Изобретение касается предмета, охарактеризованного в формуле изобретения, то есть способа магниторелаксометрического качественного и/или количественного обнаружения аналитов в жидких и твердых фазах, соединений для магниторелаксометрического обнаружения и их применения в аналитике и иммуномагнитографии.
Известно, что иммунная сцинтиграфия позволяет обнаруживать патологические структуры на живом организме с помощью радиоактивно маркированных, имеющих специфическую структуру веществ, которые ниже обозначаются как маркеры. Обычно для этих целей используются маркированные γ-лучами антитела или фрагменты антител. Наряду с этим используются или же опробуются с целью исследования и другие имеющие специфическую структуру вещества, как, например, пептиды или олиго- или полинуклеиновые кислоты. Однако во всех этих способах доля специфически связанной радиоактивности в общем мала. В соответствии с этим при таких исследованиях уровень неспецифически связанных и тем самым циркулирующих в крови или аккумулирующихся в таких органах, как печень, почки, мочевыводящие пути или мочевой пузырь, маркеров очень высока. Это высокое фоновое излучение препятствует во многих случаях достаточной степени обнаружения патологических структур. Панхапакезан [Immunol. Cell. Biol., 70 (1992) 295] и Циглер [New England Journal of Medicine, 324 (1991) 430] указывают поэтому на возможности улучшения иммунной сцинтиграфии. Подобные возможности описываются также и в EP 0251494. Большинство из этих способов имеют своей целью ускорение выделения неспецифически связанной радиоактивности.
Далее, неоднократно предлагалось применение сопряженных с парамагнитными или суперпарамагнитными веществами антител или фрагментов антител для локализации патологических структур на живом организме. В качестве способов обнаружения для подобных маркированных антител до сих пор в расчет принимались ядерная спинтомография или основанная на изменениях сусцептибильности магнитометрия (WO 93/05818 и WO 91/15243). Но и при этих способах обнаружения проблема переменной составляющей сигнала вследствие несвязанных компонентов маркера, а также вследствие естественных вариаций сусцептибильности и релаксивности ткани сохраняется. Далее, методы зачастую являются недостаточно чувствительными для того, чтобы обнаруживать незначительные количества специфически связанных маркеров.
Способ, который делает возможным лишь обнаружение части связанных маркеров и в результате этого не подпадает под влияние количества несвязанных маркеров, наоборот, является неизвестным.
Далее, известно, что количественные методы иммунного анализа, а также другие методы анализа связывания (например, методы блокирования рецептора) позволяют определять в пробах различного состава большое число веществ, которые могут обладать также биологическим соответствием. Однако, как правило, одним методом определяется лишь один параметр на пробу. Актуальный обзор различных способов дает T. Chard [An Introduction to Radio-immunoassay and Related Techniques: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 4. ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1990)]. Основой всех этих методов связывания является высокая чувствительность индикации маркированных изотопами или другим образом соединений с большой специфичностью рецепторных реакций лиганд.
Известные способы проведения анализа имеют, однако, следующие недостатки.
Способы одновременного определения различных аналитов внутри одной и той же пробы базируются на привязывании по-разному маркированных радиологически, флюоресцентно или энзимологически проб к аналитам. При этом, как правило, после последующей сепарации и промывки замеряется несвязанная или же связанная активность зонда для количественного определения аналита. При этом количество используемых различных меченых атомов зонда сильно ограничено. Так, например, в случае различных радиоизотопов в качестве зондовой маркировки выступают так называемые перекрывающие феномены, которые приводят к быстрой потере количественной точности индивидуальных сигналов. Комбинация различных энзимов в качестве зондовых меченых атомов является причиной сопоставимых проблем, причем осуществимость здесь затруднена дополнительно необходимым поиском условий реакции, которые позволяют проводить одновременное определение энзимных реакций в одной системе.
Чувствительность способов ограничена, например, неспецифичными взаимодействиями между матрицей и зондом или же лимитированной возможностью маркирования зонда (малая удельная активность).
