СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ БЦЖ-М ДЛЯ ЩАДЯЩЕЙ ПЕРВИЧНОЙ ИММУНИЗАЦИИ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения вакцины с уменьшенной антигенной нагрузкой, предназначенной для щадящей специфической профилактики туберкулеза.

Для уменьшения поствакцинальных осложнений при применении живой вакцины следует добиваться наибольшего разрыва между показателями эффективности и реактогенности. Для вакцины БЦЖ это прежде всего уровень содержащихся в ней жизнеспособных микробных тел, гомогенность, дисперсность, которые определяют ее реактогенность и связанную с ней частоту поствакцинальных осложнений. (Л. А. Митинская, Л.И.Котова, А.В.Козлова и др. Профилактика осложнений вакцины БЦЖ у новорожденных. Проблемы туберкулеза. - М.: Медицина, 1986 г.).

Известен способ получения вакцины БЦЖ, применяемой для специфической профилактики туберкулеза, заключающийся в том, что микробную пленку культуры клеток БЦЖ-1, выращенную на твердой картофельной среде, а затем на жидких синтетических средах, снимают, фильтруют, растирают в шуттель-аппарате, после чего разводят стабилизатором - 1,5% раствором глутамината натрия до содержания 1 мг вакцины БЦЖ в 1 мл. Разведенную вакцину разливают в ампулы и лиофилизируют под вакуумом. (Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов / Под редакцией С.Д.Дзагурова и Ф.Ф.Резепова, издательство. - М.: Медицина, 1975 г., стр. 170).

Недостатком известного способа является то, что данная вакцина предназначена для специфической профилактики туберкулеза и одна ампула препарата содержит 1 мг вакцины БЦЖ в 1 мл, что составляет 20 доз, каждая по 0,05 мг препарата в 0,1 мл. Показатель жизнеспособности вакцины БЦЖ находится в пределах 10-30 млн/мг, одна прививочная доза содержит от 500000 до 1500000 жизнеспособных клеток. Это не позволяет использовать ее для щадящей первичной иммунизации детей группы повышенного риска с отягощенным постнатальным периодом (недоношенность, перинатальная энцефалопатия, гнойно-септическая инфекция).

Целью изобретения является создание вакцины для щадящей первичной иммунизации с уменьшенной антигенной нагрузкой, содержащей 0,5 мг БЦЖ в 1 мл и обладающей высокой жизнеспособностью, гомогенностью, дисперсностью и растворимостью.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения вакцины БЦЖ для щадящей первичной иммунизации, включающем фильтрацию микробной массы культуры БЦЖ-1, промывание средой высушивания, растирание в шуттель-аппарате до получения однородной массы, разведение стабилизатором и лиофилизацию в ампулах под вакуумом, разведение микробной массы стабилизатором после растирания в шуттель-аппарате проводят до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл, которую центрифугируют при 2000 об./мин в течение 15-20 мин, после чего проводят повторное разведение надосадочной взвеси стабилизатором до конечной концентрации 0,5 мг БЦЖ в 1 мл.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Вакцина, впервые полученная предлагаемым способом, предназначена для щадящей первичной иммунизации. Она содержит 0,5 мг БЦЖ в 1 мл, что составляет 20 доз, каждая по 0,025 мг препарата в 0,1 мл, обладает более высокими показателями жизнеспособности, гомогенности, дисперсности и растворимости.

Показатель жизнеспособности данной вакцины БЦЖ находится в пределах 20-30 млн/мг, одна прививочная доза содержит от 500000 до 750000 жизнеспособных клеток, что обеспечивает высокий уровень иммунологической активности препарата при меньшей его реактогенности и позволяет снизить частоту поствакцинальных осложнений.

Технический результат достигается за счет введения центрифугирования и проведения разведения в два этапа - до и после центрифугирования.

Способ осуществляется следующим образом.

Вакцина БЦЖ для щадящей первичной иммунизации (БЦЖ-М) представляет собой живые микробактерии вакцинного штамма БЦЖ-1, лиофилизированные в 1,5% растворе глутамината натрия. Живые микробактерии штамма БЦЖ-1, размножаясь в организме привитого, приводят к развитию длительного иммунитета к туберкулезу.

Для получения вакцины БЦЖ-М используют штамм БЦЖ-1, который должен отвечать следующим требованиям:
1. Состоять из жизнеспособных микробактерий штамма БЦЖ-1.

2. Не содержать вирулентных микробактерий.

3. Не содержать посторонней микрофлоры.

4. Обеспечивать выпуск вакцины БЦЖ-М с высокой протективной активностью.

5. Образовывать у 90-95% вакцинированных БЦЖ-М детей на месте прививки рубчик размером 2-10 мм в диаметре.

6. Вызывать длительную (3-5 лет) чувствительность к туберкулину и минимальное число неблагоприятных реакций у привитых (не более 0,06% лимфаденитов после вакцинации).

Высев из ампул со штаммом БЦЖ-1, полученным из ГИСК им. Л.А. Тарасовича, осуществляют на картофельную среду Павловского. На 20-25 сутки выращивания в термостате при (38 ± 1)^oC культуру БЦЖ-1 пересевают на жидкую среду Вакенгут, Козловской и Лещинской (ВКЛ) - матриксы N 1. Выросшую на 6-10 сутки на поверхности жидкой среды культуру БЦЖ-1 переносят ракеткой на поверхность свежей питательной среды ВКЛ - матриксы N 2.

Матриксы N 2 на 6-8 сутки роста используют для засева пленочным методом среды ВКЛ в производственных колбах, емкостью 0,5 л.

