СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЙ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/50 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и предназначено для ранней диагностики злокачественных новообразований центральной нервной системы (ЦНС).

Распространенность опухолей ЦНС составляет около 7% от общего числа новообразований [5] . Из всех опухолей головного мозга 45-50% представлены глиомами, половина которых злокачественна. По сведениям ряда авторов [5, 11, 18] , многие доброкачественные глиомы могут в последующем переходить в злокачественную форму.

Классификация опухолей ЦНС, основанная на продолжительности жизни пациента после проведенного лечение [15, 18], принята следующая:
1) доброкачественные опухоли: характерно полное излечение или продолжительность жизни больного составляет более пяти лет (как правило, этими опухолями являются невриномы, менингиомы, краниофарингиомы, аденомы гипофиза, мозжечковые астроцитомы и эпиндиомы);
2) полудоброкачественные опухоли: продолжительность жизни больного от 3 до 5 лет (примером служат астроцитомы, олигодендроглиомы, эпендиомы, аденома гипофиза полиморфная);
3) полузлокачественные опухоли: продолжительность жизни пациента 2-3 года (примером являются: полиморфные астроцитома и олигодендроглиома, эпиндиомы, менингиомы и невриномы с множественными митозами);
4) злокачественные опухоли: продолжительность жизни 6-15 месяцев (например, глиобластомы, медуллобластомы, саркомы).

Приведенные сведения показывают, что глиальные опухоли (астроцитомы, олигодендроглиомы) занимают промежуточное положение между доброкачественными и злокачественными опухолями центральной нервной системы. Именно поэтому представляется важной для практической медицины разработка подходов к надежному прогнозированию их возможного озлокачествления [18].

В настоящее время показана важная роль гетерополисахаридов из класса гликозаминогликанов (ГАГ) в процессах клеточной пролиферации [6, 7, 8, 19] и дифференцировки [9]. В литературе имеются отдельные сведения о сопряженности системы ГАГ [1, 2] с процессами опухолевого роста, в том числе об изменении их общего содержания в сыворотке крови при онкологических заболеваниях [2, 3, 12, 15, 16].

Прототипом изобретения является иммунохимический способ диагностики злокачественных глиальных опухолей ЦНС [4] , заключающийся в определении уровня специфического α₁- глобулина мозга (C α₁- ГМ) и аутоантител к нему. Антиген C α₁- ГМ содержится в высокой концентрации в глиальных опухолях, при нарушении гематоэнцефалического барьера с деструкцией мозговой и опухолевой ткани попадает в кровь, где вызывает аутоиммунизацию организма, сопровождающуюся появлением антител. Вместе с тем этому способу диагностики опухолей ЦНС в сыворотке крови присущи существенные недостатки, а именно: предлагаемый тест трудоемок и специфичен только для злокачественных опухолей глиального ряда.

Технический результат предлагаемого способа - надежность прогноза и доступность выполнения анализа в условиях стандартной клинико-биохимической лаборатории.

Способ осуществляется следующим образом. В основу методики определения концентрации и фракционного состава ГАГ в малых количествах сыворотки крови (3-4 мл) положен известный метод извлечения протеогликанов ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе или DEAE-сефагеле, уравновешенных концентрированным раствором мочевины с детергентом [14, 17]. Применение неионогенного детергента Тритон X 100 при хроматографическом разделении помогает поддерживать ГАГ в дезагрегированном состоянии, а мочевина выступает денатурирующим белки реагентом. Методика позволяет избежать потерь анализируемых ГАГ и определять их в микроколичествах даже в присутствии 100-, 200-кратного избытка белков [17].

Описание метода. К сыворотке крови объемом 3-4 мл добавляют до конечной концентрации Трис-HCl буфер 0,1 M pH 7,8 ЭДТА, динатриевая соль 0,025М, Na-додецилсульфат 0,5% (SDS), фермент протеиназа К V302B - (активность Sp. Act > 30 u/mg) 100 мкг/мл. Протеолитическое расщепление белков сыворотки крови проводят в течение 4 ч при 37-42^oC и 2 ч при 50-55^oC. Затем сыворотку разбавляют 5-кратным объемом буфера А pH 6,5; содержащего РМ-мочевину - 0,05М Трис-HCl и 0,5% Тритон X 100. Вместо буфера А можно использовать другой - Б (pH 6,0): 8М мочевина, 0,05М ацетат Na, 0,05% Тритон X 100. Диализ сыворотки против буферных растворов проводить не рекомендуется, так как в некоторых случаях наблюдается превращение сыворотки в желатиноподобный продукт, не растворимый в воде.