Успешное осуществление способов часто предполагает переработку полученного материала проб (например, приготовление сыворотки или плазмы из цельной крови, экстракцию проб с помощью органических растворителей, обогащение аналита посредством хроматографических способов и так далее).
Для успешного осуществления способов большей частью недопустимы операции сепарации и промывки, которые служат для разделения связанных и несвязанных рецепторов или же лиганд.
Для осуществления радиоиммунных методов требуется использование дорогих излучающих нуклидов, связанных с большими затратами при работе с ними.
Хранение используемых до этого маркеров на практике зачастую доставляет проблемы, поскольку они либо нестабильны (радиоиммунные методы анализа) и поэтому должны постоянно заново создаваться, или же чувствительно реагируют на воздействия окружающей среды.
Задача настоящего изобретения состояла поэтому в том, чтобы разработать новые способы и вещества, которые бы преодолели недостатки уровня техники и которые были бы, в частности, в состоянии без использования радиоактивных веществ обнаруживать место пребывания и объем связанных маркеров без предварительного отделения несвязанного маркера.
Эта задача решается с помощью настоящего изобретения.
Было обнаружено, что качественное и/или количественное обнаружение аналитов в жидкой и/или твердой фазе удается, если ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы используются в качестве определяемой магнитной маркировки в иммунных методах анализа или в прочих методах анализа связывания, а релаксация их намагничивания определяется как измеряемый параметр.
Ниже сначала описываются способы, которые преодолевают недостатки известных способов осуществления иммунных методов анализа или прочих методов анализа связывания.
Способы согласно изобретению основаны на использовании коллоидальных ферромагнитных или ферримагнитных веществ, называемых ниже также магнитными маркировками, которые комбинируются с индицируемыми веществами, обозначаемыми ниже также аналитами, или с веществами со специфической структурой. Подобные комбинации согласно изобретению из магнитных маркировок с аналитами или с веществами, имеющими специфическую структуру, которые в данном описании изобретения описываются еще подробнее, ниже называются магнитными маркерами. За счет использования понятия коллоидальные вещества или коллоидальные частицы описывается как диапазон размеров частиц или веществ в диапазоне величин коллоидов, то есть диапазон от 1 нм до приблизительно 1000 нм, так и их применение в качестве диспергированной фазы в соответствующей дисперсионной среде, которая в большинстве случаев является водной. Коллоидальные вещества или частицы для целей улучшения способности к хранению или транспортировки могут присутствовать в высушенной или замороженной форме, в то время как для проведения замеров они, однако, присутствуют в состоянии, диспергированном в жидкой фазе.
Далее, способы базируются на специальных технологиях замеров, которые позволяют после намагничивания магнитной маркировки или соответственно магнитных маркеров определять релаксацию намагничивания. Подобные способы замеров, более подробно описанные в этом описании изобретения к патенту, ниже обозначаются в виде магнитной релаксометрии или магниторелаксометрии или магниторелаксометрического обнаружения.
Существенная основа изобретения заключается в том, что намагничивание свободно передвигающихся ферро- или ферримагнитных коллоидальных частиц после отключения внешнего намагничивающего поля в пределах времени замера с помощью двух различных механизмов релаксирует:
(i) вращение всей коллоидальной частицы целиком внутри окружающей ее жидкости, причем постоянная времени зависит от гидродинамического диаметра частиц, включая оболочку, вязкость жидкости-носителя и температуру, что отражает, в основном, параметры окружения частиц, этот механизм обозначается ниже как релаксация по методу Брауна или экстринзический суперпарамагнетизм,
и
(ii) вращение внутреннего вектора намагничивания в пределах коллоидальных частиц, причем постоянная времени очень чувствительно зависит от материала и формы (постоянной анизотропии использованного материала частиц), объема и температуры использованных частиц. Это, в основном, интринзические параметры частиц, этот механизм ниже называется релаксацией по методу Нееля или интринзическим суперпарамагнетизмом.
