КОМБИНАЦИЯ ИНГИБИТОРОВ NO-СИНТЕТАЗЫ И УЛАВЛИВАТЕЛЕЙ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА Российский патент 2001 года по МПК A61K45/06 A61P9/00 A61P9/10 A61P25/00 A61P29/00 A61P35/00 A61P37/00 

Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента по крайней мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и по крайней мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение относится также к продукту, содержащему по меньшей мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетаэу, и по меньшей мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, в виде комбинированного продукта из отдельных форм этих активных ингредиентов.

Фармацевтическая композиция и препарат настоящего изобретения обладают преимуществами при лечении патологических состояний, в возникновении которых принимают участие монооксид азота и реакционноспособные формы кислорода, в частности:
- кардиоваскулярные и цереброваскулярные расстройства, включая, например, атеросклероз, мигрень, артериальную гипертонию, септический шок, кардиальный и церебральный инфаркты ишемической или геморрагической природы, ишемию и тромбоз;
- расстройства центральной или периферической нервной системы, такие как, например, нейродегенеративные заболевания, включая, в частности, инфаркт головного мозга, сенильную деменцию, в том числе болезнь Альцгеймера, хорею Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Кретцфельда-Якоба, заболевания, вызванные прионами, боковой амиотрофический склероз, а также боль, церебральная травма или травма спинного мозга, зависимость от опиатов, алкоголя и других веществ, вызывающих привыкание, эректильная дисфункция и репродуктивные расстройства, расстройства восприятия, энцефалопатия, депрессия, беспокойство, шизофрения, эпилепсия, расстройства сна, нарушения питания (анорексия, булимия);
- пролиферативные и воспалительные изменения, такие как, например, атеросклероз, легочная гипертония, гломерулонефрит, портальная гипертензия, псориаз, остеоартрит и ревматоидный артрит, фиброз, амилоидоз, воспаление желудочно-кишечной системы (колиты, болезнь Крона) или легочной системы и воздухоносных путей (астма, синуситы);
- понос, рвота, в том числе аутакоидной природы, радиоактивное облучение, солнечное излучение (УФ-А, УФ-В);
- трансплантация органов; аутоиммунные и вирусные заболевания, такие как, например, волчанка, СПИД, паразитарные и вирусные инфекции, диабет, рассеянный склероз, миопатия;
- рак; и
- все патологические состояния, характеризующиеся продукцией или дисфункцией монооксида азота и/или реакционноспособных форм кислорода.

При всех этих патологических состояниях экспериментально продемонстрировано участие монооксида азота или реакционноспособных форм кислорода (Kerwin et al. , Nitric oxide: a new paradigm for second messengers, J. Med. Chem. 38, 4343-4362, 1995; Halliwell B., Gutteridge JMC., Free radicals in biology and medicine, 2nd ed., Oxford, Clarendon Press, 1989). Изобретение иллюстрируется особенно ярко на примере экспериментальной модели инфаркта головного мозга (Buisson et al., The neuroprotective effect of a nitric oxide inhibitor in a rat model of focal ischemia., Br.J. Pharmacol. 106, 766-767, 1992; Nowicki et al., Nitric oxide mediates neuronal cell death after focal cerebral ischemia in the mouse, Eur. J. Pharmacol. 204, 339-340, 1991; Zhao et al. , Delayed treatment with the spin trap-phenyl-N-tent-butyl nitrone (PBN) reduces infarct size following transient middle cerebral artery occlusion in rats, Acta. Physiol. Scando, 1994; Schulz et al., Improved therapeutic window for treatment of histotoxic hypoxia with a free radical spin trap, J. Cereb. Blood Flow Metab. 15, 948-952 (1995)). В этой связи, лекарственные вещества, которые способны ингибировать образование монооксида азота или реакционноспособных форм кислорода, могут дать положительный эффект. Комбинации этих двух активных ингредиентов, а именно ингибитора NO-синтетазы и улавливателя реакционноспособных форм кислорода, до сих пор не было получено. Как следует из экспериментальной части, эти два активных ингредиента действуют синергично. Действительно, при введении субактивных доз (т.е. доз, которые сами по себе не дают терапевтического эффекта) этих двух активных ингредиентов в комбинации достигается существенный терапевтический эффект. Преимущество данной комбинации заключается в значительном снижении доз каждого активного ингредиента, тем самым значительно уменьшается проявление нежелательных эффектов при достижении терапевтической эффективности. Это изобретение особенно хорошо проиллюстрировано на патологической модели нейродегенерации: церебральной ишемии с реперфузией.

