СПОСОБ БИОДЕСТРУКЦИИ ГЕПТИЛА - НЕСИММЕТРИЧНОГО ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к области экологии и биотехнологии и посвящено проблеме утилизации токсичных и ядовитых веществ с помощью микроорганизмов.

Жидкое ракетное топливо, известное под названием гептил, по своей химической структуре представляет собой несимметричный (вторичный) диметилгидразин:

Это вещество относится к числу наиболее вредных и опасных химических соединений. Гептил представляет собой бесцветную жидкость, хорошо растворимую в воде, сильный яд. По химическим свойствам несимметричный диметилгидразин - сильное основание, сильный восстановитель, подвергающийся активному окислению (Справочник по токсикологии и гигиеническим нормативам (ПДК) потенциально опасных химических веществ, ред. В.С.Кушнева и Р.Б.Горшкова, Москва "ИздаТ", 1999; Е. Schmidt. Hyd-razine and Its Derivatines: Preparation, Properties, Applications, 1984).

Проблема очистки объектов окружающей среды, металлических конструкций и изделий, загрязненных ядовитыми и токсичными веществами, а также утилизация избыточных количеств этих веществ, находящихся на складах, является чрезвычайно актуальной для современной экологии.

Из всех известных способов дезактивации вредных органических соединений наиболее перспективными являются биотехнологические способы.

Проработка патентного и периодического научного материала показала отсутствие данных по проблеме биологической утилизации несимметричного димелигидразина. Имеются лишь единичные сообщения о культурах бактерий, способных утилизировать гидразин, производным которого является несимметричный диметилгидразин. В этих публикациях в качестве ключевого свойства для скриннинга микроорганизмов, потребляющих гидразин, была выбрана способность к его утилизации как источника азота, при этом источником углерода являлся углекислый газ. Обнаружены аэробные хемолитотрофные бактерии родов Nitromonas и Achromobacter, о которых сообщается как об организмах, способных к использованию гидразина в азотном цикле (A.McLiner a. J. Street. Decomposition of Hydrazine in Aqueous Solutions. 1989; D. Kuch. Bioremediation of Hydrazine. 1994). Такой подход существенно сужает рамки поиска потенциальных биодеструкторов гептила, не учитывает, что это вещество может быть источником углерода для гетеротрофной микрофлоры и не дает полного представления о потенциальных возможностях природных микробиоценозов дезактивировать вредные и токсические соединения.

Наиболее оправданным для решения задач по дезактивации гептила является применение эколого-физиологического подхода, состоящего в учете особенностей природной среды, подвергнутой загрязнению и применяемого для дезактивации вредных и токсических соединений.

Так, для дезактивации ядохимикатов, применяемых в сельском хозяйстве (пестицидов и гербицидов) описан способ разложения фосфороорганических пестицидов с помощью бактерий Bacillus megaterium, описанный в авт. свид. N 1735359. По данному способу бактерии Bacillus megaterium предварительно выращивают на питательной среде, содержащей пестициды, и затем вносят в почву, загрязненную тем же самым пестицидом. Недостатком данного способа является ориентация на выделение и использование чистой культуры природных микроорганизмов, которые характеризуются слабой способностью к утилизации ксенобиотиков. Это неприемлемо для решения практических проблем, связанных с очисткой почв и водоемов, загрязненных гептилом, и для утилизации запасов некондиционного гептила, скопившихся на складах.

Описан способ дезактивации ядохимикатов, заключающийся в адаптации спонтанной микрофлоры навоза сельскохозяйственных животных или помета птиц в процессе их ускоренного компостирования в присутствии возрастающих концентраций ядохимикатов. Образующийся в результате этого зрелый компост может использоваться в качестве "закваски", поскольку содержит микрофлору, способную к дезактивации ядохимикатов (Пат. РФ N 2077398). Однако данный способ не может быть использован для разложения гептила, попадающего в водоемы, или для утилизации некондиционного гептила, хранящегося на складах.

Цель предлагаемого изобретения заключалась в разработке экологически чистого способа деструкции гептила с помощью биопрепаратов, основанных на микроорганизмах, выделенных из природных сред. Эта цель достигается тем, что для деструкции гептила и продуктов его разложения используются ассоциативная культура, выделенная из пропитанных гептилом или нефтепродуктами почв, а также из почв, в которые вносили органические удобрения (навоз или компосты на основе растительных отходов), а также биопрепарат, созданный на основе этой культуры.