Задача согласно изобретению решается за счет того, что в процессе иммунных методов анализа или же прочих методов связывания ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы используются в качестве определяемых магнитных маркировок, чья релаксация по методу Брауна в условиях измерений в несвязанном состоянии протекает быстрее, чем релаксация по методу Нееля. Применение подобных ферромагнитных или ферримагнитных коллоидальных частиц позволяет путем изменения доминирующего механизма релаксации или же путем увеличения объема частиц, которое наступает за счет связывания, производить специфическое определение доли связанных магнитных маркеров наряду с несвязанными магнитными маркерами, одновременно присутствующими в измерительной пробе.
За счет применения чувствительных способов измерения при выполнении действий согласно изобретению при использовании ферромагнитных или ферримагнитных коллоидальных частиц могут быть созданы высокочувствительные, обладающие специфической связью иммунные методы анализа или же прочие методы связывания, которые могут быть реализованы как в жидкой, так и в твердой фазе. В качестве особенно чувствительного способа измерения после намагничивания пробы в намагничивающем поле и после отключения поля можно определять релаксацию намагничивания с помощью высокочувствительных детекторов магнитного поля (как, например. Superconducting Quantum Interference Devices (SQUIDs), индукционных катушек, магнитометра "Fluxgate", сенсоров "Giant-Magnetoresistance" или магниторезистивных преобразователей) или же комплексную сусцептибильность пробы как функцию частоты намагничивающего поля.
В предусмотренном в изобретении способе магниторелаксометрического количественного обнаружения аналитов в жидких и твердых фазах имеющие специфическую структуру вещества, связывающие аналиты, сначала маркируют ферримагнитными или ферромагнитными коллоидальными частицами.
Эти имеющие магнитную маркировку и обладающие специфической структурой вещества добавляют к замеряемой жидкой или иммобилизованной пробе, а замеряемая проба намагничивается с помощью приложенного снаружи магнитного поля. После отключения внешнего поля замеряется релаксация намагничивания магнитных маркеров с помощью сенсоров магнитного поля.
Обработка результатов замеров происходит здесь, как и в описанном ниже непосредственном способе проведения анализа, по методике, известной специалисту.
Способ магниторелаксометрического количественного обнаружения аналитов в жидких и твердых фазах согласно изобретению может быть осуществлен так, что аналиты сначала
(i) маркируют ферримагнитными или ферромагнитными коллоидальными частицами, а затем
(ii) эти магнитно маркированные аналиты используются в замеряемой жидкой или иммобилизированной пробе, к которой добавляются вещества, которые специфически связывают аналиты, а замеряемая проба намагничивается с помощью прикладываемого снаружи магнитного поля, и после отключения внешнего поля замеряется релаксация намагничивания магнитных маркеров с помощью сенсоров магнитного поля.
Обработка результатов замеров производится здесь, как и в описанном ниже конкурентном способе проведения испытания, по методике, известной специалисту, то есть аналогично способам, которые применяются в иммунных или радиологических метолах анализа.
В обоих названных выше случаях для проведения анализа может быть привлечено также измерение претерпевшей вследствие связывания измененной комплексной сусцептибильности магнитного маркирующего вещества или же магнитного маркера в качестве функции частоты.
Возможное лишь в исключительных случаях дискриминирование между связанными и несвязанными маркерами становится возможным благодаря использованию их разных механизмов релаксации или благодаря влиянию времени релаксации магнитного маркера, причиной которого является связывание.