Таким образом, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента по крайней мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и по крайней мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

Более конкретно, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода.

Термин "ингибитор NO-синтетазы" используется для обозначения любого специфического или неспецифического ингибитора одной из ее изоформ независимо от того, является ли она конститутивной (нейрональной или эндотелиальной) или индуцируемой. (Kerwin et al., Nitric oxide: a new paradigm for second messengers, J. Med. Chem. 38, 4343-4362, 1995).

Термин "улавливатель реакционноспособных форм кислорода" используется для обозначения любого химического или ферментативного вещества, способного противодействовать или улавливать хотя бы одну из реакционноспособных форм кислорода, таких как O₂ ^o, OH^-, RO₂ ^o, RO^o, ONO₂ ^-, NO^o, NO₂ ^o или H₂O₂ (Halliwell B. , Gutteridge JMC., Free radicals in biology and medicine, 2^nd ed. , Oxford, Clarendon Press, 1989). Эти вещества могут быть природными или синтетическими и обладать антиоксидантными свойствами. (Santrucek and Krepelka, Antioxidants - Potential chemotherapeutic agents. Drugs Future 13, 975-996, 1988; Jackson et al., Antioxidants: a biological defense mechanism for the prevention of atherosclerosis, Med. Res. Reviews 13, 161- 182 (1993); Aruoma, Characterization of drugs as antioxidant prophylactics. Free Rad. Biol. Med. 20, 675-705 (1996)).

В соответствии с изобретением в фармацевтической композиции ингибитор NO-синтетазы и улавливатель реакционноспособных форм кислорода могут быть в раздельном виде или в комбинированном виде, образуя соль. Предпочтительно, чтобы соль образовывалась из производного вещества, ингибирующего NO-синтетазу и содержащего по крайней мере одну основную группу, и производного вещества, улавливающего реакционноспособные формы кислорода и содержащего по крайней мере одну кислотную группу. Так, соли могут быть получены в соответствии с методами, известными специалистам, из ингибиторов NO-синтетазы, таких как, например, амидины, гуанидины, пиридины или пиперидины, как определено ниже, и улавливатели реакционноспособных форм кислорода, таких как, например, кислоты фенола, указанные далее, в частности 3,5-ди-трет-бутил-4- гидроксибензойная кислота, кофейная (коффеиновая) кислота, синаповая кислота или галловая кислота.

Изобретение также относится к продукту, содержащему по крайней мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и по крайней мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, и используемому в виде комбинированного продукта из отдельных форм для одновременного или последовательного введения при лечении патологических состояний, в патогенезе которых участвуют монооксид азота и реакционноспособные формы кислорода, таких как кардиоваскулярные и цереброваскулярные заболевания, расстройства центральной и переферической нервной системы, пролиферативные и воспалительные заболевания, трансплантация органов, аутоиммунные и вирусные заболевания, рак и все патологические состояния, характеризующиеся продукцией или дисфункцией монооксида азота и/или реакционноспособных форм кислорода.

В фармацевтической композиции или продукте ингибитор NO-синтетазы и улавливатель реакционноспособных форм кислорода могут быть в одинаковых или различных дозах. Дозировки выбираются с учетом соединений, смешанных с подходящими растворителями или наполнителями.

Ингибитор NO-синтетазы и улавливатель реакционноспособных форм кислорода могут быть введены одновременно или последовательно, одним и тем же или различными путями введения, в зависимости от того, в каком виде они находятся - раздельном или комбинированном. Предпочтительно препарат вводить перорально, парентерально или местно.

Ингибиторами NO-синтетазы являются соединения аминокислотного и неаминокислотного типов. Ингибиторы NO-синтетазы аминокислотного типа могут представлять собой соединения, описанные в заявках WO 95/00505, WO 94/12163, WO 96/06076 и ЕР 230037, включенных в настоящую заявку в виде ссылки, или производные L-аргинина, орнитина или лизина, описанные в заявках WO 93/24126, WO 95/01972, WO 95/24382, WO 95/09619 и WO 95/22968, включенных в настоящую заявку в виде ссылки.

Ингибиторами NO-синтетазы неаминокислотного типа могут быть соединения, относящиеся к одной группе соединений, включающей гуанидины, изотиомочевины, нитро- или цианоарилы, аминопиридины или аминопиримидины, амидины, индазоды или имидазолы.

Гуандиновыми ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения, описанные в заявках WO 95/28377, WO 91/04023, WO 94/21621, WO 96/18607 и WO 96/18608, включенных в настоящую заявку в виде ссылки.

