Способ молекулярной диагностики мутаций в гене UL97 цитомегаловируса, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к ганцикловиру и валганцикловиру, у пациентов с подтвержденной цитомегаловирусной инфекцией Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12N1/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторной диагностике лекарственной устойчивости цитомегаловируса (ЦМВ) к ганцикловиру (ГЦВ) и валганцикловиру (ВГЦВ) у пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией.

Из уровня техники известны молекулярные методы определения нуклеотидных замен, связанных с устойчивостью к ГЦВ/ВГЦВ методом секвенирования. Данные нуклеотидные замены сгруппированы в консервативных областях гена UL97, преимущественно в кодонах 460, 520 и 590-607, и приводят к образованию неактивного в отношении ГЦВ/ВГЦВ фермента UL97 или фермента с низким уровнем активности. При выявлении данных мутаций необходимо проведение коррекции терапии: замена на альтернативные препараты (например, при выявлении мутаций H520Q, A594V, C603W, M460V, L595S) либо увеличение дозы ГЦВ (например, при выявлении мутаций С603S, C607F, C592G) (Chou S. Recombinant phenotyping of cytomegalovirus UL97 kinase sequence variants for ganciclovir resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(6): 2371-2378; El Chaer F., Shah D.P., Chemaly R.F. How I treat resistant cytomegalovirus infection in hematopoietic cell transplantation recipients. Blood. 2016; 128(23): 2624-2636.)

Однако, ранее описанные способы лабораторного определения мутаций лекарственной устойчивости ЦМВ у пациентов с подтвержденной цитомегаловирусной инфекцией являются дорогостоящими и трудновоспроизводимыми и нуждаются в существенной модификации методики выполнения этапов определения нуклеотидной последовательности гена UL97 цитомегаловируса (Keyvani H., Taghinezhad Saroukalaei S., Mohseni A.H. Assessment of the Human Cytomegalovirus UL97 Gene for Identification of Resistance to Ganciclovir in Iranian Immunosuppressed Patients. Jundishapur journal of microbiology, 2016; 9(5): e31733).

Технический результат заключается в модификации и оптимизации протокола лабораторного определения молекулярных маркеров лекарственной устойчивости цитомегаловируса к ГЦВ/ВГЦВ, в частности таких, как M460V, C592G, H520Q, A594V, L595S, C603S, на этапе амплификации фрагмента гена UL97 цитомегаловируса на основе изменения последовательности праймеров и условий температурного режима амплификации.

Технический результат достигается тем, что у пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией стандартным способом производят забор образцов крови и осуществляют: выделение ДНК ЦМВ; определение вирусной нагрузки ЦМВ; амплификацию фрагмента гена UL97, включающего кодоны 460, 520 и 590-607 с использованием следующих праймеров: acaacgtcacggtacatcga, gtcgtagtccaaactcgaga, cgacacgaggacatcttgg и различных температурных режимов; детекцию и визуализацию продуктов амплификации фрагмента гена UL97 ЦМВ, методом оценочного электрофореза; очистку продуктов амплификации; секвенирование фрагмента UL97 ЦМВ; анализ полученных результатов с определением генотипа фрагмента гена UL97 ЦМВ.