Связанные с твердой фазой аналиты в соответствии с изобретением могут, в частности, быть обнаружены за счет того, что имеющие специфическую структуру вещества, связывающие аналиты, сначала
(i) маркируют релаксирующими в диапазоне времени измерения ферримагнитными или ферромагнитными коллоидальными частицами, причем ферримагнитные или ферромагнитные коллоидальные частицы выбирают таким образом, что релаксация по методу Брауна в условиях измерения имеет более короткое время релаксации, чем релаксация по методу Нееля,
а затем
(ii) эти магнитно-маркированные вещества используются в замеряемой иммобилизованной пробе, замеряемая проба намагничивается с помощью прилагаемого снаружи магнитного поля соответствующей напряженности и после отключения наружного поля с помощью сенсоров магнитного поля замеряется релаксация намагничивания магнитных маркеров, причем к анализу привлекаются различные параметры релаксации связанных твердой фазой и несвязанных магнитных маркеров. В качестве измеряемой величины может определяться комплексная сусцептибильность проб как функция частоты.
Также и в этом случае имеется возможность вместо веществ со специфической структурой обнаруживаемые аналиты комбинировать с магнитными маркирующими веществами.
В жидкой фазе аналиты в соответствии с изобретением могут, в частности, быть обнаружены за счет того, что имеющие специфическую структуру вещества, связывающие аналиты, сначала
(i) маркируют ферримагнитными или ферромагнитными коллоидальными частицами, причем ферримагнитные или ферромагнитные коллоидальные частицы выбирают таким образом, что релаксация по методу Брауна в условиях измерения имеет более короткое время релаксации, чем релаксация по методу Нееля,
а затем
(ii) эти магнитно маркированные вещества используют в замеряемой иммобилизованной пробе, замеряемую пробу намагничивают с помощью прилагаемого снаружи магнитного поля соответствующей напряженности и после отключения наружного поля с помощью сенсоров магнитного поля замеряют релаксацию намагничивания магнитных маркеров, причем к анализу привлекают различные параметры релаксации связанных с аналитом, в противоположность несвязанным, магнитных маркеров.
В качестве измеряемой величины может определяться комплексная сусцептибильность проб как функция частоты.
Так же и в этом случае имеется возможность вместо веществ со специфической структурой обнаруживаемые аналиты комбинировать с магнитными маркирующими веществами.
Под веществами со специфической структурой следует понимать все вещества, которые специфически осуществляют привязку к определенным структурам. Под веществами со специфической структурой следует понимать, в частности, антитела, фрагменты антител, биотин или связывающие биотин вещества, как, например, авидин и стрептавидин, специфически привязанные к рецепторам агонисты, как, например, цитокины, лимфокины, эндотелины или их антагонисты, специфические пептиды и протеины, рецепторы, энзимы, субстраты энзимов, нуклеотиды, рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, углеводы, липопротеины и т.п. В качестве веществ, имеющих специфическую структуру, предпочтение отдается веществам, константа связывания которых лежит в диапазоне 105-1015 (моль/л)-1. В частности, предпочтение отдается веществам, которые имеют константу связывания, составляющую от 107 до 1015 (моль/л)-1.
Вещества, имеющие специфическую структуру, или аналиты, подлежащие обнаружению, можно маркировать с помощью ферримагнитных и ферромагнитных частиц, используя способы, которые традиционно применяются в иммунной, пептидной и белковой химии. Особенно предпочтительными являются ковалентные связи между имеющими специфическую структуру веществами или соответственно подлежащими обнаружению аналитами с веществами, образующими стабилизирующую оболочку ферримагнитных или ферромагнитных частиц. Примеры особенно подходящих методов - это активирование и связь с помощью карбодиимидов [Jakoby and Wichek, eds. ; Methods Enzymol, (1974) 34], образование Шиффовых оснований после воздействия периодатов на содержащие углеводы соединения (Wichek and Bauer, eds. Methods Enzymol 184:177), которые далее - при необходимости - еще и подлежат восстановлению для дальнейшей стабилизации, и связь с помощью глютардиальдегида [Heitzmann and Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (1974) 3537] , образование мостиков между бромацетилированными частицами с тиолилированными веществами [Angerer et al.; Cell 9 (1976) 81], а также восстановительное алкилирование (Bayer et al. : J. Histochem. Cytochem. 24 (1976) 933].
