Биологический деструктор несимметричного диметилгидразина Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды и может быть использовано в процессах биологической очистки при загрязнении несимметричным диметилгидразином.

Уровень техники

В технологиях биоочистки окружающей среды от различных ксенобиотиков известно значительное количество биологических препаратов экологического назначения, содержащих в своем составе набор бактериальных штаммов с аэробным типом дыхания, предназначенных для биохимической деструкции и утилизации загрязнителей в основном углеводородной природы (нефти и продуктов ее промышленной переработки).

Экобиопрепараты, используемые для биологической очистки окружающей среды, обладают как определенными достоинствами, так и недостатками, в числе которых отметим: ограниченный спектр утилизируемых субстратов, неоптимальный микробный состав, сложность наработки биомассы, в частности для многокомпонентных препаратов, нарушение естественных взаимоотношений в природных биоценозах после интродуцирования микроорганизмов, а также слабую эффективность препаратов в натурных условиях, особенно при сравнительно высоких концентрациях загрязнителей, негативном влиянии различных примесей, недостаточности аэрирования, пониженных температурах и др.

Обезвреживание объектов окружающей среды от загрязнения жидким реактивным топливом, известным как гептил (несимметричный диметилгидразин - НДМГ), является актуальной и нерешенной проблемой современной экологии.

Гептил считается исключительно опасным экотоксикантом и относится к веществам первого класса опасности. Известно, что использование НДМГ в ракетно-космической технике обусловлено его «особыми эксплутационными свойствами, и замены ему, как горючему, в будущем не предвидится. С точки зрения возникающих при этом экологических последствий, связанных с проливами гидразинных горючих в атмосферу Землю, то это является глобальной экологической проблемой» [Колесников, С.В. Окисление несимметричного диметилгидразина (гептила) и идентификация продуктов его превращения при проливах: - Монография. -Новосибирск: Изд. СибАК, 2014. - 110 с.].

При падении баков с остатками НДМГ, а также при неудачных пусках различных ракет происходит загрязнение значительных площадей территорий и водных поверхностей компонентами ракетных топлив вдоль всей траектории полета ракет, и формирование зараженных участков, количество которых увеличивается с каждым новым пуском, которые в настоящее время производятся с космодромов Байконур (Казахстан), Плесецк, Свободный и Капустин Яр.

Учитывая такие свойства НДМГ, как токсичность, высокая летучесть, неограниченная растворимость в воде и водных растворах кислот и др., существует значительная опасность попадания гептила в биосферу и, в частности, в организм человека, со всеми вытекающими негативными последствиями. Изучение экологических последствий падения отделяющихся частей ракет-носителей показывает, что поступление НДМГ в окружающую среду может достигать нескольких тонн в год [Экологический мониторинг ракетно-космической деятельности. Принципы и методы / под ред. Н.С. Касимова, О.А. Шпигуна. - М.: Рестарт, 2011. - 472 с.].

Эффективные и безопасные технологии нейтрализации гептила, в том числе и биологические, до настоящего времени остаются недостаточно разработанными. Считаем, что одним из перспективных направлений решения данной проблемы может быть использование экобиопрепаратов, предназначенных для микробиологической деструкции несимметричного диметилгидразина, хотя как в РФ, так и за рубежом нам неизвестно наличие таких коммерческих препаратов.

В настоящее время имеются единичные сообщения о видах и ассоциациях микроорганизмов, способных утилизировать НДМГ.

Так, известен способ (Патент на изобретение №2174553 от 11 февраля 1998 г., Заявитель - ЗАО «Биотэк-Япония») биодеструкции несимметричного диметилгидразина, основанный на использовании ассоциативной культуры, включающей следующие штаммы бактерий: Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. Н-2, Arthrobacter sp. H-3 в соотношении 1:3:2, соответственно.

В модельных опытах при культивировании в колбах при температурах 20 и 30°С было показано снижение исходной концентрации гептила в воде со 100 мг⋅л^-1 до 0,3 мг⋅л^-1, в почве - с 11,3 г⋅кг^-1 до 0,35 г⋅кг^-1.