Подготовка хроматографической колонки (объем 5,5 см³ высота 70 мм, диаметр 10 мм) заключается в заполнении ее высокопроточной DEAE-целлюлозой, уравновешенной буфером А. Для этого подготовленный образец сыворотки, разбавленный буфером А, закачивают в колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,2-0,5 мл/мин. Белки сыворотки вымывают буфером А, осуществляя контроль значений оптической плотности на спектрофотометре против буферного раствора при λ =280 нм или λ =290 нм в случае использования буфера Б, содержащего 8М мочевину.

После депротеинизации образца буфер А удаляют из колонки промыванием DEAE-целлюлозы несколькими объемами дистиллированной воды, контролируя оптическую плотность выходящего из колонки раствора при λ =220 нм. После полного удаления буфера приступают к препаративному разделению ГАГ либо в градиенте концентрации раствора NaCl, либо ступенчатой элюацией растворами NaCl различной концентрации. По нашим данным 0,15M раствором NaCl элюируются гликопротеины, 0,39М NaCl - гиалуроновая кислота (ГК), 0,9-1M NaCI - хондроитинсульфаты (ХС), 2М NaCl - гепарин и гепарансульфаты (ГС). Классы ГАГ идентифицируют по форетическому пробегу на ацетатцеллюлозной бумаге и метахроматическому окрашиванию толуидиновым синим и алциановым голубым [13].

Каждую из трех фракций ГАГ собирают в стакан, упаривают досуха, затем растворяют в известном объеме воды (обычно 1-2 мл), отбирают аликвоту полученного раствора для количественного определения реакции Дише на уроновые кислоты в присутствии карбазола [14]. Реакцию Дише для построения калибровочного графика проводят с использованием раствора d- глюкуроновой кислоты в насыщенном растворе NaCl.

Использованная методика была осуществлена в условиях нейрохирургического отделения Республиканской клинической больницы (РКБ) имени Г.Г. Куватова. Был обследован 131 пациент с полудоброкачественными и доброкачественными опухолями головного мозга - астроцитомой и менингномами - в следующие сроки: до оперативного вмешательства, в ближайшие дни после оперативного вмешательства (10-12 сутки), в отдаленный послеоперационный период (10-12 месяцев). Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц. В опытной и контрольной группах определяли уровень ГАГ и их фракций: хондроитинсульфатов (ХС), гепарансульфатов (ГС) и гиалуроновой кислоты (ГК). Результаты исследований представлены в таблице. Содержание ГАГ до оперативного вмешательства у лиц с верифицированной астроцитомой в сыворотке крови были ниже нормы в 2 раза. При этом показатели ХС снизились в 3,2 раза, а фракция гепарансульфатов была обнаружена в следовых количествах.

В послеоперационном периоде на десятые сутки отмечалось увеличение концентрации ГАГ на 9%. Уровень ГК приблизился к показателям нормы. Доля ХС уменьшилась в 1,2 раза относительно их содержания до оперативного вмешательства. Через 1 год показатели оставались ниже значений контрольной группы: ГАГ в 1,7 раза, ХС в 3,6 раза и ГС в 2,9 раза. При сравнении с группой лиц до оперативного вмешательства отмечалось увеличение ГС на 160%.

Изучение биохимических показателей группы пациентов с менингиомами установлено, что содержание ГАГ в сыворотке крови до оперативного вмешательства было в 2,4 раза меньше нормы, ГК - в 1,3 раза, ХС - в 7,7 раза и ГС - в 27,7 раза. Через десять суток уровень ГАГ достигал 50% от нормального, но был в 1,2 раза больше, чем до оперативного вмешательства. Содержание ХС составляло 30% от контрольных значений и в 2,7 раза больше, чем до операции. Уровень ГС в этот период был в 3 раза меньше, чем в контрольной группе и в 9 раз больше, чем в дооперационный период. В отдаленные сроки через год содержание ГАГ составляло 59% от контрольных значений. Концентрация ГК в это время находилась в пределах нормы, а содержание ХС и ГС соответственно было в 3,6 и 2,1 раза ее ниже.