Могут быть также получены ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы со стабилизированной оболочкой из имеющего специфическую структуру вещества или из аналита, который подлежит обнаружению, при этом частицы после получения вводятся непосредственно в раствор имеющего специфическую структуру вещества, при необходимости в присутствии других вспомогательных веществ, как, например, протеины, углеводы, а также натуральные, синтетические или частично синтетические поверхностно-активные вещества и т. д. , или же получают непосредственно в присутствии имеющих специфическую структуру веществ.
Соответствующие коллоидальные частицы и суспензии, содержащие эти частицы, описаны, например, в WO 92/12735, WO 92/22586, EP 0186616 и в US 4101435.
Способ согласно изобретению может находить применение, например, в репродуктивной способности, гистосовместимости, аллергологии, инфекциологии, гигиене, генетике, вирусологии, бактериологии, токсикологии, патологии, аналитике окружающей среды и медицинской диагностике.
Следующим предметом настоящего изобретения являются соединения для магниторелаксометрического обнаружения, которые состоят из коллоидальных суспензий свободно двигающихся ферримагнитных или ферромагнитных частиц и имеющих специфическую структуру веществ или же соответственно подлежащих обнаружению аналитов, причем под веществами со специфической структурой следует понимать, в частности, антитела, фрагменты антител, биотин или связывающие биотин вещества, как, например, авидин и стрептавидин, специфически привязывающие к рецепторам агонисты, как, например, цитокины, лимфокины, эндотелины или их антагонисты, прочие специфические пептиды и протеины, рецепторы, энзимы, субстраты энзимов, нуклеотиды, рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, углеводы, липопротеины и т.п.
Соединения для магниторелаксометрического обнаружения могут состоять также из комбинаций множества ферромагнитных или ферримагнитных частиц с различаемым временем релаксации, поскольку при использовании различных магнитных маркировок с соответствующим очень узким распределением времени релаксации и/или магнитных моментов для разных веществ, имеющих специфическую структуру, или же аналитов внутри пробы, можно получать индивидуально дискриминируемые результаты измерений. В результате этого становится возможным непосредственное одновременное количественное определение нескольких аналитов.
В качестве суспензионных сред в расчет принимаются все жидкости, в которых коллоидальные частицы имеют возможность свободного движения. Особенно пригодными являются вода, водные растворы поверхностно-активных вспомогательных веществ, как, например, тензиды или олигомерные или полимерные углеводы и белок, а также смеси из воды со спиртами, как, например, глицерол и полиэтиленгликоль. Суспензионные среды могут дополнительно содержать вспомогательные вещества, меняющие осмотическое давление, как, например, поваренную соль. Далее, могут содержаться буферные вещества, определяющие значение pH, как, например, фосфаты.
Соединения из ферромагнитных или ферримагнитных коллоидальных частиц с имеющими специфическую структуру веществами или подлежащими обнаружению аналитами могут присутствовать также и в высушенной форме, при необходимости в комбинации со вспомогательными веществами, которые облегчают, например, сушку или повышают стабильность высушенного продукта (например, в качестве лиофилизатов).
Определение аналита можно осуществлять с применением или без применения операций сепарации или промывки. При проведении измерений с помощью операций сепарации между связанными и несвязанными магнитными маркерами в соответствии с изобретением в качестве магнитных маркирующих веществ для магниторелаксометрического обнаружения могут использоваться все ферромагнитные и ферримагнитные коллоидальные вещества. В этих случаях нет необходимости в особых требованиях к времени релаксации по методу Брауна и времени релаксации по методу Нееля.
На основании высокой способности к индицированию связи, основанной на физических механизмах, могут быть исключены неспецифические сигналы измерения (феномены матрицы). Специфичность способа зависит, таким образом, еще и от "истинной" специфичности имеющего специфическую структуру вещества (перекрестная реактивность антител, неспецифичное связывание лиганд).