Действие патента прекращено 12 февраля 2003 г.

Недостатки данного способа:

по сути авторы для биодеградации гептила применяют не оформленный надлежащим образом биопрепарат, а ассоциативную культуру;

не приводятся конкретные биотехнологические параметры, оптимальные для осуществления процесса биологической деструкции НДМГ;

максимальные значения, определяющие концентрации несимметричного диметилгидразина, не превышают 0,1% для воды и 1% для почвы;

природные штаммы, входящие в ассоциацию, не идентифицированы до вида и поскольку они являются «специально селекционированной культурой», нет указаний на генетическую закрепленность и устойчивость у них специфических биодеструктивных свойств (способности подвергать биодеструкции НДМГ), то есть основного признака, по которому они были селекционированы.

Описан (Патент на изобретение №2236453 от 18 сентября 2002 г., Заявитель - Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов) штамм бактерий Rhodococcus globerulus 19ф, при внесении культуральной жидкости (10⁷ кл⋅мл^-1) которого в загрязненную гептилом (200 мг-кг^-1) почву концентрация его снижалась на 39% в течение месяца наблюдения.

Действие патента прекращено 19 сентября 2010 г.

Недостатком при использовании данного штамма является то, что разработка не доведена до создания готового биопрепарата, а также длительность и сравнительно невысокий уровень биодеструкции НДМГ.

Имеется также патент на изобретение Республики Казахстан №19817 от 15 декабря 2010 г., описывающий установку для биохимической очистки и рекультивации промышленных сточных вод от гидразина, гептила и его метаболитов, представляющую собой трехсекционный бетонированный биопруд с непрерывной аэрацией сточных вод и использованием для биодеструкции природной ассоциации микроорганизмов, относящихся к трем родам родококков и двум родам псевдомонад. В качестве стимуляторов роста бактерий вводят патоку, растительные белки, аммофос и калия хлорид.

По данным авторов установка позволяет достигнуть 100% биохимической очистки сточных вод и почв от гептила и его метаболитов при их исходной концентрации 100 мг⋅кг^-1.

Недостатками предлагаемого способа являются:

техническая невозможность использования стационарной установки для ремедиации загрязненных почв и водных поверхностей в натурных условиях на значительных площадях, соответствующих по своим линейным параметрам длине трасс пролета ракет и зонам рассеивания НДМГ;

биотехнологические проблемы, связанные со сложностью наработки шестикомпонентного бактериального продукта, тем более, что одновременное культивирование является технологически неприемлемым ввиду различных питательных потребностей штаммов (два из которых вообще не идентифицированы до вида);

заявленный титр микроорганизмов, рекомендуемый для биодеструкции, равный 10¹²-10¹⁴ кл⋅см^-3, по нашему мнению, является недостижимым;

полная биодеструкция гептила достигается при его сравнительно низком исходном уровне, равном 0,01%;

заявленное техническое решение очень близко к прототипу «Установка для микробиологической очистки сточных вод» (А.с. СССР №1542916, 1990).

Раскрытие изобретения

Ранее (2010 г.) нами был предложен для биологической очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов экобиопрепарат «Центрум - MMS» (Патент РФ №2428471 от 13 июня 2010 г.). Предлагаемый биологический препарат экологического назначения «Центрум - MMS» характеризуется:

компонентным составом, представленным двумя видами микроорганизмов с выраженной способностью утилизировать углеводороды при их совместном воздействии;

высокой биодеградационной активностью уже при однократном применении в отношении сырой нефти и различных видов углеводородных топлив;

активностью при утилизации «тяжелых», а также ароматических углеводородов;

возможностью однократного применения для ремедиации почв и водных поверхностей при сравнительно низких температурах окружающей среды (8-12°С), что особенно актуально для северных нефтедобывающих районов РФ.