По сравнению с показателями до оперативного вмешательства уровни ГАГ и ГК выросли в 1,4 раза, а ХС и ГС увеличились в 2,1 и 13,2 раза соответственно.

При сопоставлении данных двух групп с различными опухолями головного мозга - астроцитомой и менингиомой, отмечается низкое содержание или полное отсутствие гепарансульфатов в сыворотке крови после радикальной операции в течение длительного времени, что, однако, не исключает в дальнейшем рецидив опухолевой болезни.

Таким образом, для опухолей ЦНС с высокой вероятностью озлокачествления характерно снижение содержания ГАГ в сыворотке крови в 2-2,5 раза, а также хондроитин- и гепарансульфатов в 3,5 и 100 раз соответственно.

Пример 1. Б-я К-ва, 1947 г. р., история болезни N 100419 обратилась в поликлинику РКБ с жалобами на головные боли, головокружение, слабость и эпилептические приступы. Из анамнеза известно, что болеет около трех лет. Резкое ухудшение состояния отмечает с октября 1997 г.: на фоне приема антиконвульсантов участились приступы. По данным компьютерной томографии (КГ) головного мозга в ноябре 1997 г. была выявлена опухоль левой височной области размером 3,0x1,8 см. При осмотре отоневролога была выявлена негрубая вестибулярная асимметрия, гипертензионных указаний не было. Исследование глазного дна показало следующие изменения: диски с гомогенным оттенком больше слева, границы слева нечеткие, вены умеренно инъецированы, поля зрения концентрически сужены с нижнеквадратантным битемпоральным уклоном. Заключение электроэнцефалографии (ЭЭГ): очаг медленной эпилептической активности в левой височной области. Были отмечены следующие неврологические изменения: элементы моторной афазии, справа анизокория, оживление сухожильных и периостальных рефлексов и положительная проба Барре, нечеткие патологические с обеих сторон, в позе Ромберга покачивание, координационные пробы удовлетворительные. После проведенного обследования был выставлен диагноз: опухоль левой височной доли головного мозга с эписиндромом. Данные исследования сыворотки крови до оперативного вмешательства: суммарные ГАГ 35,6 мкмоль/л, ГК 22,7 мкмоль/л, ХС 12,9 мкмоль/л, ГС < 0,5 мкмоль/л.

13.01.98 г. была выполнена операция: краниотомия в левой височной области с тотальным удалением опухоли головного мозга. Гистологически верифицирована менинготелиоматозная менингиома (N 2412-21/10 от 16.01.98). В послеоперационном периоде рана зажила первичным натяжением. На десятые сутки была взята сыворотка крови, где определены суммарные ГАГ 64,9 мкмоль/л, и фракции: ГК 22,2 мкмоль/л, ХС 42,7 мкмоль/л, ГС < 0,5 мкмоль/л. Неврологически сохранялся легкий правосторонний гемипарез и менингиальные знаки.

Через год при амбулаторном обследовании больной состояние удовлетворительное, жалоб на эпиприступы не предъявляет, отмечает периодически головные боли при перемене погоды. Неврологически: зрачки равные, реакция на свет сохранена, сухожильные и периостальные рефлексы без особой разницы сторон, менингиальные знаки отрицательны, чувствительных и двигательных расстройств нет. Отоневрологически выявляется легкая вестибулярная асимметрия без гипертензионых указаний. На глазном дне диски ярко-розовые, границы четкие, артерии узкие, вены широкие и извитые. Сетчатка прозрачна, поля зрения в норме. По данным МРТ головного мозга от 16 января 1999 года: состояние после оперативного вмешательства, рубцово-атрофический процесс, данных за рецидив опухоли нет. При исследовании сыворотке крови определяются суммарные ГАГ 77,8 мкмоль/л, ГК 61,9 мкмоль/л, ХС 13,4 мкмоль/л, ГС 2,5 мкмоль/л.