Изотиомочевинными ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения, описанные в заявках WO 95/09619, WO 96/09286, WO 94/12165, WO 96/14842, WO 96/18607, WO 96/18608, WO 96/09286, EP 717040 и с EP 718294, включенных в настоящую заявку в виде ссылки.

Нитро- и цианарильными ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения, описанные в заявке WO 94/12163, включенной в настоящую заявку в виде ссылки.

Аминопиридиновыми или аминопиримидиновыми ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения, описанные в заявках WO 94/14780, WO 96/18616 и WO 96/18617, включенных в настоящую заявку в виде ссылки.

Амидиновыми ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения, описанные в заявках WO 95/11014, WO 96/01817, WO 95/05363, WO 95/11231, WO 96/14844 и WO 96/19440, включенных в настоящую заявку в виде ссылки, или соединения, такие как N-фенил- 2-тиофенкарбоксимидамид.

Индазольными ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения общей формулы IA

в которой R₁ представляет один или несколько заместителей, выбранных из атома водорода, нитро-, галогена, низшего алкила или низшего алкокси.

Имидазольными ингибиторами NO-синтетазы могут быть соединения общей формулы IIA

в которой R₂ и R₃ независимо представляют атом водорода, галогена, гидрокси, амино, алкил или алкокси, или R₂ и R₃ объединены с образованием фенильного радикала, конденсированного с имидазольным кольцом, где фенильный радикал необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из гидрокси, трифторметила, галогена, карбокси, низшего алкила, низшего алкокси или низшего алкенила; R₄ представляет атом водорода, низший алкил, амино, низший алкиламино или фенил; где фенильный радикал необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из гидрокси, трифторметила, галогена, карбокси, низшего алкила или низшего алкенила; R₅ представляет атом водорода, низший алкил, амино, низший алкиламино.

Улавливатели реакционноспособных форм кислорода могут быть выбраны из аскорбиновой кислоты, N-ацетилцистеина, β-каротина (Hao Chen et al., Free Radical Biology and Medicine 18(5), 949-953 (1995)), кофермент Q10 (S. Tereao et al., J. Org. Chem., 44, 868 (1979)) или каптодативные соединения (H. G. Viehe et al., Acc. Res. 18, 148-154 (1985)), включенные в качестве ссылок в настоящую заявку. Улавливатели реакционноспособных форм кислорода могут также быть выбраны из фенольных соединений, нитронов, производных индола, имидазолов или карбазолов, или они могут быть ферментами, способными нейтрализовать хотя бы одну из реакционноспособных форм кислорода, такими как пероксид дисмутазы, каталазы или глутатионпероксидазы и их миметики.

Улавливатели реакционноспособных форм кислорода фенольной природы включают пробукол, убихинон, производные токоферола, а именно или δ-токоферол или фенольные флавоноиды (R.A. et al., Phytochemistry 27(4), 969-978 (1988)), включенные в настоящую заявку в виде ссылки. Улавливатели реакционноспособных форм кислорода фенольной природы могут также быть выбраны из соединений, соответствующих общей формуле IB или IIB

в которой R'₁ представляет один или несколько заместителей, выбранных из атома водорода, гидрокси, галогена, карбокси, низшего алкила, низшего алокси, низшего алкенила или алоксикарбонила; алкильный, алкоксильный и алкенильный радикалы, необязательно замещенные гидрокси, галогеном, карбокси или амино; R'₂ представляет один или несколько заместителей, выбранных из атома водорода или необязательно замещенных низших алкильных радикалов, низших алкокси, гидрокси, галогена, амино или карбокси.

Нитронные улавливатели активных форм кислорода могут быть соединениями, описанными в заявках WO 96/15110, WO 88/05044 и в патенте США 5310916, включенных в настоящую заявку в виде ссылки.

Улавливатели реакционноспособных форм кислорода, производные индола, могут представлять собой соединения, соответствующие общей формуле IIIB

в которой R'₃ представляет один или несколько заместителей, выбранных из атома водорода, гидрокси, галогена, низшего алкила и низшего алкокси; R'₄ представляет один или несколько заместителей, выбранных из атома водорода галогена, гидрокси, амино, карбокси или алкилкарбониламиноалкила.

Улавливатели реакционноспособных форм кислорода, производные индола, могут также представлять собой соединения, описанные в заявке WO 96/26941.

Имидазольные улавливатели реакционноспособных форм кислорода включают предпочтительно сами имидазолы или циметидин.

