СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОПРОЛИФЕРАТИВНОГО ФАКТОРА В ОРГАНИЗМЕ СТАРЕЮЩИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2204135C2

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни индивидуума.

В мозговой ткани стареющих млекопитающих (мышей) накапливается вещество, вызывающее активную пролиферацию клеток глии как в первично-трипсинизированных, так и в перевиваемых клеточных культурах [1-3] . Это вещество ("цитопролиферативный фактор") накапливается с возрастом животного и легко регистрируется в мозговых экстрактах уже после первой трети жизни данного вида. Концентрация этого фактора соответствует определенному этапу жизни данного организма (фиг.1). Цитопролиферативный фактор обладает видоспецифичностью (его активность регистрируется только в культуре сингенных клеток) и необычайно высокой термостабильностью (фиг.2).

Однако его определение до сих пор проводили только в мозговых экстрактах, т.е. после гибели животных.

Целью предлагаемого изобретения является прижизненное определение цитопролиферативного фактора у стареющих млекопитающих и человека.

Сущность изобретения заключается в том, что прижизненно берут сыворотку крови стареющих млекопитающих, прогревают ее в течение 30 мин при температуре 90о С, удаляют свернувшиеся белки путем центрифугирования, добавляют взвесь культуры клеток того же вида и инкубируют 3-4 дня при 37oС в атмосфере СО2 с последующим подсчетом клеток в камере Горяева.

Пример 1. Пробу крови мышей или человека в стерильной центрифужной пробирке помещают в термостат при 37oС на 30 мин, после чего образовавшийся сгусток обводят и центрифугируют при 2000 об./мин 15 мин. Сыворотку отсасывают, разводят раствором Хэнкса в 10 раз и прогревают на водяной бане при 90о С в течение 30 мин. Свернувшиеся белки осаждают центрифугированием при 12000 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и в ней определяют активность цитопролиферативного фактора на культуре клеток мышей или человека.

Пример 2. В стерильных пробирках готовят разведения уже прогретых 30 мин при 90oС и отцентрифугированных при 12000 об./мин сывороток мышей разного возраста. В каждую пробирку добавляют взвесь культуры мышиных клеток ЭПНТ - 5 в ростовой среде следующего состава: среда Игла Д-МЕМ+10% эмбриональной телячьей сыворотки +3% глутамина + антибиотики. Взвесь клеток добавляют из расчета конечной их концентрации в пробирках по 50 тыс. в 1 мл и разливают по лункам в 24-луночные стерильные планшеты с крышками. Через 96 ч инкубации при температуре 37oС в атмосфере СО2 культуральную жидкость удаляют, в лунки добавляют по 1 мл 0,2% раствора версена и после пипетирования в каждой лунке подсчитывают количество клеток с помощью камеры Горяева (фиг. 3).

В прогретых сыворотках стареющих мышей обнаруживается цитопролиферативный фактор в концентрации, сходной с таковой в мозговых экстрактах старых мышей. Вместе с тем ни в сыворотке человека, ни в сыворотке кролика, ни в сыворотке молодой мыши подобная активность на клетках мышей не регистрируется.

Пример 3. В стерильных пробирках готовят разведения уже прогретых 30 мин при 90oС и отцентрифугированных при 12000 об./мин сывороток людей разного возраста. В каждую пробирку добавляют взвесь культуры клеток человека L41 в ростовой среде приведенного выше состава. Взвесь клеток добавляют из расчета конечной их концентрации в пробирках по 50 тыс. в 1 мл и разливают по лункам в 24-луночные стерильные планшеты с крышками. Через 72 ч инкубации в атмосфере CO2 и при температуре 37oС культуральную жидкость удаляют, в лунки добавляют по 1 мл 0,2% раствора версена и после пипетирования в каждой лунке подсчитывают количество клеток с помощью камеры Горяева (фиг.4).

В прогретых сыворотках стареющих людей постепенно накапливается цитопролиферативный фактор, проявляющийся лишь в культуре клеток человека, в то время как ни в мозговом экстракте, ни в гретой сыворотке стареющих мышей подобная активность на клетках человека не только не регистрируется, но их добавление даже вызывает некоторый ингибирующий эффект на процесс клеточного размножения ксеногенных клеток.

Таким образом, предлагаемый способ жесткого предварительного прогревания и последующего центрифугирования сывороток стареющих млекопитающих и человека позволяет удалить белки, экранирующие активность цитопролиферативного фактора, и выявить в обработанных подобным образом сыворотках (при их испытании в культуре сингенных клеток) накопление цитопролиферативного фактора, сходного с тем, который обнаруживается в мозговых экстрактах стареющих млекопитающих.

