СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭРОЗИИ РОГОВИЦЫ Российский патент 2001 года по МПК A61F9/00 

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии и предназначено для лечения больных с эрозиями роговицы, в том числе персистирующими эрозиями роговицы.

Лечение больных с рецидивирующими и персистирующими эрозиями роговицы, в том числе послеожоговыми, остается актуальной проблемой для офтальмотравматологов.

Традиционное консервативное лечение, к сожалению, нередко не оказывает положительного эффекта. Несвоевременное закрытие эпителиального дефекта приводит к формированию помутнения, изъязвлению, перфорации роговицы, функциональной и анатомической гибели глаза.

Эффективным способом лечения персистирующих эрозий роговицы является использование лечебных мягких контактных линз (Лапина Л.А. Физиологические аспекты адаптации глаза к контактным линзам. //Автореферат диссертации канд. мед. наук. Москва, 1988, стр. 22; Boles S.F. et all. //Cornea, -1992,Vol. 11, N 1, P.47- 52).

Ближайшим способом того же назначения является способ лечения дефектов роговицы с помощью культуры фетальных клеток роговицы человека, адгезированных на внутренней поверхности мягкой контактной линзы (патент RU 2000102601 от 04.02.2000). При этом способе контактная линза с предварительно нанесенным на внутреннюю поверхность монослоем фетальных клеток укладывается на поврежденную роговицу. Монослой фетальных клеток содержит 80% эпителиальных и 20% стромальных клеток роговицы. Аллогенные клетки мигрируют с контактной линзы на рану, происходит их пролиферация и образование новых ростков, замещающих поврежденную ткань. Авторы используют культуру клеток эмбриона человека. Однако в данном способе применяют монослой эпителиальных клеток, между которыми располагаются стромальные клетки, в результате чего трансплантат не обладает гистотипическими свойствами, и, следовательно, не обеспечивает оптимальной эпителизации в ране. Кроме того, морально-этические проблемы, техническая сложность получения донорского материала и высокая стоимость способа ограничивают его применение в клинической практике.

Предлагаемый способ основан на применении многослойного пласта аллогенных или ксеногенных эпителиальных клеток, выращенных на внутренней поверхности контактной линзы, которая используется с одной стороны в качестве матрицы и носителя клеток, а с другой - в качестве способа фиксации трансплантата. Клетки могут быть получены из кожи человека, эпителия конъюнктивы и роговицы человека, свиньи, крупного рогатого скота.

Условия культивирования эпителиальных клеток вне организма (in vitro) в среде DMEM: F12 при добавлении эпидермального фактора роста (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), изопротеринола (10М) позволяют получать в культуре многослойные эпителиальные пласты клеток, гистотипически подобные эпителию в организме. Такие многослойные выращенные эпителиальные клетки способны пролиферировать, дифференцироваться и стратифицироваться в условиях in vitro (Терских В.В. и др. Эпидермальные кератиноциты человека и животных. Проблемы культивирования и трансплантации.//Москва: Наука, 1995, 1, стр. 4, 82). Именно это свойство было использовано при восстановлении эпителия роговицы трансплантацией выращенных на контактных линзах многослойных культур эпителиальных клеток. Ранее многослойные пласты клеток на контактных линзах не выращивались. Нами были разработаны модификации получения пластов клеток на линзе. Выращивание многослойного пласта эпителиальных клеток непосредственно на линзе позволяет максимально сохранить их свойства для их последующего воздействия на рану. Кроме того, выращивание эпителиального пласта на линзе позволяет упростить методику, поскольку выращивание пласта на другой матрице требует последующего пассирования на линзу, вследствие чего возникает необходимость дополнительных мероприятий по восстановлению функций эпителиального пласта, нарушенных в процессе пассирования. Возможно также создание на основе методики выращивания эпителиальных пластов на контактной линзе банка трансплантационного материала, что особенно актуально в условиях массовой травмы глаза. Кроме того, в работе использовались эпителиальные клетки взрослых доноров (прижизненное донорство), что показало высокую эффективность лечения при значительном упрощении процедуры забора материала (биопсии) для выращивания, строгого тестирования как материала, так и собственно донора. Такой подход, кроме того, лишен морально-этических и социальных ограничений, появляющихся при использовании эмбрионального материала.

Теоретической основой способа является феномен максимальной стимуляции регенерации эпителия реципиента при трансплантации морфологически подобной эпителиальной ткани как аллогенной, так и ксеногенной. Пересадка эпителиальной ткани в виде многослойного пласта стимулирует регенерацию собственного эпителия выделяемыми клетками во внешнюю среду биологически активными веществами (факторы роста, цитокины и др.), при этом временно приживший трансплантат активно вытесняется и замещается собственным эпителием (Smirnov S. V. et all. Seven-years experience in the treatment of burn patients with allogenic cultured keratinicytes. //Annals of burn and fire disasters,Vol. XII, N4, dec. 1998, p. 212-216). Возможность использования как аллогенной, так и ксеногенной культуры клеток значительно упрощает техническое исполнение способа, снимает проблемы этического характера, снижает себестоимость и позволяет широко использовать его в клинической практике.