Бактериальные биопрепараты и технологии, разработанные на основе изложенных принципов, были использованы для разложения таких вредных и токсичных соединений, как нефть и нефтепродукты (Пат. РФ N 2053204; Пат. РФ N 2067993; Пат. РФ N 2076150; Patent US N: 5496723; Patent N: US 5759800; European Patent N 0668246).

В практическом плане для деструкции гептила в воде и почве использовалась ассоциативная культура, включающая следующие штаммы бактерий: Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. H-2, Arthrobacter sp. H-3.

Данная ассоциативная культура для утилизации гептила была получена на основе штаммов бактерий, которые были выделены из накопительных культур с последующей их селекцией по признаку активности деструкции токсичных и ядовитых веществ.

Характеристика штаммов.

Штамм бактерий Acinetobacter species H-1.

Одно-двухсуточная культура бактерий на мясопептопном агаре (МПА) представляет собой коротко-овальные палочки, одиночные и сдвоенные, размером 1,2-1,5 х 1,3-1,5 мкм. Колонии на МПА округлые, гладкие, равномерно выпуклые с ровным краем. Грамотрицательный. Спор не образует. Хемоорганотроф. Аэроб. Ассимилирует: глицерин, D-глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, мальтозу, ксилозу, D-галактозу, рамнозу, целлобиозу, аспарагин, мочевину, сульфат аммония, азотнокислый калий. Температура роста 10-40^oC. Непатогенен.

Штамм бактерий Rhodococcus species H-2.

Одно-двухсуточная культура бактерий на МПА представляет собой коротко-овальные палочки размером 1,4 х 1,5 мкм. Колонии на МПА округлые, с ровным краем, блестящие, равномерно выпуклые, беловатые. Грамположительный. Спор не образует. Хемоорганотроф. Аэроб. Ассимилирует: глицерин, D-глюкозу, лактозу, сахарозу, раффинозу, маннозу, фруктозу, ацетат, пируват, лактат, глутамат, аспарагин, мочевину, сульфат аммония, азотнокислый калий. Температура роста 15 - 43^oC. Непатогенен.

Штамм бактерий Arthrobacter species H-3.

Одно-двухсуточная культура бактерий на МПА представляет собой палочки неправильной формы, варьирующие по величине 1,1-1,5 х 1,3-1,8 мкм. Клетки часто расположены под углом друг к другу, образуя V-образные формы. Грамположительный. Спор не образует. Колонии на МПА округлые с ровным краем, беловатые, блестящие, равномерно выпуклые. Хемоорганотроф. Ассимилирует: D-глюкозу, D-ксилозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, D-глюконат, глицин, мочевую кислоту, оксибензоат, инозит, цитрат, раффинозу, аспарагин, мочевину, сульфат аммония, азотнокислый калий. Температура роста 10 - 40^oC. Непатогенен.

Приготовление биопрепарата.

Получен биопрепарат путем культивирования перечисленных культур бактерий по отдельности на минеральной среде с 2% (по объему) жидкого парафина и последующего смешивания отдельных биомасс бактерий в соотношении 1:3:2. Состав среды для культивирования бактерий, г/л: NH₄H₂PO₄ - 10, K₂HPO₄ - 10, MgSO₄ • 7H₂O, ZnSO₄ • 7H₂O, FeSO₄ • 7H₂O, MnSO₄ • 7H₂O - по 0,0125. Культивирование проводили в аппарате с интенсивным перемешиванием (1200 об/мин) и подачей воздуха - 600 л/час при 30 - 34^oC, pH 7,0. Полученную биомассу подвергали сепарированию и высушиванию. Режим сушки: температура на входе 106-110^oC, на выходе 45-50^oC. Полученный биопрепарат представлял собой порошок бежеватого цвета, без специфического запаха, влажностью 8 - 10%, титр культуры - продуцента 10⁸ -10¹⁰ кл/г.

Деструкция гептила ассоциацией культур и биопрепаратом.