Карбазольные улавливатели реакционноспособных форм кислорода могут включать 4-гидроксикарбазол или карведилол.

Термин "низший", используемый здесь в отношении алкильной или алкоксильной групп, обозначает насыщенные, линейные или разветвленные алифатические углеводородные группы, имеющие от 1 до 6 атомов углерода, такие как, например, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, метокси и этокси. В отношении алкенильной группы, термин "низший" обозначает группы, в которых присутствуют от 2 до 6 атомов углерода и одна или несколько двойных или тройных связей, такие как, например, группы винил, аллил, пропенил, изопропенил, пентенил, бутенил, гексанил, пропенил и бутаденил. Термин "галоген" обозначает хлор, бром, йод или фтор.

Более конкретно, изобретение относится к композиции или продукту, описанным выше, характеризующимся тем, что:
- ингибитор, NO-синтетазы выбран из группы, включающей L-нитроаргинин (LNA), метиловый эфир L-нитроаргинина (LNAME), L-N-монометиларгинин (LNMMA), аминогуанидин, агматин, 2-амино-1-(метиламино)бензимидазол, 5-нитроиндазол, 6-нитроиндазол, 7-нитроиндазол, 1,2-(трифторметилфенил)имидазол (TRIM), 2-амино-4-метил-6-(2-аминоэтил)пиридин, 2-иминопиперидин, 2-иминогомопиперидин, 2-имино-5,6-дигидро-1,3-тиазин, 2-имино-5,6-дигидро-1,3-оксазин, N-фенил-2-тиофенкарбоксимидамид, 2-иминотетрагидропиримидин, S-этилизотиомочевину, S-метил-L- тиоцитруллин или S-этил-L-тиоцитруллин; и
улавливатель реакционноспособных форм кислорода выбран из группы, включающей пробукол, убихинон, или или δ-токоферол, 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойную кислоту, 2,3,6-триметил-2-гексилоксифенол, 2,6-ди-трет-бутил-4-метоксифенол, евгенол, тролокс, н-пропилгаллат, темпол, кофейную кислоту, синаповую кислоту, галловую кислоту, 2,2,5,5-тетраметил-3-пирролин-1-оксил-3-карбоновую кислоту, мелатонин, 5-гидроксиндол-2-карбоновую кислоту, имидазол, циметидин, аскорбиновую кислоту, N-ацетилцистеин, β-каротин, конфермент Q10, каптодативные соединения, 9-[2-(4-морфолинил)этил]-2,4-ди-1-пирролидинил- 9Н-пиримидо[4,5-b]индол, 4-гидроксикарбазол или карведилол.

Соединения, которые являются ингибиторами NO-синтетазы и улавливателями реакционноспособных форм кислорода, представляют собой продажные продукты или они могут быть получены способами, известными специалистам (или по аналогии с последними) (P. Hamley et al., Bioorganic and medicinal chemistry letters, vol. 5(15), 1573-1576 (1995); W.M. Moore et al., J. Med. Chem., 39, 662-672 (1996); E.P. Garvey et al. The Journal of Biological Chemistry, vol. 269 (43), 26669-26676 (1994)).

Ниже приводятся примеры для иллюстрации указанных способов, которые никаким образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

Экспериментальная часть
Пусть А будет ингибитором NO-синтетазы, а В - улавливателем реакционноспособных форм кислорода.

Пример 1.

Соединение AB представляет собой комбинацию активных ингредиентов A и B в виде соли, в которой A и B присутствуют в эквимольном количестве, где соединением A является аминогуанидин, ингибитор индуцируемой NO-синтетазы, а соединением B является 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойная кислота, антиоксидантный улавливатель свободных радикалов, содержащих кислород. Соединение A (30 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке (10 мл/кг). Соединение В (20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке. Комбинацию AB (A 30 мг/кг + B 20 кг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке.

Пример 2.

Соединение AB представляет собой комбинацию активных ингредиентов A и B в отдельных формах, где соединением A является 7-нитроиндазол - ингибитор конститутивной NO-синтетазы нейронального типа, а соединением B является 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойная кислота - антиоксидантный улавливатель свободных радикалов, содержащих кислород.

Соединение A (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке (10 мл/кг с 0,2% montanox 80).

Соединение B (20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке (10 мг/кг с 0,2% montanox 80).

Комбинацию AB (A 10 мг/кг + B 20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке (10 мг/кг с 0,2% montanox 80).

Пример 3.