Метод трансплантации культивированных аллогенных эпителиальных клеток успешно применяется в клинической комбустологии, лечении хронических трофических язв и свищей (Сергиенко Н.Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры аллогенных фибробластов. //Урология, 1999, N 1, стр. 44-46; Методические рекомендации: "Восстановление кожных покровов у тяжелообожженных больных с помощью пересадки выращенных эпидермальных пластов" //Главное военно-медицинское управление МО РФ, Москва, 1997, стр. 10).

По данным различных авторов приживление трансплантата аллогенных клеток наступает в 50-90% случаев. Пересаженные клетки оказывают многофункциональное влияние на процессы заживления раны, предотвращая негативное воздействие факторов внешней среды на глубжележащие ткани, выделяя различные клеточные медиаторы стимуляции регенерации, участвуют в синтезе базальных мембран. В результате происходит восстановление типичного для данной ткани эпителия (по пути физиологической эпителизации). Этот процесс носит гистотипический характер.

Однако восстановление дефектов роговицы принципиально отличается от закрытия дефектов других тканей, при лечении которых использовали трансплантацию аллогенных эпителиальных клеток. Если в случае дефектов кожи, мочевых свищей, эрозий шейки матки восстановление дефекта происходит в основном за счет контракции, то при дефектах роговицы его заживление происходит исключительно в результате миграции собственного эпителия на дефект без элементов контракции, что послужило предпосылкой для использования аллогенных эпителиальных клеток при лечении рецидивирующих и персистирующих эрозий роговицы.

В офтальмологии предлагаемый способ был впервые применен нами на экспериментальных животных. Эксперимент проведен на стандартной модели тяжелого щелочного ожога роговицы. Экспериментальный ожог глаз 7 кроликов наносили под кеталаровым наркозом путем накладывания на роговицу пропитанного 10% раствором NaOH круга фильтровальной бумаги диаметром 7 мм, время экспозиции 20 секунд.

Мягкую контактную линзу с нанесенными на внутреннюю ее поверхность культивированными аллогенными эпителиальными клетками получали следующим способом. Культивирование аллогенных эпителиальных клеток кератиноцитов производили стандартным способом в среде DMEM:F12 при добавлении эпидермального фактора роста (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), изопротеринола (10М) при температуре 37 град. С в атмосфере 5% CO₂ и насыщающей влажности в течение 7-23 суток (Терских В.В. и др. Эпидермальные кератиноциты человека и животных. Проблемы культивирования и трансплантации.// Москва: Наука, 1995, 1, стр. 4, 82). Культуру эпителиальных клеток в концентрации 500 тысяч клеток в мл наносили на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы в 2 мл среды DMEM-F12 (1: 1). Эпителиальные клетки на контактной линзе культивировали в течение 2-7 суток в среде DMEM-F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, эпидермальный фактор роста (10 нг/мл), инсулин (5 мкг/мл) и изопротеринол (10 М). За сутки до трансплантации среду меняли на среду без сыворотки. Непосредственно перед трансплантацией контактные линзы с многослойным пластом эпителиальных клеток промывали стерильным физиологическим раствором.

На 12 сутки после нанесения экспериментального ожога после предварительной некрэктомии на пораженную роговицу укладывали мягкую контактную линзу с выращенными на ее внутренней поверхности многослойным пластом эпителиальных клеток.

Гисто-морфологические исследования, проведенные на 2, 7, 14, 30 сутки, свидетельствуют о временном приживлении трансплантата и восстановлении эпителиального покрова роговицы за счет активной миграции на дефект и вытеснения трансплантата собственными эпителиальными клетками. В итоге получено закрытие роговичного дефекта и предупреждение грозного осложнения ожога роговицы - перфорации. Обнадеживающие результаты позволили нам применить способ в клинической практике.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является полноценное восстановление эпителиального дефекта роговицы с получением наиболее приближенной к нормальной структуры ткани роговицы.

Технический результат достигается тем, что осуществляется активная стимуляция регенерации эпителия роговицы с помощью многослойного пласта эпителиальных клеток, выращенного на мягкой контактной линзе.

Способ осуществляется следующим образом. Трансплантаты аллогенных эпителиальных клеток, выращенных на внутренней поверхности контактных линз, готовят предварительно по изложенной выше методике. Укладывание мягкой контактной линзы на поврежденную роговицу производят без предварительной анестезии. Контактная линза остается на поверхности глазного яблока в течение 3-5 дней. В зависимости от результатов лечения через 3-5 дней трансплантацию повторяют до полного закрытия эпителиального дефекта роговицы.