Способ осуществляется следующим образом. На первом этапе проводят экстракцию ДНК из крови пациентов. Выделение ДНК проводят с использованием набора реагентов «Магно-Сорб» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора», Россия), с помощью магнитоперемешивающей станциии KingFisher Flex. Согласно маркировке и числу экстрагируемых проб в 96-луночные планшеты вносят: по 760 мкл лизирующего раствора МАГНО-сорб в планшет с глубокими лунками; по 700 мкл раствора для отмывки 5 в два планшета с глубокими лунками; по 700 мкл раствора для отмывки 6 в планшет с глубокими лунками; по 200 мкл раствора для отмывки 7 в планшет с глубокими лунками; по 100 мкл буфера для элюции в планшет для элюции. В отдельной пробирке смешивают, из расчета на один образец: 10 мкл ВКО, 10 мкл компонента А, 20 мкл магнетизированной силики. Смесь готовят на общее число исследуемых и контрольных образцов. В лунки с лизирующим раствором МАГНО-сорб вносят по 40 мкл тщательно ресуспендированной смеси и по 200 мкл исследуемых образцов и контролей согласно маркировке. Выбирают и запускают протокол экстракции ДНК, по окончании которого планшет для элюции, содержащий очищенную ДНК, заклеивают самоклеящейся пленкой. На втором этапе с помощью набора реагентов «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-cкрин FL» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора», Россия) проводят определение вирусной нагрузки ЦМВ. Расчет производят исходя из того, что на каждую постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) идет: 10 мкл ПЦР-смеси-1-FRT EBV/CMV/HHV6/Glob, 5 мкл смеси ПЦР-смеси-2-FRT и 0,5 полимеразы (TaqF). Сначала делают расчет на необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и контрольных образцов, затем отбирают необходимое количество пробирок для амплификации исследуемых и контрольных образцов ДНК, раскапывают в пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси. В пробирки с реакционной смесью добавляют по 10 мкл исследуемой ДНК, полученной в результате экстракции из клинических или контрольных образцов. Для проведения количественного анализа вносят: а) отрицательный контроль ПЦР (К–) – в пробирку 10 мкл РНК-буфера; б) калибраторы KSG1 и KSG2 – в две пробирки по 10 мкл калибратора KSG1 и в две пробирки по 10 мкл калибратора KSG2. После этого проводят амплификацию с детекцией в режиме «реального времени», для чего пробирки устанавливают в реакционный модуль, прибор программируют для выполнения программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала по следующей последовательности: один цикл удержания температуры при 95°C в течение 15 мин; циклирование 1, включающее 5 циклов при температуре 95°C в течение 5 сек, при температуре 60°C в течение 20 сек и при температуре 72°C в течение 15 сек; циклирование 2, включающее 40 циклов при температуре 95°C в течение 5 сек, при температуре 60°C в течение 20 сек и при температуре 72°C в течение 15 сек, при этом на этапе достижения температуры 60°C проводят регистрацию интенсивности флуоресценции: зеленой – для определения FAM, желтой – JOE, оранжевой – ROX, красной – Cy5. Полученные кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», а также с помощью инструкций и приложений к ним компании производителя. При выявлении вирусной нагрузки в крови более 500-1000 копий вируса в мл проводят следующий этап – амплификация фрагмента гена UL97 ЦМВ с помощью двух реакций ПЦР (ПЦР I, ПЦР II). Во избежание контаминации проб сбор амплификационной смеси проводят в ламинарном шкафу. Перед проведением реакции готовят нужное количество пробирок типа «Эппендорф» объемом 0,2 мл и маркируют соответствующим образом: положительный (K+), отрицательный (K-) контроли и исследуемые пробы с указанием номеров проб. В расчете на одну пробирку используют следующие смеси для амплификации: готовая 5х qPCRmix-HS («Евроген», Россия) реакционная смесь 5 мкл, 50х dNTPs 0,1 мкл, праймеры для ПЦР I CMV-fov acaacgtcacggtacatcga (10мкМ), CMV-rew gtcgtagtccaaactcgaga (10мкМ) по 1 мкл, праймеры для ПЦР II CMV-fov acaacgtcacggtacatcga (10мкМ), CMV-rew2 cgacacgaggacatcttgg (10мкМ) по 1 мкл. В ПЦР I в качестве матрицы вносят 10 мкл ДНК ЦМВ исследуемого образца, в ПЦР II – вносят 1 мкл продукта амплификации ПЦР I. В качестве отрицательного контроля используют dH2O. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. ПЦР проводят в амплификаторе при следующих температурных режимах: для ПЦР I - 95°C в течение 5 мин, 32 цикла: 95°C в течение 10 сек, 55°C в течение 40 сек, 72°C в течение 60 сек и 72°C в течение 5 мин и для ПЦР II - 95°C в течение 5 мин, 5 циклов: 95°C в течение 10 сек, 64°C в течение 10 сек, 72°C в течение 30 сек, 25 циклов: 95°C в течение 10 сек, 60°C в течение 15 сек, 72°C в течение 30 сек и 72°C в течение 5 мин. Полученные продукты ПЦР II детектируют в 1% агарозном геле. Для приготовления 100 мл 1% агарозного геля к 1 г агарозы добавляют 10 мл трисборатного буфера (10×TBE) и 90 мл дистиллированной воды. Приготовленная смесь прогревается в СВЧ-печи до полного растворения агарозы, затем в нее добавляют 10 мкл бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл и перемешивают. Расплавленную агарозу охлаждают до температуры 50-60°C и заливают в планшет для заливки геля и оставляют для застывания при комнатной температуре на 15-30 мин. Для разделения продуктов амплификации ДНК фрагмента гена UL97 ЦМВ методом горизонтального электрофореза в камеру для горизонтального электрофореза заливают 1×TBE буфер, приготовленный разбавлением 10×TBE буфера дистиллированной водой. Планшет с агарозным гелем переносят в камеру для проведения электрофореза. 