Соединение AB представляет собой комбинацию активных ингредиентов A и B в отдельных формах, вводимых различными путями, где соединением A является NG нитроаргинин - мощный ингибитор конститутивной и индуцируемой NO-синтетазы, а соединением B является 3,5-ди-трет-бутил -4-гидроксибензойная кислота - антиоксидантный улавливатель свободных радикалов, содержащих кислород.

Соединение A (0,03 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке (2 мл/кг).

Соединение B (20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в физиологической сыворотке.

Комбинацию AB (А 0,03 мг/кг внутривенно + B 20 мг/кг внутрибрюшинно).

Во всех случаях композиции получают обычным способом смешивания составляющих.

Фармакологическое исследование продуктов изобретения
Соединения изобретения были подвергнуты некоторым биологическим тестам in vitro и in vivo с целью доказательства их активности при блокировании NO-синтетазы (конститутивной и индуцируемой) и захватывании свободных радикалов. Их активность оценивали на модели очаговой ишемии головного мозга крыс. На этой модели, которая рассматривается как модель тяжелого инфаркта головного мозга, близкая к клинической ситуации у человека, было показано избыточное высвобождение монооксида азота и реакционноспособных форм кислорода, а также частичное защитное действие ингибиторов NO-синтетазы или улавливателей реакционноспособных форм кислорода. Эффекты комбинированного препарата сравнивали с эффектами, наблюдаемыми при обработке отдельно ингибитором монооксида азота или улавливателем реакционноспособных форм кислорода. Комбинация ингибитора NO-синтетазы или улавливателя реакционноспособных форм кислорода обладает значительно более сильным защитным эффектом при очаговой ишемии головного мозга, тогда как эффект ингибитора NO-синтетазы или улавливателя реакционноспособных форм кислорода, вводимых отдельно в тех же дозах, был незначительным. Это доказывает синергизм между ингибитором NO-синтетазы или улавливателем реакционноспособных форм кислорода.

1) Действие конститутивной NO-синтетазы на мозжечок крысы in vitro
Тест состоит в определении преобразования L-аргинина в L-цитруллин под действием NO-синтетазы. Образцы мозжечка крыс Спраг-Доули (300 г - Чарльз Риве) быстро забирали, делали срезы при 4^oC и гомогенизировали в объеме буфера для экстракции (HEPES 50 мМ, ЭДТА 1 мМ, pH 7,4, пепстатин A 10 мг/мл, лейпептин 10 мг/мл), центрифугировали при 21000 g в течение 15 мин при 4^oC. Анализ осуществляли в стеклянных лабораторных пробирках, в которых находились 100 мкл инкубационного буфера, содержащего 100 мМ HEPES, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 2,5 мМ CaCl₂ 2 мМ дитиотрейтола, 2 мМ восстановленного НАДФ и 10 г/мл кальмодулина. Затем добавляли 25 мкл раствора, содержащего 100 нМ аргинина, меченного тритием (специфическая активность: 56,4 Ки/ммоль, Amersham), и 40 мкМ нерадиоактивного аргинина. Реакцию инициировали путем добавления 50 мкл гомогенизированного продукта до достижения конечного объема 200 мкл (остальными 25 мкл были либо водой или исследуемым продуктом) " Через 15 минут реакцию останавливали добавлением 2 мл стол-буфера (20 мМ HEPES, pH 5,5, 2 мМ ЭДТА) о После пропускания образцов через колонку с 1 мл смолы DOWEX, радиоактивность количественно оценивали на жидкостном сцинтилляционном спектрометре. Результаты выражали в величинах IC₅₀ и суммированы в таблице (первая колонка результатов, озаглавленная "конститутивная NO-синтетаза, образование цитруллина").

2) Действие на индуцируемую NO-синтетазу макрофагов J774A1 мышей in vitro
Макрофаги J774A1 мышей продуцируют большое количество монооксида азота при активации липополисахаридами (ЛПС) и интерференом-γ (ИФН-γ). После активации с помощью ЛПС и ИФН-γ, клетки культивировали в среде ДМЕМ (модифицироваанная по способу Дульбекко среда Игла), обогащенной 10% плодной телячьей сывороткой при 37^oC в атмосфере 5% CO₂; клетки засевали в количестве 5000 клеток/см² в 150-см² сосудах. Инкубирование осуществляли в присутствии ЛПС (1 г/мл) и мышиного ИФН-γ (50 U/мл) в ДМЕМ, обогащенной 10% плодной телячьей сывороткой. NO-синтетазу выделяли с помощью экстракционного буфера (HEPES 50 мМ, pH 7,4, дитиотрейтол 0,5 мМ, пепстатин A 1 мг/мл, лейпептин 1 мг/мл, соевый ингибитор трипсина 1 мг/мл, антипаин 1 мг/мл и PMSF 10 мг/мл). После обработки ультразвуком в экстрагирующем буфере при 4^oC гомогенизированные продукты ультрацентрифугировали (100.00 g с 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойной кислотой при 4^oC в течение 1 часа). Последующая процедура идентична процедуре, описанной для NO-синтетазы мозжечка, за исключением состава инкубационного буфера (100 мМ HEPES, pH 7,4, дитиотрейтола, 2,5 мМ CaCl₂, 10 М тетрагидробиоптерина, FAD 10 мкМ, BSA 1 мг/мл, 2 мМ восстановленного NADPH). Результаты выражены в величинах IC₅₀ и суммированы в табл. 1 (вторая колонка результатов, озаглавленная "индуцируемая NO-синтетаза, образование цитруллина").