В последующем на этапах реализации и внедрения (ТУ-92917-005-2010 и Промышленный регламент №01-МП) экобиопрепарата «Центрум-MMS» был установлен более полный круг его биодеструктивных возможностей. Так, препарат утилизировал не только широкий спектр алифатических, ароматических и нафтеновых углеводородов, таких как: сырая нефть, мазут, бензин, дизельное топливо, но и машинные, моторные и турбинные масла. Возможности разложения и утилизации экобиопрепаратом «Центрум-MMS» других ксенобиотиков, в том числе и НДМГ, ранее не изучались.

Таким образом, с учетом накопленного массива теоретических и экспериментальных данных, для решения экологических задач по очистке территорий и водных поверхностей, загрязненных несимметричным диметилгидразином, перед авторами стояла задача установить наличие биодеструктивной активности экобиопрепарата «Центрум-MMS» в отношении НДМГ и оценить уровень его биологического разложения.

Осуществление изобретения

Для решения поставленной задачи использовали:

экобиопрепарат «Центрум-MMS» (партия 01-17), приготовленный в соответствии с действующими ТУ и Промышленным регламентом;

синтетическую питательную среду (СаCl₂⋅6Н₂O - 0,1 г; MgO₄⋅5H₂O -0,02 г; FeSO₄⋅7H₂O - 0,01 г; Na₂HPO₄ - 3,0 г; Na₂CO₃ - 0,1 г; NH₄Cl - 2,0 г; NaCl - 5,0 г; KН₂РO₄ - 2,0 г; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2 г; глюкоза - 5 г; вода дистиллированная до 1 дм³);

гранулированное фосфорное удобрение - суперфосфат (ГОСТ 5956-78), калий хлористый (ГОСТ 4568-95);

технический образец несимметричного диметилгидразина;

шейкер-инкубатор KS 4000i с колбами вместимостью 250 см³;

лабораторный биореактор емкостью 5 дм³ с принудительной подачей воздуха.

Условия проведения испытаний:

температура реакционной среды - 18-20°С;

время наблюдения - 7 суток;

концентрация НДМГ в шейкере-инкубаторе в реакционной смеси 0.01-1,0%;

концентрация НДМГ в лабораторном биореакторе в реакционной смеси - до 2,0%.

Аналитические исследования экспериментальных образцов на содержание НДМГ проводили двумя независимыми методами: хромато-масс-спектрометрическим и газохроматографическим. Сочетание возможностей двух выбранных аналитических методов позволило идентифицировать и количественно определить основные параметры биологической деструкции НДМГ.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на хромато-масс-спектрометре Trace GC Ultra/DSQII при следующих условиях:

капиллярная колонка TR 5 MS длиной 60 м, диаметром 0,25 мм;

температура инжектора - 200°С;

температура ионного источника - 200°С;

газ-носитель - гелий М 60, скорость подачи 1,2 мл⋅мин^-1;

температура хроматографической колонки во время анализа повышалась от 40 до 200°С со скоростью 10 град⋅мин^-1.

Масс-хроматограммы регистрировали в диапазоне массовых чисел 35-300. Идентификацию осуществляли с использованием электронной библиотеки масс-спектров «NIST 2005».

Газохроматографический анализ осуществляли при следующих оптимальных условиях:

температура хроматографической колонки 80°С температура испарителя 120°С температура детектора 320°С скорость подачи газа-носителя (азот) 28 мл⋅мин^-1 скорость подачи водорода 16 мл⋅мин^-1 скорость подачи воздуха 150 мл⋅мин^-1

Объем каждой пробы рабочих растворов, вводимых в колонку хроматографа, равнялся 0,2 мкл.

Регистрацию сигналов детектора и обсчет хроматограмм проводили с использованием программного комплекса «ЦветХром». Градуировочную зависимость для количественной оценки компонентов оценивали по результатам анализа калибровочных проб.