Пример 2. Б-ная Л-а, 1964 г.р., история болезни N 113689 обратилась в поликлинику РКБ с жалобами на частые эпиприступы на фоне приема антиконвульсантов, головные боли, головокружение и общую слабость. Из анамнеза известно, что первый приступ был в 14 лет. Длительное время наблюдалась у невролога, принимала антиконвульсанты. Проведено обследование в условиях стационара: ангиография слева: отмечается смещение ПМА вправо. Заключение ЭЭГ: диффузные общемозговые изменения электроактивности без четких признаков полушарной асимметрии, дисфункция срединных стволовых образований с патологической активностью в левой височной области. При отоневрологическом исследовании выявляется межполушарная асимметрия по супратенториальному типу без внутричерепной гипертензии. Заключение окулиста: на глазном дне диски с гомогенным оттенком, границы ясные, артефиолы сетчатки узковаты; поля зрения в норме. При КТ исследовании головного мозга от 20.10.97 г.: кистозное образование в левой височной доли головного мозга размером 4,5x3,8x4 см со смещением срединных структур вправо. Магнитно-резонасная томография (МРТ) головного мозга от 6.11.97 г.: в режимах Т₁ и Т₂ определяется очаг по заднему контуру кистозного образования с незначительным смещением левой средней мозговой артерии. Неврологически определялись сглаженность левой носо-губной складки, девиации языка влево, менингиальные знаки отрицательны, справа сухожильные и периостальные рефлексы оживлены, чувствительных расстройств нет. После проведенных обследований был выставлен диагноз: опухоль левой височной доли головного мозга с кистозным компонентом, эписиндром. Данные исследования сыворотки крови: суммарные ГАГ 40,7 мкмоль/л, ГК 15,5 мкмоль/л, ХС 25,2 мкмоль/л и ГС < 0,5 мкмоль/л.

11.12.1997 г. проведено оперативное вмешательство - краниотомия в левой теменно-височной области с вскрытием кисты и удалением опухолевого узла. Гистологически верифицирована гигантоклеточная астроцитома (N 59230-32/3 от 17/12.97 г. ). Рана зажила первичным натяжением, послеоперационный период протекал без особенностей. Суммарные ГАГ в сыворотке крови составили на десятые сутки 42,9 мкмоль/л, ГК 33,1 мкмоль/л, ХС 9,8 мкмоль/л и ГС < 0,5 мкмоль/л.

Через год при амбулаторном обследовании больная жалоб не предъявляет. Со стороны глазного дна диски бледно-розового цвета, артерии и артериолы извиты, вены гипотоничные, широкие, сетчатка прозрачна. Отоневрологически сохраняется легкая межполушарная асимметрия по супратенориальному типу, гипертензии нет. Неврологически определяются оживленные рефлексы справа, патологических знаков и чувствительных расстройств не отмечается, менингиальные знаки отрицательны. КТ головного мозга от 13.02.99: состояние после оперативного вмешательства, срединные структуры не смещены, данных за рецидив нет. При исследовании сыворотки крови суммарные ГАГ 63,9 мкмоль/л, ГК 39,7 мкмоль/л, ХС 24,2 мкмоль/л и ГС оставались < 0,5 мкмоль/л.

Пример 3. Б-ной Ф-в 1939 г.р., истории болезни N 102424 обратился в поликлинику РКБ с жалобами на головные боли, головокружение, слабость в правых конечностях и эпиприступы. Из анамнеза известно, что в 1996 г. оперирован в нейрохирургическом отделении по поводу опухоли головного мозга (гистологически верифицирована анаплазированная астроцитома с диффузным ростом, ст. анаплазии 2 - N 1625 от 5.01.1996 г.), прошел курс гамма-терапии 50 Гр. При обследовании на КТ головного мозга от 10.02.98 в левой теменно-височной области определяется зона низкой плотности размером 2,5x1,3 см с периферическим отеком, не исключается рецидив опухоли. Отоневрологически: супратенториальная симптоматика с заинтересованностью базальных отделов левой гемисферы, поражением оптомоторных путей, гипертензия. Заключение окулиста: со стороны глазного дна диски умеренно гипермированы, границы с височной стороны четкие, с носовой нечеткие более слева. Вены умеренно инъецированы, артерии сужены, сетчатка мутновата. На ЭЭГ определялась эпилептическая активность с преобладанием патологии в левой гемисфере без четкой очаговой локализации. Неврологически отмечалась сглаженность правой носогубной складки, девиация языка вправо, правосторонний гемипарез с положительными патологическими знаками. При исследовании сыворотки крови суммарные ГАГ составили 77,3 мкмоль/л, ГК 60,3 мкмоль/л, ХС 17,0 мкмоль/л и ГС < 0,5 мкмоль/л. Учитывая данные проведенных обследований, жалобы и неврологический статус, был выставлен диагноз: состояние после краниотомии (1996 г.) с субтотальным удалением опухоли левой височной доли головного мозга, гамма-терапии (1996 г) - рецидив опухоли.