3) Влияние макрофагов J774 A1 мышей на образование нитритов in vitro
Этот тест проводили для измерения ингибирующей активности продуктов на индицируемую NO-синтетазу в культуре клеток. Клетки выращиваются в среде ДМЕМ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), обогащенной 10% плодной телячьей сывороткой при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. В этом эксперименте клетки распределяли в 96-луночный планшет (50.000 клеток на лунку) и инкубировали в среде ДМЕМ, не содержащей фенола красного и содержащей 10% плодную телячью сыворотку с LPS (1 мк/мл) и мышиный ИФН-γ (50 U/мл) в присутствии или отсутствии исследуемых продуктов. Через 48 часов концентрацию нитритов, продуктов разложения монооксида азота, в культуральной среде измеряли колориметрическим методом по Green et al., (Analytical Biochemistry, 126, 131-138 (1982)). Результаты выражены в величинах IC₅₀ и суммированы в табл. 1 (третья колонка результатов, озаглавленная "индуцируемая NO-синтетаза, образование нитритов").

4) Влияние на образование пероксидных анионов in vitro
Активация клеток макрофагов J774A1 форболмиристатацетатом (РМА) приводит через несколько минут к образованию пероксидных анионов. Эти пероксидные анионы могут окислять люминисцентный субстрат, люминол. В этой реакции выделяются фотоны, образование которых определяли с помощью хемилюминометра. Действие продуктов на образование пероксидных анионов исследовали путем инкубации клеток J774AI при 37^oC в присутствии РМА, исследуемых продуктов и люминола. Результаты выражены в величинах IC₅₀ и приведены в табл. 2.

5) Влияние на очаговую ишемию головного мозга с реперфузией
Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Спраг-Доули (Чарльз Риве) массой от 330 до 360 г. После анестезии изофлураном крысам временно окклюзировали среднюю мозговую артерию по методу, описанному Memezawa et al., (Exp. Brain Res. 89, 67-78, 1992). В переднюю мозговую артерию вводили проволоку, что приводило к окклюзии средней мозговой артерии. Через два часа проволоку удаляли, что восстанавливало кровоток по Виллизиеву кругу. Мониторинг и контроль температуры тела животных проводили в течение 6 часов после окклюзии. Через сорок восемь часов после окклюзии крысам проводили анестезию изофлураном, и подвергали декапитации. Образцы головного мозга быстро забирали и погружали в изопентан при -15^oC на 2 минуты. Затем делали шесть срезов толщиной 2 мм, которые погружали в раствор, содержащий 2% хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия (ТСС), на 20 минут и затем фиксировали формалином. Зона, подвергавшаяся инфаркту, имела белый цвет, а здоровая зона имела красный цвет. Площадь поверхности инфарктной зоны измеряли на участках 6 срезов с помощью анализатора изображения. Объем инфаркта определяли интеграцией этих различных площадей, учитывая, что эти поверхности находятся на расстоянии 2 мм друг от друга. Препараты вводили внутрибрюшинно. Первое введение делали через 4 часа после окклюзии, т.е. через два часа после того, как удаляли проволоку, а затем через 24 часа.

Примеры 1-3 иллюстрируются табл. 3-5.

Результаты показывают, что 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойная кислота, используемая в качестве улавливателя реакционноспособных форм кислорода, не способна в дозе 20 мг/кг оказывать защитное действие у животных при приступах ишемии, и что аминогуанидин (ингибитор NO-синтетазы) имеет низкую активность. С другой стороны, смесь этих двух соединений обеспечивает высокую степень защиты животных от ишемии.