Процесс деструкции гептила в воде проводили в модельных опытах в колбах на качалках (220 об./мин) на минеральной среде вышеуказанного состава как с использованием жидкой ассоциативной культуры, так и с порошкообразным биопрепаратом. Содержание гептила в среде составляло 100 и 1000 мг/л. Ассоциативную культуру или биопрепарат вносили в количестве 1-2% абсолютно сухой биомассы к заданной концентрации гептила. Температура культивирования 20 и 30^oC, pH 7,0. Определение концентрации гептила и продуктов его разложения (формальдегида и диметиламина) проводили через 1,5, 5, 7 и 20 сут. В табл. 1 представлены данные о динамике деструкции гептила в воде.

Как видно из представленных данных, деструкция гептила активно происходила при использовании как ассоциативной бактериальной культуры, так и биопрепарата при 20^oC и 30^oC : при 20^oC через 1,5 суток культивирования при использовании ассоциативной культуры снижалось со 100 мг/л до 4,5 - 7,0 мг/л, при использовании биопрепарата - до 3,8 - 8,1 мг/л. При 30^oC через 1,5 суток концентрация гептила снижалась со 100 мг/л до 2,3 - 2,6 мг/л при использовании ассоциативной культуры и до 3,2 - 5,7 мг/л при использовании биопрепарата. При этом наблюдалось снижение содержания промежуточных продуктов разложения гептила - формальдегида и диметилгидразина с 65 и 47 мг/л (в контроле) до 0,17 и 1,2 мг/л при использовании ассоциативной культуры и до 0,5 и 1,5 мг/л при использовании биопрепарата соответственно. Через 20 суток культивирования при использовании как ассоциативной культуры, так и биопрепарата остаточная концентрация гептила составляла 0,3 - 0,4 мг/л, то есть содержание гептила снижалось почти в 300 раз.

Показана возможность биодеструкции высоких (до 1000 мг/л) концентраций гептила в воде с помощью биопрепарата. Согласно данным табл. 1 через 1,5 суток отмечено снижение концентрации гептила с 1000 мг/л до 44 мг/л, через 20 суток культивирования концентрация гептила снизилась до 3,2 мг/л.

Процесс деструкции гептила в почве проводили методом твердофазной ферментации. Концентрация гептила в почве составляла 11,3 г/кг почвы. Количество биопрепарата, вносимого в почву, составляло 1 - 2% к заданному количеству гептила. Из табл. 2 видно, что при внесении биопрепарата в почву происходит интенсивная деструкция гептила: концентрация гептила через 30 суток снизилась с 11,3 г/кг до 0,35 г/кг почвы. В контроле 1 (без перемешивания почвы) деструкция гептила практически отсутствовала. В контроле 2 (при перемешивании почвы) и в контроле 3 (при перемешивании почвы и добавлении минеральных солей) снижение концентрации гептила также было незначительным.

Разработанное нами изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Деструкцию гептила в воде проводили путем культивирования ассоциативной культуры, включающей штаммы бактерий Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. H-2, Arthrobacter sp. H-3. Культивирование проводили в качалочных колбах с затворами, предотвращающими улетучивание гептила, число оборотов мешалки - 180 об. /мин., температура 20^oC. В воду добавляли минеральные соли состава, г/л: NH₄H₂PO₄ - 10, К₂HPO₄ - 10, MgSO₄ • 7H₂O, ZnSO₄ • 7H₂O, FeSO₄ • 7H₂O, MnSO₄ • 7H₂O - по 0,0125; pH 7,0. Концентрация гептила составляла 100 мг/л. Через 1,5 суток содержание гептила снизилось до 4,5 мг/л.

Пример 2.

Деструкцию гептила в воде проводили по примеру 1, но при температуре культивирования 30^oC. Через 1,5 суток содержание гептила снизилось до 2,35 мг/л, и через 20 суток - до 0,32 мг/л, содержание формальдегида при этом снизилось с 65 мг/л до 0,9 мг/л, содержание диметиламина - до 0,25 мг/л.

Пример 3.