Конкретные примеры выполнения способа.

Пример 1. Больной Т. 20 дней назад перенес термохимический ожог роговицы 3-4 степени. В процессе лечения по месту жительства у больного сформировалась персистирующая эрозия роговицы. При поступлении роговица матового цвета, персистирующая эрозия роговицы диаметром до 8 мм, васкуляризация обрывается по краю эпителиального дефекта. На 24 сутки после травмы произведена трансплантация культивированных эпидермальных кератиноцитов на контактной линзе. На 5-е сутки после первой трансплантации площадь эрозии уменьшилась на 40%. Произведена повторная трансплантация эпителиальных клеток на линзе. Спустя 3 дня после второй пересадки эрозия уменьшилась до 3 мм в диаметре. Произведена третья трансплантация. Через 4 для после третьей трансплантации роговица полностью эпителизирована. В дальнейшем больной продолжал пользоваться мягкой контактной линзой в течение 2-х недель. Рецидивов эрозии не было.

Пример 2. Больная Л. 14 дней назад перенесла химический ожог роговицы 3 степени. Консервативное лечение по месту жительства с начальным положительным эффектом, однако к 12 суткам эпителизация роговицы прекратилась, сформировалась персистирующая эрозия роговицы. При поступлении роговица отечная, эрозия в центральной зоне роговицы диаметром до 9 мм. На 16 и 22 сутки после травмы произведена трансплантация культивированных эпидермальных кератиноцитов на контактной линзе. На 6-е сутки после первой трансплантации диаметр эрозии уменьшился до 6 мм, спустя 6 дней после второй пересадки наступила полная эпителизация роговицы. В дальнейшем больная продолжала пользоваться мягкой контактной линзой в течение 2-х недель. Рецидивов эрозии не было. В результате сформировалось бельмо 2 категории с остротой зрения 0.3. У аналогичных больных при традиционном лечении отмечается или формирование грубого рубца с резким ухудшением зрения, или перфорация роговицы с угрозой гибели глаза.

Пример 3. Больной Т. 11 дней назад перенес химический щелочной ожог роговицы и конъюнктивы 2-3 степени. Консервативное лечение по месту жительства. При поступлении определяется персистирующая эрозия роговицы диаметром 8 мм, гиперемия конъюнктивы, васкуляризация заканчивается в 1 мм от лимба. Строма роговицы отечная. На 14 и 20 сутки после травмы произведена трансплантация культивированных эпидермальных кератиноцитов на контактной линзе. На 5-е сутки после первой трансплантации диаметр эрозии уменьшился до 5 мм, спустя 6 дней после второй пересадки наступила полная эпителизация роговицы. В дальнейшем больная продолжала пользоваться мягкой контактной линзой в течение 2-х недель. Рецидивов эрозии не было, сформировалось бельмо 2 категории с остротой зрения травмированного глаза 0.5.

Всего предлагаемый способ применен в лечении 5 больных с персистирующими эрозиями роговицы, в том числе после тяжелых ожогов роговицы. Во всех случаях получена активизация репаративных процессов, закрытие дефектов эпителия и устранение угрозы изъязвления и перфорации глазного яблока.

Основным преимуществом предлагаемого способа перед кератопластикой кадаверной роговицей или другими тканями и мягкими контактными линзами является его атравматичность, отсутствие риска развития реакции отторжения трансплантата, стимуляция эпителиальными клетками репаративного процесса посредством секреции факторов роста, цитокинов и др. во внешнюю среду и активное их участие в синтезе собственной базальной мембраны, одновременное использование протекторной функции мягкой контактной линзы, формирование помутнения роговицы меньшей интенсивности, чем при использовании других способов лечения.

Основным преимуществом предлагаемого способа является техническая простота исполнения, отсутствие при выполнении проблем морально-этического характера, низкая себестоимость способа, что позволяет широко использовать его в клинической практике.

Изобретение относится к медицине, офтальмологии. На внутренней поверхности контактной линзы выращивают многослойный пласт эпителиальных клеток. На пораженную роговицу укладывают мягкую контактную линзу. Используют кератиноциты, аллогенные клетки, ксеногенные клетки. Способ атравматичен, прост в исполнении. Отсутствует риск развития отторжения трансплантата. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ лечения эрозий роговицы, включающий подведение к роговице эпителиальных клеток, расположенных на внутренней поверхности контактной линзы, отличающийся тем, что используют многослойный пласт эпителиальных клеток, выращенных на внутренней поверхности контактной линзы. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют кератиноциты. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аллогенные клетки. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ксеногенные клетки.