Каждый образец анализировали трижды. Для этого в пенициллиновый флакон с 10,0±0,5 г гидроксида калия вводили 2,0 мл исследуемого раствора. Затем флакон закрывали резиновой пробкой с прокладкой из фторопластовой пленки, надевали алюминиевый колпачок и обжимали прессом (либо использовали герметизирующее устройство). Встряхивали флакон несколько раз, помещали в термостат и выдерживали 15 мин при температуре 80°С. На анализ из флакона отбирали 1,0 см газовой фазы шприцем, предварительно прогретым до 80°С.

Результаты выполненных экспериментальных исследований представлены в таблице.

Примечания:

1. Патент на изобретение РФ №2174553 от 11 февраля 1998 г.

2. Патент на изобретение Республики Казахстан №19817 от 15 декабря 2010 г.

Таким образом, в результате проведенных экспериментальных исследований впервые установлено наличие у экобиопрепарата «Центрум-MMS» ранее не известного свойства - способности подвергать биодеструкции такой экотоксикант I класса опасности, как несимметричный диметилгидразин.

Полученные экспериментальные результаты позволяют утверждать, что аэробные бактерии, являющиеся основой экобиопрепарата «Центрум-MMS», видов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis AC-1769, обладают способностью использовать в качестве единственного источника углерода и азота НДМГ. Укажем также, что по данным аналитических исследований наиболее частыми продуктами биологического разложения гептила являлись ди- и триметиламины, азометан, тетраметилметандиамид, которые определяли только на 1-6 сутки наблюдения. Нитрозодиметиламин в составе анализируемых проб не обнаруживали, что косвенно свидетельствует о протекании процессов превращения НДМГ именно по биодеструктивному типу.

Установлено, что указанный биодеструктор эффективно разлагает НДМГ в воде при концентрациях от 0,5% и выше (до 1,58%), что существенно превосходит аналогичные показатели для существующих прототипов. Значимыми отличиями являются более высокая интенсивность разложения экотоксиканта, о чем свидетельствуют сравнительно короткие сроки биодеструкции, а также более низкая температура протекания процессов разложения гептила при использовании препарата «Центрум-MMS», чем у известных прототипов: 6-7 суток при 18-20°С и 20-25 суток при температурах до 30-35°С соответственно.

Установлен также перечень и оптимизированы в ходе выполнения экспериментальных исследований технологические параметры, позволяющие достичь в реакционной среде максимальной биодеструкции несимметричного диметилгидразина, которые были равны:

концентрация водородных ионов, ед. рН 6,2-7,8 температура, °С 20-25 масса вносимого экобиопрепарата (до концентрации биокомпонента), кл-см^-3 10⁸-10⁹ продолжительность воздействия, сут. 6-7 кратность обработки экобиопрепаратом, раз 1 уровень аэрируемости, мг⋅дм^-3 15-20

количество вносимых добавок, г⋅дм^-3:

суперфосфат гранулированный 5,0 калий хлористый 2,5

Таким образом, впервые получены экспериментальные данные, подтверждающие способность ассоциации бактериальных микроорганизмов видов Pseudomonas fluorescens ВКМ-6847 и Rhodococcus erythropolis Ac-1769, входящих в состав экобиопрепарата «Центрум-MMS», подвергать биологической деструкции НДМГ в водных растворах. Эффективность разложения несимметричного диметилгидразина была существенно выше, чем у описанных ранее других видов микроорганизмов и их ассоциаций. Предложен для применения экобиопрепарат «Центрум-MMS» для биологической деструкции несимметричного диметилгидразина - органического соединения I класса опасности, используемого в качестве ракетного топлива.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен экобиопрепарат «Центрум-MMS», представляющий собой ассоциацию микроорганизмов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1769, который предложено применять для биодеградации несимметричного диметилгидразина. Изобретение позволяет снизить количество несимметричного диметилгидразина в водных растворах более чем в 50 раз. 1 табл.

Применение экобиопрепарата «Центрум-MMS» для очистки от нефти и нефтепродуктов в качестве биологического деструктора водных растворов несимметричного диметилгидразина.