Деструкцию гептила в воде проводили по примеру 2, но вместо ассоциативной культуры использовали биопрепарат, полученный путем периодического культивирования по отдельности трех штаммов бактерий: Acinetobacter sp. Н-1, Rhodococcus sp. H-2, Arthrobacter sp. Н-3. Выращивание проводили на минеральной среде (состав по примеру 1) с добавлением 2% (по объему) жидкого парафина в аппарате "Абитекс" при перемешивании (1800 об/мин) и аэрации (600 л/час); pH среды 7,0; температура 34^oC. После выращивания биомассу отделяли сепарированием и затем высушивали. Режим сушки: температура на входе 105-110^oC, на выходе 45 - 50^oC, что обеспечивало сохранение клеток в жизнеспособном состоянии. Полученная сухая биомасса представляла собой порошок без специфического запаха с влажностью 10% и титром культуры-продуцента 10⁸ кл/г порошка. Для получения биопрепарата сухую биомассу трех культур смешивали в равных количествах. Готовый биопрепарат вносили в количестве 1% (по весу) относительно концентрации гептила. Через 1,5 суток содержание гептила снизилось до 3,2 мг/л, через 20 суток - до 0,3 мг/л.

Пример 4.

Деструкцию гептила в воде проводили по примеру 3, но концентрация гептила составляла 1000 мг/л. Через 1,5 суток содержание гептила снизилось до 44,3 мг/л, содержание формальдегида при этом составляло 1,8 мг/л, диметиламина - 15,0 мг/л. Через 20 суток культивирования содержание гептила снизилось до 3,2 мг/л.

Пример 5.

Деструкцию гептила в почве проводили с использованием образцов песчаной почвы в количестве 400 г, которую помещали в фарфоровые стаканы. Влажность почвы поддерживали на уровне 20 - 25% путем подпитки раствором минеральных солей (по примеру 1). Исходная концентрация гептила в почве составляла 11,3 г/кг. В стаканы с почвой и гептилом вносили биопрепарат в количестве 2% (по весу) относительно концентрации содержащегося гептила и закрывали стеклянными крышками для предотвращения улетучивания гептила. Температура культивирования составляла 18 - 20^oC. Почву в процессе опыта тщательно перемешивали ежедневно шпателем на всю глубину. Через 7 суток культивирования концентрация гептила снизилась до 7,5 г/кг, через 30 суток - до 0,35 г/кг.

Таким образом, предлагается способ биодеструкции гептила - несимметричного диметилгидразина, новизна которого заключается в следующем:
- в использовании для биодеструкции гептила специально селекционированной ассоциативной культуры бактерий Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. H-2, Arthrobacter sp. H-3, обеспечивающей быстрое и глубокое разложение гептила;
- в получении биопрепарата на основе ассоциативной культуры, что удобно для практической реализации предлагаемого способа, в частности для деструкции гептила в природных условиях;
- биодеструкция гептила сопровождается одновременно деструкцией промежуточных продуктов его разложения - формальдегида и диметиламина;
- в экологической чистоте, поскольку применяемые для биодеструкции гептила штаммы бактерий и биопрепарат являются непатогенными и при их практическом использовании исключается загрязнение окружающей среды и обеспечивается при этом очистка воды и почвы от гептила и продуктов его разложения.

Способ основан на биодеструкции гептила(несимметричного диметилгидразина) специально селекционированной ассоциативной культурой, включающей штаммы бактерий Acinetobactеr sр. Н-1, Rhodococcus sр. Н-2, Arthrоbасtеr sр. Н-З. На основе данной культуры получен биопрепарат, который обеспечивает биоразложение гептила. При использовании ассоциативной культуры или биопрепарата содержание гептила в воде снижается с 1000 мг/л до 0,3 мг/л и с 1000 мг/л до 3,2 мг/л за 20 сут при 30^oC. При этом одновременно происходит снижение содержания продуктов разложения гептила-формальдегида и диметиламина, являющихся токсичными веществами. При биодеструкции гептила в почве содержание гептила снижается с 11,3 г/кг до 0,35 г/кг за 30 сут при 18-20^oC. Предлагаемый способ биодеструкции может быть успешно использован при очистке воды и почвы от гептила и продуктов его разложения. Он прост в своей практической реализации, эффективен и является экологически чистым. 2 табл.

Способ биодеструкции гептила, отличающийся тем, что процесс разложения гептила осуществляют с помощью биопрепарата на основе ассоциативной культуры бактерий Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. H-2, Arthrobacter sp.H-3 в условиях аэрации при добавлении в загрязненный гептилом объект (вода, почва) источников азота, фосфора и микроэлементов.