3.03.98 г. произведена ретрепанация в левой теменно-височной области с субтотальным удалением опухоли головного мозга. Гистологически опухоль верифицирована как анаплазированная астроцитома, ст. анаплазии 2, с проявлением лучевого патоморфоза (N 11586-90/5 от 10.03.98). Рана зажила первичным натяжением, в послеоперационном периоде осложнений отмечено не было. При исследовании сыворотки крови суммарные ГАГ составили 82,5 мкмоль/л, ГК 59,8 мкмоль/л, ХС 22,7 мкмоль/л и ГС < 0,5 мкмоль/л.

Литература.

1. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска. -М.: Наука, 1986. -с. 368.

2. Башкатов С. А. Гликозаминогликаны в механизмах адаптации организма. -Уфа: Изд-е Башкирск. ун-та, 1996. - 144 с.

3. Лабори Г. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты). -М.: Медицина, 1970. -384 с.

4. Обухов С.К. Изучение специфического α₁- глобулина мозга при глиальных опухолях. Вопросы нейрохирургии, 1985 г., 4 вып., с. 43 - 47.

5. Пастор Э. Основы нейрохирургии. Будапешт 1985. - 280 с.

6. Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П. Регенерация тканей при экстремальных воздействиях на организм. - Екатеринбург, 1993. -187 с.

7. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология). -М.: Медицина, 1981. -312 с.

8. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л.: Медицина, 1969. -376 с.

9. Тиунов Л.А. Биохимические механизмы адаптации и компенсации нарушенных функций при действии на организм химических веществ //Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство /Под ред. Д.С. Саркисова. -М.: Медицина, 1987. -С. 366-381.

10. Шараев П. Н. , Иванов В.Г., Рябов В.И. и др. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани. -Ижевск, 1989. -15 с.

11. Afra, D. , Muller, W., Benozit, G., Schroder, R.: Supratentorial recurrences of gliomas. Results of reoperation on astrocytornas and oligodendrogtiomas. Acta Neurochir. 43:1978.

12. Bertolotto A., et al: Biochemical, histochemical and immunohistochemical stady of glycosaminoglycans in human meningiomas. Basic Appl Histochem. 1989; 33(3).

13. Cappelletti R., Del Rosso М, and Chiarugi V.P.. A new electrophoretic method for the complete separation of all known animal glycosaminoglicans in a monodimensional run. Analyt. Biochem., 1979, 99, pp. 311-315.

14. Chaplin Ed., Kennedy I.F, Carbohydrate analysis Oxford, 1986.

15. Delpech B., et al: Hyaluronan and hyaluronectin in the extracellular matrix of human brain tumor stroma. Eur J. Cancer 1993, 29A (7).

16. Engelhardt A., et al; Detection of acid mucopolysaccharides in human brain tumors by histochemical methods. Acta Neuropathol. (Berl) 1980, 49(3).

17. Harper G.S., O'Shannessy D.J., Gahl W.A Analyt. Biochem.: High-perfomance ion-exchange chromatographic separation of proteoglycans.1986, 159, pp. 150-156.

18. Kernohan, J.W., Mabon. R. F., Svien. H.J., Adson. A.W.: A simplified classification of gliomas. Proc. Mayo Clin. 1949.

19. Raimondi, A.: Ultrastructure and the biology of human brain tumors. Prog Neuro. Surd., 1 1966.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ обеспечивает упрощение исследования и надежность прогноза. Проводят исследование сыворотки крови онкобольных, при этом определяют с помощью ионообменной хроматографии фракционный состав гликозамингликанов и при уменьшении гепарансульфатов ниже 1% от нормы, хондроитинсульфатов ниже 30%, а суммарного уровня гликозамингликанов ниже 50% прогнозируют послеоперационную злокачественную трасформацию. 1 табл.

Способ прогнозирования послеоперационной злокачественной трансформации доброкачественных опухолей центральной нервной системы путем исследования сыворотки крови онкобольных, отличающийся тем, что определяют с помощью ионообменной хроматографии фракционный состав гликозамингликанов и при уменьшении гепарансульфатов ниже 1% от нормы, хондроитинсульфатов ниже 30%, а суммарного уровня гликозамингликанов ниже 50% прогнозируют послеоперационную злокачественную трансформацию.