прозрачность 1% геля 82%.

В качестве красителя для окрашивания геля при электрофоретическом детектировании продуктов ПЦР используют различные интеркалирующие и флюоресцирующие красители, например бромистый этидий или акридиновый оранжевый (Sharp Р.А., Sugden В. и др. "Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilis parainfluenzae using analytical agarose ". Biochemistry, 1973. V.12, p. 3055).

Способ детектирования осуществляли методом электрофореза в агаровом геле на образцах, содержащих ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis и т.д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Детекцию продуктов амплификации проводят путем гельэлектрофореза реакционной смеси в окрашенном бромидом этидия 2% агаровом геле с последующим просмотром его в ультрафиолетовом свете. Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируют сравнением с положительным контролем, в котором содержалась ДНК Chlamydia trachomatis. В лунку для отрицательного контроля вместо образца вносят дистиллированную воду.

Обнаружение Chlamydia trachomatis проводят в четыре этапа:
а) приготовление агарового геля
Агаровый гель готовят на основе высокоочищенного агара, имеющего вышеприведенные показатели.

2 г агара растворяют в 98 мл буфера для электрофореза. Буфер состоит из 10,7 г Трис, 5,5 г борной кислоты, 4 мл 0,5 М ЭДТА на 1 литр дистиллированной воды, pH - 7,6. Агар вносят в буфер, доводят до кипения и полного растворения агара в буфере. Затем, после остывания геля до 50-60^oC вносят бромистый этидиум в конечной концентрации 5 мг в 1 мл. Готовый гель вместе с красителем заливают на пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют на 30 минут до застывания геля. Гребенки вынимают, промывают лунки электрофорезным буфером.

б) внесение образца
В лунки геля под буфер вносят по 7 мкл полученной после амплификации смеси из клинических образцов, положительного и отрицательного контроля. Пластину помещают в аппарат для электрофореза.

в) проведение электрофореза
Электрофорез проводят при напряжении 20 V/см в течение 10 минут (напряжение, устанавливаемое в блоке питания при расстоянии между электродами 10 см равно 200 V).

г) учет результатов
Вынимают гель из прибора для электрофореза и помещают его на стекло трансиллюминатора. При освещении геля ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. Наличие полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля? свидетельствует о том, что в клиническом образце присутствует искомая ДНК. При отсутствии такой полосы или ее размытости и смещении результат принимают за отрицательный или проводят повторное исследование.

Пример 2.

Определение присутствия Trichomonas vaginalis проводят аналогично вышеприведенному способу, за исключением того, что в качестве положительного контроля в лунку вносят ДНК Trichomonas vaginalis и дальше осуществляют определение аналогично примеру 1. Получают четкие линии, позволяющие их однозначное отнесение.

Таким образом, заявляемый способ детекции позволяет расширить объем исследований методом ПЦР в стране и снизить затраты на постановку этого метода за счет использования в качестве гелеобразователя агара с определенными характеристиками взамен дорогостоящей агарозы.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Может быть использовано для диагностики инфекционных заболеваний, иммунологических исследований. Для проведения электрофоретического разделения продуктов ПЦР используют гель, приготовленный из агара. При этом используют агар со следующими характеристиками: содержание серы и общего азота не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, зольность не превышает 1,2 мас.%. Полученный гель имеет прочность не ниже 500 г/см², а показатель ЭЭО - 0,34±0,01. Способ обеспечивает расширение ассортимента гелеобразователей и снижение затрат на его использование.

Способ детекции продукта полимеразной цепной реакции, включающий приготовление геля с использованием гелеобразователя и проведения электрофореза реакционной смеси в геле с последующими просмотром его в УФ-свете, отличающийся тем, что в качестве гелеобразователя используют агар, содержание серы и общего азота в котором не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, зольность не превышает 1,2 мас.%, прочность и прозрачность 1% геля не ниже 500 г/см² и 80% соответственно, а показатель ЭЭО составляет 0,34 ± 0,01.