КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ ARTHROBACTER OXYDANS И PSEUDOMONAS PUTIDA, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЯ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/06 C12R1/38 

Использование: очистка загрязненных нефтью и нефтепродуктами почв, пресной и соленой воды и прудов-отстойников в различных природно-климатических условиях.

Сущность изобретения: создан консорциум микроорганизмов Arthrobacter oxydans Ac-1838D, Pseudomonas putida B-2443, обеспечивающий эффективную очистку воды и почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Известны созданные на основе монокультур биопрепараты: Путидойл (авт. свид. N 1076446, 1982, авт.свид. N 1428809, 1988); Биоприн (Олеоворин) ТУ 11279895-12-22-92 авт. свид. N 1809822, 1993, авт.свид. N 2014286, 1994), используемые для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Каждому из этих препаратов в равной степени присущи определенные достоинства, которые были далее дополнены и расширены.

Предложены способы для работы при низких температурах 8-10^oC (авт.свид. N 2019527, 1994) и высоких температурах (авт.свид. N 2014286).

Известен способ очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений при низких значениях pH 3.5-6.0 (авт.свид. N 2007372, 1994).

Предложены консорциумы микроорганизмов для очистки сточных вод от фенола, метанола и формальдегида (авт.свид. N 1387343, 1986), от диэтиленгликоля (авт. свид. N 1774602, 1990), от этиленгликоля и диэтаноламина (авт. свид. N 1800800, 1990).

Наиболее близким к предложенному является консорциум микроорганизмов "Деворойл" (авт.свид. N 2023686, 1994), активно окисляющий нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в нефтяной пленке, способный утилизировать широкий диапазон углеводородов нефти как в пресной, так и в засоленой экосистеме.

К недостатку данного консорциума можно отнести сложность технологии приготовления препарата из пяти культур.

Цель изобретения: создание консорциума микроорганизмов, способных утилизировать нефть и нефтепродукты на почве, в пресной и морской воде и для очистки прудов-отстойников с щелочной pH среды (8-9).

Выдвигаемая цель достигается тем, что используется консорциум микроорганизмов в комплексе с минеральными добавками азота (аммонийная соль) и фосфора.

В качестве ассоциативных микроорганизмов использованы Г⁺ (грам-положительные) - Arthrobacter oxydans Ac-1838D и Г^- (грам-отрицательные) - Pseudomonas putida В-2443 бактерии.

Преимуществом предлагаемого консорциума является объединение в одной ассоциации двух штаммов, проявляющих неодинаковую активность по отношению к питательному субстрату (Arthrobacter oxydans эффективнее окисляет ароматическую нефть, a Pseudomonas putida - парафинистую) и к условиям внешней среды (Ps. putida эффективнее окисляет углеводороды при слабокислых и нейтральных значениях pH, a Arthrobacter oxydans - в нейтральных и щелочных условиях).

Композиция позволяет сделать процесс биодеградации нефти и ее производных более эффективным (степень очистки выше 95% за 96 часов деструкции).

Основная особенность консорциума состоит в том, что предлагается новый штамм Arthrobacter oxydans Ac-1838D в ассоциации с Pseudomonas putida В-2443, растущие при pH выше 8 и активно деструктирующие нефть и нефтепродукты.

Штамм Arthrobacker oxydans Ac-1838D выделен из образцов почв, отобранных с нефтяных промыслов Астраханского НГДУ (Калмыкия) в 1991 году. Штамм получен методом накопительной культуры, т.е. многократным пересевом на жидкой минеральной среде с нефтью. Для культивирования использовали среду Ворошиловой-Диановой следующего состава (г/л):
К₂HPO₄ - 1.0; KH₂PO₄ - 1.0; NH₄NO₃ - 1.0; MgSO₄ - 0.2; CaCl₂ • 6 H₂ - 0.01; FeCl₃ • 6 H₂O - 3 капли в присутствии 1% углеводородов.

Выращивание проводили в колбах на качалках 180 об/мин, объем среды 200 мл, концентрация нефти 1%.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими свойствами.

1. Морфологические и культуральные признаки.

Кокк - палочка, - кокковый цикл роста. Эндоспоры не образует. Грамположителен, неподвижен, не ферментирует. Метаболизм дыхательный, никогда не бродильный. На МПА образует колонии кремово-белого цвета, округлые, выпуклые, гладкие, блестящие, растообразные.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимум роста 20-30^oC. Растет при температуре 10-45 в диапазоне pH 5.5-9, соленость до 6% NaCl.

Отношение к углеводам.

Использует сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, рафинозу, маннит, глицерин, не усваивает арабинозу.

Отношение к углеводородам.

Использует октан, гексан, толуол, ксилол, бензол, парафин, асфальтены, камфору. Не усваивает нафталин. Ароматические нефти усваиваются активнее, чем парафинистые.

Отношение к источникам питания.

Ассимилирует нитратный азот.

Другие характерные физиологические особенности обмена.

Желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, сероводород и индол не образует. Аммиак не выделяет. Оксидазная реакция отрицательная, каталазоположителен. Не имеет лецитиназы, аргининдегидролазы, уреазы, лизиндекарбоксилазы.

Сведения о наличии патогенных свойств.

Непатогенен.

В таблице 1 представлены данные по влиянию различных антибиотиков на штамм Arthrobacter oxydans.

На основании комплекса морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм идентифицирован как Arthrobacter oxydans и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером ВКПМ AC-1838D.

Условия хранения.

Стерильные столбики (среда МГТА) инкубируют при 30^oC 48-72 часа, заливают 1 мл стерильного вазелинового масла и хранят при 4^oC, пересевают 3 раза в год.