1×TBE буфер должен покрывать агарозный гель на 5-7 мм. Для электрофоретического анализа продуктов амплификации отбирают по 5 мкл смеси из каждой пробы, полученной в результате ПЦР II, смешивают с 1-2 мкл раствора, содержащего бромфеноловый синий, и наносят в карманы агарозного геля. Для установления точного размера продукта амплификации в один из карманов вносят маркер молекулярного веса ДНК в растворе, предназначенном для нанесения на гель (100 bp, GeneRuler). Затем электрофоретическую камеру подключают к источнику питания и задают напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществляют в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль над электрофоретическим разделением осуществляют визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2 см. После электрофореза агарозный гель фотографируют в трансиллюминаторе в коротковолновом УФ-свете (длина волны 254-310 нм). Если в дорожке, в которую был нанесен амплифицированный отрицательный контроль, отсутствует светящаяся полоска, а в дорожках, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам, реакция прошла специфично, и размер амплифицированного продукта соответствует ожидаемому, то данные продукты агарозного электрофореза подходят для дальнейшего осаждения продуктов амплификации ферментами. Для этого используют экзонуклеазу I E.Сoli и щелочную фосфатазу. Перед проведением реакции подготавливают и маркируют необходимое количество пробирок типа «Эппендорф» объемом 0,2 мл, готовят смесь ферментов, включающую следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку: 0,5 мкл экзонуклеазы (20 Ед в мкл) и 1 мкл фосфатазы (1 Ед в мкл). Далее смесь ферментов аккуратно перемешивают и центрифугируют на вортексе. Затем в каждую пробирку типа «Эппендорф» объемом 0,2 мл вносят по 1,5 мкл приготовленной смеси ферментов и по 5 мкл продуктов амплификации ПЦР II. Реакцию в амплификаторе проводят по следующему протоколу: 1) 37°C в течение 20 мин; 2) 90°C в течение 20 мин. Дальнейшая сиквенсовая реакция проводится с использованием коммерческого набора реагентов для секвенирования ДНК Big Dye Terminator v3.1 Sequencing RR-100. Перед проведением реакции подготавливают и маркируют необходимое количество пробирок типа «Эппендорф» объемом 0,2 мл. Затем готовят сиквенсовую амплификационную реакционную смесь, включающую следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку: 2 мкл Big Dye Terminator v3.1, 1 мкл 5Х буфера для Big Dye Terminator v3.1, 1мкл (3 мкМ) праймера и 5 мкл dH2O. В качестве праймеров для секвенирования используют праймеры CMVfor и CMVrew2. После приготовления смесь компонентов перемешивают и центрифугируют на вортексе. Затем в каждую пробирку типа «Эппендорф» объемом 0,2 мл вносят по 9 мкл приготовленной смеси компонентов и по 1 мкл очищенной ДНК. Сиквенсовую ПЦР проводят в амплификаторе при следующем температурном режиме: 96°C - 10 сек, 59°C - 5 сек и 60°C - 4 мин, с общим количеством циклов 25. Далее проводят очистку продуктов сиквенсовой ПЦР с использованием коммерческого набора реагентов X-Terminator, в который входят два реагента: SAM и сорбент X-Terminator. Перед проведением подготавливают и маркируют необходимое количество пробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. В пробирку добавляют по 10 мкл реагента X-Terminator, 45 мкл реагента SAM и сиквенсовый амплификат ДНК, смесь перемешивают 30 мин на шейкере и затем центрифугируют при 1200 об/мин в течение 2 мин. После проведенных этапов подготовки запускают процедуру электрофореза на приборе ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), для чего по 19 мкл dH2O и 1 мкл пробы добавляют в лунки планшета для проведения процедуры электрофореза и аккуратно перемешивают обычным пипетированием. Для запуска секвенатора планшет закрывают специальным ковриком, вставляют в держатель и помещают в прибор. Сбор данных, полученных при электрофоретическом разделении продуктов секвенирующей реакции производится при помощи программы Data Collection. Предварительные данные, собранные программой Data Collection, подвергаются дальнейшему анализу с помощью программы Sequencing Analysis, позволяющей оценить первичные данные и следующие параметры: общий уровень сигнала по каждому из четырех нуклеотидов (высота пиков), уровень фонового сигнала, степень достоверности идентификации (расшифровки) каждого нуклеотида в сиквенсе. Дальнейший анализ проводят с помощью программы nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). На втором этапе анализа сравнивают последовательности нуклеотидов с референсной последовательностью гена UL97 штамма Merlin с помощью программы Vector NTI либо на платформе MRA ulm Ульмского университета (Германия) (https://www.informatik.uni-ulm.de/ni/mitarbeiter/HKestler/mra/app/index.php?plugin=form).