Аналогично, 7-нитроиндазол, используемый в качестве ингибитора конститутивной формы NO-синтетазы, не достаточно эффективен в дозировке 10 мг/кг, но, с другой стороны, при его комбинации с 3,5-ди-трет-4-гидробензойной кислотой наблюдается высокая защитная активность. Эти два активных ингредиента обнаруживают синергичное протективное действие.

Аналогично, NG нитроаргинин, используемый в качестве ингибитора NO-синтетазы при внутривенном введении в дозе 0,03 мг/кг, неактивен. С другой стороны, при его комбинации с 3,5-ди-трет-4-гидробензойной кислотой, введенной внутрибрюшинно, наблюдается высокая защитная активность. Этот защитный эффект показывает, что синергизм между двумя активными ингредиентами наблюдается также и в том случае, когда активные ингредиенты вводили разными путями.

Изобретение может быть использовано в медицине для лечения патологических состояний, в возникновении которых принимают участие монооксид азота и реакционноспособные формы кислорода. Заявлен фармацевтический препарат для указанного выше назначения, содержащий по меньшей мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и по меньшей мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода. Заявлен другой вариант препарата, выполненный в виде раздельных форм для одновременного или последовательного использования. Одна из форм содержит по меньшей мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, а другая - по меньшей мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода. Соединения фармацевтических препаратов действуют синергично. Это позволяет снизить дозы активных веществ и тем самым уменьшить проявление нежелательных побочных эффектов при использовании новых препаратов. 2 с. и 13 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Фармацевтический препарат для лечения патологических состояний, в которых принимают участие монооксид азота и реакционноспособные формы кислорода, содержащий по меньшей мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и по меньшей мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода. 2. Фармацевтический препарат по п.1, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый носитель. 3. Фармацевтический препарат по п.1 или 2, в котором вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, находятся в виде солей. 4. Фармацевтический препарат по п.3, в котором соль вещества, ингибирующего NO-синтетазу, содержит по меньшей мере одну основную группу, а соль вещества, улавливающего реакционноспособные формы кислорода, содержит по меньшей мере одну кислотную группу. 5. Фармацевтический препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором веществом, ингибирующим NO-синтетазу, является аминокислота, например, производные L-аргинина, орнитина или лизина, или соединение из группы, включающей гуанидины, изотиомочевины, нитро- или цианарилы, аминопиридины или аминопиримидины, амидины, индазолы или имидазолы, а веществом, улавливающим реакционноспособные формы кислорода, является аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, β-каротин, кофермент Q10, каптодативные соединения или соединения, выбранные из группы, включающей фенолы, нитроны, производные индола, имидазолы, карбазолы. 6. Фармацевтический препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором вещество, ингибирующее NO-синтетазу, выбрано из группы, включающей L-нитроаргинин; метиловый эфир L-нитроаргинина; L-N-монометиларгинин; аминогуанидин, агматин; 2-амино-1-(метил-амино)бензимидазол; 5-нитроиндазол; 6-нитроиндазол, 7-нитроиндазол; 1,2-(трифторметилфенил)имидазол; 2-амино-4-метил-6-(2-аминоэтил)-пиридин; 2-иминопиперидин; 2-иминогомопиперидин; 2-имино-5,6-дигидро-1,3-тиазин; 2-имино-5,6-дигидро-1,3-оксазин; 2-иминотетрагидропиримидин; N-фeнил-2-тиoфeнкapбoкcимидaмид; S-этил-изо-тиомочевину; S-метил-L-тиоцитруллин или S-этил-L-тиоцитруллин, а вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода, выбрано из группы, включающей пробукол; убихинон; или δ-токоферол; 3,5-ди-третбутил-4-гидроксибензойную кислоту; 2,3,6-триметил-2-гексилоксифенол; 2,6-ди-третбутил-4-метоксифенол; евгенол; тролокс; Н-пропилгаллат; темпол, кофейную кислоту; синаповую кислоту; галловую кислоту; 2,2,5,5-тетраметил-3-пирролин-1-оксил-3-карбоновую кислоту; мелатонин; 5-гидроксиндол-2-карбоновую кислоту; имидазол; циметидин; аскорбиновую кислоту; N-ацетилцистеин; β-каротин; кофермент Q10; каптодативные соединения; 9-[2-(4-морфолинил)этил]-2,4-ди-1-пирролидинил-9Н-пиримидо[4,5-b]индол; 4-гидроксикарбазол или карведилол. 