Литература
1. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С. И. , Халанский А. С. Возможная роль пролиферативной активности глии в повреждении и гибели нейронов в процессе старения//В кн.: "Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии". Материалы Второй Российской конференции 18-20 октября 1999 г. -М., 1999.-С.45-51.

2. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С. И. , Халанский А. С. - Накопление в стареющем мозге млекопитающих фактора, резко стимулирующего пролиферативную активность глии//Бюл. эксперим. биол. и мед.-2000.-Т.129.- 3.-С.317-320.

3. Zuev V.A., Victorov I.V., Borodina N.P., Iqnatova N.G., Khalanski A. S. - Gliosis possible main factor of the neuronal death in the brain ageing//Уcnexи геронтологии-2000.- 5.-С. 92.

Похожие патенты RU2204135C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОПРОЛИФЕРАТИВНОГО ФАКТОРА (ФАКТОРА СТАРЕНИЯ) У ЖИВОТНЫХ 2017
  • Устрехов Александр Ильич
  • Зуев Виктор Абрамович
RU2658427C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУРЫ LISTERIA MONOCYTOGENES 2001
  • Ермолаева С.А.
  • Карпова Т.И.
  • Тартаковский И.С.
  • Вазкес Боланд Хосе Антонио
RU2196827C1
МАЗЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПИОДЕРМИЙ 1999
  • Толовская К.Р.
  • Чернуха М.Ю.
  • Акатов А.К.
RU2169554C1
ГЕЛЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН 1999
  • Толовская К.Р.
  • Чернуха М.Ю.
  • Акатов А.К.
RU2169553C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ БЦЖ "ИМУРОН" ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ 1999
  • Исачкова И.П.
  • Сазонова А.М.
RU2170103C1
СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТЕГРАЦИОННОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 2008
  • Миллер Галина Генриховна
  • Раковская Ирина Валентиновна
  • Покидышева Лидия Николаевна
  • Титова Ирина Викторовна
RU2370536C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ СТРЕПТОКОККОВОЙ 2000
  • Малофеева Т.П.
RU2174557C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ 2000
  • Кирилличева Г.Б.
  • Соловьева М.С.
  • Пронин А.В.
RU2175135C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ БЦЖ-М ДЛЯ ЩАДЯЩЕЙ ПЕРВИЧНОЙ ИММУНИЗАЦИИ 2000
  • Нестеренко Л.А.
RU2170588C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ 2009
  • Каражас Наталия Владимировна
  • Рыбалкина Татьяна Николаевна
RU2396087C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 204 135 C2

Реферат патента 2003 года СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОПРОЛИФЕРАТИВНОГО ФАКТОРА В ОРГАНИЗМЕ СТАРЕЮЩИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни индивидуума. Способ заключается в предварительном прогревании проб сыворотки при 90oС в течение 30 мин, осаждении свернувшихся белков центрифугированием и внесении надосадочной жидкости в культуру сингенных клеток с последующей их инкубацией 72-96 ч при 37oС в атмосфере СО2 и подсчетом клеток после инкубирования. Способ позволяет определить наличие цитопролиферативного фактора в организме млекопитающих при их жизни. 4 ил.

Формула изобретения RU 2 204 135 C2

Способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека, характеризующийся тем, что прижизненно берут сыворотку крови, прогревают ее 30 мин при 90oС, центрифугируют для удаления свернувшихся белков, добавляют к надосадочной жидкости сингенные клетки в виде первичных или перевиваемых культур и инкубируют 72-96 ч при 37oС в атмосфере СO2 с последующим подсчетом клеток в камере Горяева.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2003 года RU2204135C2

ЗУЕВ В.А
и др
Накопление в стареющем мозге млекопитающих фактора, резко стимулирующего пролиферативную активность глии
Бюллетень эксперим
биол
и мед., 2000, т
Способ применения резонанс конденсатора, подключенного известным уже образом параллельно к обмотке трансформатора, дающего напряжение на анод генераторных ламп 1922
  • Минц А.Л.
SU129A1
Приспособление для обрезывания караваев теста 1921
  • Павперов А.А.
SU317A1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА 1998
  • Фокин В.Ф.
  • Пономарева Н.В.
RU2135077C1
СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗРУШЕНИЯ КОЛЛАГЕНА IN VIVO И НАБОРЫ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБОВ, ГИБРИДОМА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО И ЕГО ФРАГМЕНТ, ПЕПТИДЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ КОЛЛАГЕНА, И СПОСОБ АНАЛИЗА 1990
  • Дэвид Р.Айр
RU2139541C1

RU 2 204 135 C2

Авторы

Зуев В.А.

Игнатова Н.Г.

Даты

2003-05-10Публикация

2001-07-19Подача