Описанный способ подтверждается исследованием, проведенным в ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Поиск мутаций в гене UL97 провели у 72 пациентов с доказанной ЦМВ инфекцией и критериями возможной лекарственной резистентности к ГЦВ/ВГЦВ (прогредиентное или волнообразное увеличение вирусной нагрузки более 500 - 1000 копий/мл). Медиана возраста пациентов составила 8,5 лет (0 – 17 лет), соотношение мальчиков и девочек 2:1. В результате секвенирования нуклеотидных последовательностей гена UL97 у 19 пациентов (26,4%) было обнаружено 11 генотипов ЦМВ со следующими мутациями UL97: H520Q, C592G, A594V, L595S, D605E, C603W, C607Y, C607F, M615V, M460V и E655K. Самыми распространенными оказались мутации D605E и A594V, с частотой встречаемости 11% и 7% соответственно. У четырех пациентов были выявлены комплексные мутации.

Клинический пример 1. Пациент 5 лет с диагнозом: острый нелимфобластный лейкоз, М4-иммуновариант, t (9;11). Состояние после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) от гаплоидентичного донора с проведением TCRab/CD19 деплеции, повторной аллогенной ТГСК от HLA-совместимого неродственного донора. При проведении еженедельного ЦМВ мониторинга отмечалось развитие виремии до 4110 копий/мл (Фиг. 1). После назначения терапии ГЦВ отмечался рост вирусной нагрузки ЦМВ до 11700 копий/мл. В связи с вероятностью развития лекарственной устойчивости к ГЦВ было проведено генотипирование, по результатам которого мутации гена UL97 обнаружены не были, и терапия ГЦВ была продолжена, на фоне которой отмечалось снижение вирусной нагрузки. В связи с дальнейшим ростом числа копий ЦМВ было проведено повторное генотипирование, по результатам которого выявлена мутация C603W. Принимая во внимание высокий фенотипический потенциал резистентности к ГЦВ терапия была модифицирована на фоскарнет (ФОС). На фоне терапии ФОС отмечалось снижение вирусной нагрузки с достижением клиренса в течение 5 недель и возможностью отмены противовирусной терапии.