7. Фармацевтический препарат для лечения патологических состояний, в которых принимает участие монооксид азота и реакционноспособные формы кислорода, выполненный в виде раздельных форм для одновременного или последовательного использования, одна из которых содержит по меньшей мере одно вещество, ингибирующее NO-синтетазу, а другая - по меньшей мере одно вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода. 8. Фармацевтический препарат по п.7 для лечения таких патологических состояний, как кардиоваскулярные и цереброваскулярные заболевания, нарушения центральной и периферической нервной системы, пролиферативные и воспалительные заболевания, понос, рвота, радиоактивное облучение, облучение солнечным светом, трансплантация органов, аутоиммунные и вирусные заболевания, рак и все патологические состояния, характеризующиеся продукцией или дисфункцией монооксида азота и/или реакционноспособных форм кислорода. 9. Фармацевтический препарат по п.7 для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний, таких как атеросклероз, мигрень, артериальная гипертония, септический шок, кардиальный и церебральный инфаркты ишемической или геморрагической природы, ишемия и тромбоз. 10. Фармацевтический препарат по п.7 для лечения нарушений центральной или периферической нервной системы, таких как нейродегенеративные заболевания, боль, травмы головного и спинного мозга, зависимость от опиатов, алкоголя и других веществ, вызывающих привыкание, эректильная дисфункция и расстройства репродуктивной функции, расстройство познавательной способности, энцефалопатия, депрессия, беспокойство, шизофрения, эпилепсия, расстройство сна, нарушение питания. 11. Фармацевтический препарат по п.7 для лечения пролиферативных и воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, легочная гипертензия, гломерулонефрит, портальная гипертензия, псориаз, остеоартрит и ревматоидный артрит, фиброз, амилоидоз, воспаление желудочно-кишечной системы или легочной системы и воздухоносных путей. 12. Фармацевтический препарат по п.7 для лечения аутоиммунных и вирусных заболеваний таких как волчанка, СПИД, паразитарные и вирусные инфекции, диабет, рассеянный склероз, миопатия. 13. Фармацевтический препарат по любому из пп.7-12, содержащий вещество, ингибирующее NO-синтетазу, и вещество, улавливающее реакционноспособные формы кислорода. 14. Фармацевтический препарат по любому из пп.7-13, в котором ингибитором NО-синтетазы является аминокислота и, более конкретно, производные L-аргинина, орнитина или лизина, или соединение из группы, включающей гуанидины, изотиомочевины, нитро- или цианарилы, аминопиридины или аминопиримидины, амидины, индазолы, имидазолы, и улавливателем реакционноспособных форм кислорода является аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, β-каротин, кофермент Q10, каптодативные соединения или соединение из группы, включающей фенолы, нитроны, производные индола, имидазолы, карбазолы, пероксид дисмутазы, каталазы или глутатионпероксидазы. 15. Фармацевтический препарат по любому из пп.7-14, в котором ингибитор NO-синтетазы выбран из группы, включающей L-нитроаргинин; метиловый эфир L-нитроаргинина; L-N-монометиларгинин, аминогуандин; агматин, 2-амино-1-(метиламино)бензимидазол, 5-нитроиндазол; 6-нитроиндазол; 7-нитроиндазол; 1,2-(трифторметилфенил)имидазол; 2-амино-4-метил-6-(2-аминоэтил)пиридин; 2-иминопиперидин; 2-иминогомопиперидин; 2-имино-5,6-дигидро-1,3-тиазин; 2-имино-5,6-дигидро-1,3-оксазин; 2-иминотетрагидропиримидин; N-фенил-2-тиофенкарбоксимидамид; S-этилизотиомочевину; S-метил-L-тиоцитруллин или S-этил-L-тиоцитруллин, и улавливатель реакционноспособных форм кислорода выбран из группы, включающей пробукол; или δ-токоферол; 3,5-ди-третбутил-4-гидроксибензойную кислоту; 2,3,6-триметил-2-гексилоксифенол; 2,6-ди-третбутил-4-метоксифенол; евгенол; тролокс; Н-пропилгаллат; темпол; кофейную кислоту; синаповую кислоту; галловую кислоту; 2,2,5,5-тетраметил-3-пирролин-1-оксил-3-карбоновую кислоту; мелатонин; 5-гидроксиндол-2-карбоновую кислоту; имидазол, циметидин, аскорбиновую кислоту, N-ацетилцистеин, β-каротин, кофермент Q10; каптодативные соединения; 9-[2-(4-морфолинил)этил] -2,4-ди-1-пирролидинил-9Н-пиримидо[4,5-b] индол; 4-гидроксикарбазол или карведилол.