СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ СТРЕПТОКОККОВОЙ Российский патент 2001 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения гиалуронидазы стрепрококковой бактериального происхождения, используемой при диагностике стрептококковых инфекций. Определение антигиалуронидазы в сыворотке крови используют для выявления скрыто протекающих форм ревмокардита, для оценки активности ревмокардического процесса, а также для дифференциации ревматизма от инфекционного полиартрита.

Известен способ получения гиалуронидазы стрепрококковой (А.с. N 173887, кл. МПК: C 12 N 9/26, 1965 г.), заключающийся в том, что культивируют штамм-продуцент гемолитического стрептококка "Китанин" на среде А.П.Конникова. Для выделения гиалуронидазы культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием или путем фильтрации через слой асбеста, производят обработку (фракционирование) фильтрата сернокислым аммонием в три стадии. Фильтраты выдерживают, после чего осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость еще раз обрабатывают сульфатом аммония. К полученным диализатам добавляют холестерин и в течение 15-20 минут встряхивают на шуттель-аппарате. Диализаты, обработанные холестерином, фильтруют и высушивают (из замороженного состояния) в вакуумном аппарате.

Однако известный способ имеет существенные недостатки. Используемый штамм "Китанин" продуцирует не только гиалуронидазу, но и другие ферменты, в связи с чем необходимо проведение трехкратного фракционирования фильтрата сернокислым аммонием. Это удлиняет и усложняет технологический процесс, приводит к потере активности фермента и снижению выхода готового препарата.

Целью предлагаемого изобретения является получение стандартного препарата с высокой активностью и минимальными потерями выхода готового препарата.

Сущность изобретения заключается в том, что фермент выделяют и концентрируют сернокислым аммонием, стерилизуют через систему "Миллипор" и стандартизируют, используя отраслевой стандартный образец антигиалуронидазы стрептококковой (ОСО АГС), приготовленный на основании тест-фермента, оттитрованного по международному стандарту активности гиалуронидазы тестикулярной.

Пример.

В четверти с комбинированным скарлатинозным бульоном (2 л) засевают 4-х часовую культуру гемолитического стрептококка группы А, IV типа, штамма N 6, выделенного от больного скарлатиной, продуцирующего только гиалуронидазу. Выращивание культуры производят при 37^oC в течение 18-24 часов.

Предварительно перед массовым засевом культуры ампулу со штаммом вскрывают и высевают на 5%-ный кровяной бульон и выращивают в течение 24 часов.

Затем культуру трех-пятикратно пассируют на комбинированном бульоне. Штамм при выращивании должен продуцировать гиалуронидазу не менее 500 МД HyS.

После 24-х часового выращивания и проверки культуры на чистоту культуральную жидкость отделяют путем фильтрации через систему "Миллипор".

К фильтрату добавляют заранее приготовленный сернокислый аммоний до 0,8% насыщения. Содержимое бутыли тщательно перемешивают до полного растворения сернокислого аммония и образования пленки фермента. Затем бутыли помещают в камеру при температуре (4±2)^oC на двое суток.

Отделение осадка гиалуронидазы из фильтрата производят на сепараторе АСГ-3 при 9000 оборотов в минуту.

Удаление сернокислого аммония из концентрата производят путем диализа против проточной водопроводной воды в течение двух суток. Активность гиалуронидазы определяют по ее способности препятствовать образованию сгустка гиалуроновой кислоты при добавлении уксусной кислоты.

При разведении концентрированного фермента получают препарат с активностью от 1000 до 20000 МД HyS в 1 мл.

Полученный фермент подвергают стерилизующей фильтрации через систему "Миллипор", стерилизующий фильтр 0,2 мкм, с минимальными потерями около 5% и сохранением исходной активности. После проведения контроля на стерильность и активность фермент лиофильно высушивают. Определение опытных доз гиалуронидазы производят со стандартной антигиалуронидазой ОСО.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоактивный стандартный препарат гиалуронидазы стрепрококковой с активностью до 20000 МД HyS в 1 мл с минимальными потерями выхода готового препарата до 5%.

Одной ампулы препарата достаточно для определения антигиалуронидазы в сыворотках от 5 до 20 больных.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения гиалуронидазы стрептококковой бактериального происхождения, используемой при диагностике стрептококковых инфекций. Способ заключается в том, что культивируют штамм-продуцент гемолитического стрептококка, выделенный от больного скарлатиной, продуцирующий только гиалуронидазу, трех - пятикратно пассируют на комбинированном скарлатинозном бульоне, культуральную жидкость отделяют фильтрацией через систему "Миллипор", к фильтрату добавляют сернокислый аммоний, тщательно перемешивают и выдерживают при температуре 4 ± 2°С. Отделение фермента производят на сепараторе при 9000 об/мин. Техническим результатом является получение высокоактивного стандартного препарата гиалуронидазы стрептококковой с активностью до 20000 МД HyS в 1 мл, сокращение и упрощение технологического процесса и повышение выхода готового препарата. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения гиалуронидазы стрептококковой, включающий культивирование штамма-продуцента гемолитического стрептококка, отделение культуральной жидкости путем фильтрации, обработку фильтрата сернокислым аммонием, отделение фермента из фильтрата и его высушивание, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм, выделенный от больного скарлатиной, продуцирующий только гиалуронидазу, культуру трех-пятикратно пассируют на комбинированном скарлатинозном бульоне, при этом штамм при выращивании должен продуцировать гиалуронидазу не менее 500 минимальных ферментативных доз (МД HyS), культуральную жидкость отделяют путем фильтрации через систему "Миллипор", к фильтрату добавляют сернокислый аммоний до 0,8% насыщения, тщательно перемешивают до образования пленки фермента и выдерживают при температуре (4 ± 2)°С, отделение фермента из фильтрата производят на сепараторе при 9000 об/мин, причем полученный концентрированный фермент при разведении обладает активностью от 1000 до 20000 МД HyS в 1 мл. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что различные разведения препарата подвергают стерилизующей фильтрации через систему "Миллипор" на фильтре 0,2 мкм.