Клинический пример 2. Пациент 9 лет с диагнозом анемия Фанкони. Состояние после аллогенной ТГСК с проведением TCRab/CD19-деплеции от гаплоидентичного донора. При еженедельном мониторинге ЦМВ отмечено развитие виремии с уровнем ЦМВ в крови 1970 копий/мл, в связи с чем пациенту была назначена терапия ГЦВ (Фиг. 2). На фоне проводимой терапии ГЦВ отмечался волнообразный подъем вирусной нагрузки с последующим достижением отрицательных значений ЦМВ в крови и отменой терапии. В связи с повторным подъемом вирусной нагрузки ЦМВ было проведено генотипирование UL97, по результатам которого выявлена мутация L595S, ассоциированная с резистентностью к ГЦВ. Для дальнейшей терапии был назначен ФОС, на фоне которого отмечалось значимое снижение количества копий ЦМВ в крови. Повторное проведение генотипирования на фоне виремии ЦМВ 405 копий/мл вируса выявило новую мутацию M460V, ассоциированную с устойчивостью к ГЦВ, в связи с чем терапия ФОС была продолжена.

Исследование было проведено в соответствии с действующими нормативными-правовыми и этическими требованиями, предъявляемыми к клиническим исследованиям с участием детей (Федеральный закон «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 г. №323-ФЗ в действующей редакции, Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики») и одобрены Независимым этическим комитетом.

Таким образом, в данном клиническом исследовании отображена возможность применения продемонстрированного протокола исследования и получения достоверных и воспроизводимых результатов молекулярной диагностики маркеров лекарственной устойчивости ЦМВ к ГЦВ/ВГЦВ у пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией. Своевременное проведение данного генотипического исследования позволяет модифицировать противовирусную терапию пациентов в случае выявления маркеров лекарственной резистентности к ГЦВ/ВГЦВ.

Фиг. 1. Динамика вирусной нагрузки у пациента 5 лет на фоне еженедельного мониторинга ЦМВ. Выявленная мутация C603W и виды проводимой терапии обозначены цветом.

Фиг. 2. Динамика вирусной нагрузки у пациента 9 лет на фоне еженедельного мониторинга ЦМВ. Выявленные мутации L595S, M460V и виды проводимой терапии обозначены цветом.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лабораторной диагностике лекарственной устойчивости цитомегаловируса (ЦМВ) к ганцикловиру (ГЦВ) и валганцикловиру (ВГЦВ) у пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией. У пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией стандартным способом производят забор образца крови и осуществляют: выделение ДНК ЦМВ; определение вирусной нагрузки ЦМВ; амплификацию фрагмента гена UL97, включающего кодоны 460, 520 и 590-607, с использованием следующих праймеров: acaacgtcacggtacatcga, gtcgtagtccaaactcgaga, cgacacgaggacatcttgg и различных температурных режимов; детекцию и визуализацию продуктов амплификации фрагмента гена UL97 ЦМВ методом оценочного электрофореза; очистку продуктов амплификации; секвенирование фрагмента UL97 ЦМВ; анализ полученных результатов с определением генотипа фрагмента гена UL97 ЦМВ. 2 ил., 2 пр.

Способ молекулярной диагностики мутаций в гене UL97 цитомегаловируса, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к ганцикловиру и валганцикловиру, заключающийся в том, что у пациентов с подтвержденной цитомегаловирусной инфекцией стандартным способом производят забор образца крови и осуществляют: выделение ДНК ЦМВ; определение вирусной нагрузки ЦМВ; амплификацию фрагмента гена UL97, включающего кодоны 460, 520 и 590-607, с использованием следующих праймеров: acaacgtcacggtacatcga, gtcgtagtccaaactcgaga, cgacacgaggacatcttgg и различных температурных режимов; детекцию и визуализацию продуктов амплификации фрагмента гена UL97 ЦМВ методом оценочного электрофореза; очистку продуктов амплификации; секвенирование фрагмента UL97 ЦМВ; анализ полученных результатов с определением генотипа фрагмента гена UL97 ЦМВ.