Штамм Pseudomonas pukida В-2443
Выделен из отработанного бурового раствора на органической основе (нефть), хранящегося в шламовом амбаре открытого типа Белозерского месторождения Тюменской области и депонирован во "ВНИИГенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2443.

1. Морфологические и культуральные признаки.

Величина клеток односуточной культуры 1.7-2.4 х 0.3-0.5 мкм. Грамотрицателен. Преобладающая форма клеток - прямые, палочковидные. На МПА образуют колонии бесцветные, выпуклые, круглые, размером 3-7 мм. На мясопептонном бульоне образуют муть с выделением газа. На картофеле - обильный рост, штрих выпуклый, сплошной с образованием слизи. Желатину не разжижает. Молоко свертывает, подкисляет.

2. Физиологические признаки.

Аэроб, растет при 28-40^oC, при 4^oC не растет.

Отношение к углеводам.

Использует лактозу, глюкозу, и мальтозу с выделением газа. Не усваивает арабинозу.

Отношение к углеводородам.

Использует нафталин, камфару, октан, гексан, бензол, толуол, ксилол, парафин, асфальтены. Парафинистые нефти ассимилируются активнее, чем ароматические.

Отношение к источникам питания.

Ассимилирует нитратный азот.

3. Хранение штамма.

Штамм сохраняется в коллекции в лиофиллизированном состоянии. Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (1-2 раза в год) под слоем вазелинового масла при температуре 4^oC.

Пример 1. Периодическое культивирование ассоциации культур Ps.putida и A. oxydans проводили при 30^oC на качалке с 180 об/мин. Среда культивирования приводится выше. Стабильность ассоциации подтверждается высевом на твердую питательную среду с подсчетом колоний разного типа.

В таблице 2 представлены результаты изучения деструктивной активности отдельных штаммов ассоциации и самой ассоциации бактерий, взятых в равном соотношении. Концентрация микроорганизмов 10⁹ клеток на 1 мл среды. Время контакта 96 часов. Изменение содержания нефти в среде культивирования контролировалось методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Хром-5.

Как видно из таблицы 2 ассоциация в периодических условиях имеет большую деструктивную активность по сравнению с отдельными штаммами. Парафинистая нефть утилизируется эффективнее (95.8%), чем ароматическая (92.4%).

Пример 2. Изучение процесса утилизации углеводородов от длительного воздействия
Опыт проводили по аналогии с примером 1.

В таблице 3 представлены результаты биодеструкции нефти и дизтоплива в зависимости от времени экспозиции опыта.

Из таблицы 3 видно, что максимальная степень разложения дизельного топлива достигается на четвертые сутки в отличие от аналога, где максимальная степень деструкции дизтоплива наступает на 5 сутки.

Максимальная степень деструкции нефти (> 95%) в опытах с ассоциацией бактерий также наступает на четвертые сутки в отличие от аналога, где процент утилизации на четвертые сутки достигает только 75%.

Пример 3. Микробную деструкцию нефти осуществляли на среде Ворошиловой-Диановой при температуре 28^oC. PH среды в опытах варьировала от 3 до 9, pH регулировали 10%-ным раствором NaOH.

Посевной односуточный материал выращивали на МПА, смывали стерильным физиологическим раствором и вносили в колбы 5 об.%, углеводороды вносили в количестве 2 об.%.

Результаты влияния pH на разложение нефти представлены в таблице 4.

Данные таблицы показывают, что за 96 часов деструкции при pH 8.9 утилизируется ассоциацией до 87.4% нефти, за это же время аналогом утилизируется всего 13.2%.

Пример 4. Имелся участок почвы площадью 1 га, расположенный на территории НГДУ "Черногорнефть" (г.Нижневартовск), загрязненный сырой ароматической нижневартовской нефтью с интенсивностью загрязнения 7540 мг/100 г почвы.

Обработка проведена водным раствором, содержащим азотнофосфорные добавки (0.07%) и биомассы в ассоциации Ps.putida и A.oxydans в виде концентрированной пасты (титр клеток в растворе 2•10⁸ кл/мл. Расход раствора 1 м³/га.

Перед внесением препарата участок подвергался рыхлению. Отбор проб методом конверта проводили на 14, 21, 35, 42 сутки.

Как видно из таблицы 5, степень утилизации нефти на 42 сутки составила 97.9%. Наблюдалось интенсивное прорастание травяного покрова на обработанном участке.

Пример 5.

Имелся водный участок площадью 3 га, расположенный на территории НГДУ "Черногорнефть" (г. Нижневартовск) с загрязненностью сырой нефтью в концентрации 29.8 кг/м³.

Обработка проведена водным раствором, содержащим азотнофосфорные добавки (0.07%) и биомассы ассоциации Ps.putida и A.oxydans в виде концентрированной пасты (титр клеток в растворе 2•10⁸ кл/мл). Расход раствора 2 м³/10 м².

Через месяц после обработки нефтяная пленка исчезла с поверхности. Степень очистки 97%.

Таким образом, предлагаемый консорциум может быть использован для очистки почвы и водной поверхности в условиях высоких pH среды.

Консорциум микроорганизмов Arthrobacter oxydans Ас-1838D и Pseudomonas putida В-2443 используется для очистки воды и почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Он способен утилизировать углеводороды нефти в широком диапазоне рН среды. Технический результат изобретения состоит в том, что при рН 8,9 за 93 ч деструкции степень биохимического окисления достигает 87.4 %. 5 табл.

Консорциум микроорганизмов Arthrobacter oxydans ВКПМ Ас-1838D и Pseudomonas putida ВКПМ В-2443, используемый для очистки почвы и воды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.