Вакцину изготавливают из культуры БЦЖ-1 11-ти суточного возраста, отбирая культуру с сухими морщинистыми пленками, покрывающими всю поверхность среды. Сглаженные, влажные и растущие отдельными островками пленки не пригодны для изготовления вакцины. Тщательно отобранную культуру БЦЖ-1 (12-15 колб) фильтруют в один аппарат для фильтрации. Микробные тела отделяют от питательной среды, промывают средой высушивания и охлаждают в холодильнике в течение 30 минут. Во время изготовления вакцина должна быть защищена от действия света. (А.И. Тогунова. Иммунизация живой вакциной против туберкулеза. - М.: Медгиз, 1960 г.).

Микробную массу растирают в бутыли с металлическими бусами в шуттель-аппарате при температуре от 10 до 18^oC в течение 20 минут при частоте 75 об. /мин до получения однородной массы. Далее микробную массу разводят стабилизатором до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл. Эту взвесь асептично переносят в стеклянные флаконы объемом 250 мл и центрифугируют при 2000 об./мин в течение 15-20 минут.

Надосадочную взвесь из флаконов асептично отсасывают и разводят средой высушивания (1,5% раствором глутамината натрия) до содержания 0,5 мг БЦЖ в 1 мл. Точность разведения проверяют по фотоэлектроколориметру. Вакцину разливают по 0,2 мл в ампулы и лиофилизируют.

Пример N 1.

Для получения концентрации 0,5 мг БЦЖ в 1 мл культуру штамма БЦЖ-1 высевают на плотную картофельную среду Павловского, выращивают в термостате 24 дня при температуре (38±1)^oC, пересевают на жидкую среду ВКЛ - 3 матрикса N 1. Выросшую на 7 сутки на поверхности жидкой среды культуру БЦЖ-1 переносят ракеткой на поверхность свежей питательной среды ВКЛ - 6 матриксов N 2.

Матриксы N 2 на 7 сутки роста используют для засева пленочным методом среды ВКЛ в 13 производственных колбах емкостью 0,5 л - таким образом производится накопление биомассы. Тщательно отобранную культуру БЦЖ-1 (12 колб) фильтруют, промывают средой высушивания и охлаждают в холодильнике в течение 30 минут.

Микробную массу растирают в бутыли с металлическими бусами в шуттель-аппарате до получения однородной массы при температуре 10^oC в течение 20 минут при частоте 75 об. /мин. Далее микробную массу разводят стабилизатором до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл, центрифугируют при 2000 об. /мин в течение 15 минут, разводят средой высушивания до содержания 0,5 мг БЦЖ в 1 мл, разливают по 0,2 мл в ампулы и лиофилизируют (табл. 1).

Пример N 2.

Вакцинацию проводили зашифрованными парными сериями препарата. 50% родившихся детей прививают вакциной БЦЖ-М (0,025 мг), а другие 50% - вакциной БЦЖ (0,05 мг). Серии вакцин приготовляют из одной маточной взвеси культуры БЦЖ с дифференцированной дозировкой (парные серии). В сроки 1, 3, 12 месяцев и 2-4 года изучают местную прививочную реакцию и через 1-1,5 года - чувствительность к туберкулину (табл. 2, 3).

Таким образом, как по результатам учета местной прививочной реакции, так и туберкулиновых проб отмечают, что уменьшенная в два раза доза препарата создает тот же уровень защиты от туберкулеза, как и полная доза, при менее выраженной реактогенности.

Анализ частоты послепрививочных осложнений при вакцинации в зависимости от числа жизнеспособных особей в препарате, а следовательно в прививочной дозе, свидетельствует об уменьшении в 3,3 раза числа осложнений в виде регионарных лимфаденитов при уменьшении антигенной нагрузки препарата.

Использование вакцины БЦЖ (0,025 мг) позволяет ежегодно увеличить на 7-8% охват этой прививкой новорожденных, так как с целью профилактики поствакцинальных регионарных лимфаденитов детям группы повышенного риска с отягощенным постнатальным периодом (недоношенность, перинатальная энцефалопатия, гнойно-септическая инфекция) проводят прививку вакциной БЦЖ (0,025 мг).

Таким образом, вакцина БЦЖ с уменьшенной антигенной нагрузкой создает тот же уровень защиты от туберкулеза, как и вакцина БЦЖ; использование вакцины БЦЖ (0,025 мг) позволяет ежегодно увеличивать охват этой прививкой новорожденных при сниженной в 3,3 раза частоте поствакцинальных осложнений.

Изобретение относится к медицине, касается способа получения вакцины БЦЖ-М для щадящей первичной иммунизации. Сущность изобретения: микробную массу культуры БЦЖ-1, выращенную на твердой картофельной среде, а затем на жидких синтетических средах, снимают, фильтруют, промывают средой высушивания, растирают в шуттель-аппарате до получения однородной массы, разводят стабилизатором до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл, которую центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 - 20 мин, после чего проводят повторно разведение надосадочной взвеси стабилизатором до конечной концентрации 0,5 мг БЦЖ в 1 мл. Вакцину разливают в ампулы и лиофилизируют. Технический результат заключается в повышении жизнеспособности вакцины в одной прививочной дозе. 3 табл.

Способ получения вакцины БЦЖ для щадящей первичной иммунизации, включающий фильтрацию микробной массы культуры БЦЖ-1, промывание средой высушивания, растирание в шуттель-аппарате до получения однородной массы, разведение стабилизатором и лиофилизацию в ампулах под вакуумом, отличающийся тем, что разведение микробной массы стабилизатором после растирания в шуттель-аппарате проводят до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл, которую центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 - 20 мин, после чего проводят повторное разведение надосадочной взвеси стабилизатором до конечной концентрации 0,5 мг БЦЖ в 1 мл.