На основе высокой сенситивности способа согласно изобретению без труда снижаются обычные граничные значения детектирования метода связывания.
В качестве веществ для магнитного маркирования могут использоваться все ферромагнитные или ферримагнитные материалы, которые могут коллоидально диспергироваться в среде, пригодной для магниторелаксометрического обнаружения. При использовании веществ для магниторелаксометрического обнаружения, которое проводится без операций сепарации между связанными и несвязанными магнитными маркерами, время релаксации по методу Нееля для магнитных маркировок в условиях измерения должно быть больше, чем время релаксации магнитных маркеров по методу Брауна. Особенно пригодными являются все ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы с временем релаксации по методу Брауна в водных средах в диапазоне от 10-8 - 10-1 с и временем релаксации по методу Нееля, более чем 10-8 с. Для проведения измерений без операций сепарации вязкость использованной среды диспергирования должна быть приведена в соответствие с временем релаксации ферромагнитных и ферримагнитных частиц и временем замера, поскольку суспензионная среда существенно определяет постоянную времени релаксации по методу Брауна.
Предпочтительными являются, в частности, ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы из железа, окислов железа, ферритов бария, ферритов стронция, кобальта, никеля, ферритов никеля, ферритов кобальта и двуокиси хрома, у которых время релаксации по методу Нееля больше, чем время релаксации по методу Брауна.
Применение магнитных маркировок с плотно распределенными размерами частиц и/или магнитными моментами является в общем и целом предпочтительным. Разделение магнитных маркировок на фракции с плотным распределением размеров частиц может быть достигнуто, например, с помощью хроматографических методов или при использовании специальных методов фильтрации (например, стеклокапиллярные системы или тангенциальная фильтрация) путем использования молекулярных сит или с помощью центрифугирования.
Магнитные маркировки по возможности с унифицированными моментами можно получать, например, путем отсеивания в магнитном градиентном поле.
Ферромагнитные и ферримагнитные вещества могут быть стабилизированы оболочкой из олигомерных или полимерных углеводов, протеинов, пептидов, нуклеотидов, тензидов, прочих мономеров, олигомеров или полимеров и/или липидов.
Размеры частиц ферромагнитных и ферримагнитных веществ составляют, предпочтительным образом, от 1 до 400 нм. В частности, размеры частиц составляют предпочтительным образом от 1 до 100 нм.
Согласно способу магниторелаксометрическое обнаружение происходит с помощью измерительных устройств, которые сначала позволяют осуществлять намагничивание исследуемой пробы с помощью соответствующего магнитного поля, а затем измерение магнитной релаксации магнитных маркеров. Измерительное устройство для магниторелаксометрического обнаружения аналитов, которое применялось в примерах, представлено на фиг. 1. В противоположность всем другим уже известным способам (JP-235774 и WO 91/15243) в способе согласно изобретению для замера релаксации намагничивания замеряется не статическое намагничивание в присутствии намагничивающего поля, а его временное изменение в отсутствие намагничивающего поля. Только благодаря этому становится доступной информация о состоянии связывания маркеров. Далее, благодаря этому предотвращается влияние сигнала измерения со стороны диа- или парамагнитных компонентов или же загрязнений. Далее, решающим образом повышается чувствительность измерения.
Кроме того, имеется возможность осуществлять измерение намагничивания маркера в зависимости от частоты вследствие соответствующего магнитного переменного поля (определение комплексной сусцептибильности как функции частоты) с помощью высокочувствительных сенсоров, как, например, SQUIDs, в присутствии поля. При этом используется специфическая зависимость частоты сусцептибильности магнитного маркера в противоположность отдельно определяемой частотной зависимости пара- или диамагнитных компонентов. Также и этот способ действия находится в противоречии предложенному в WO 91/15243 способу определения сусцептибильности суперпарамагнитных веществ. В WO 91/15243 не описана ни частотная зависимость сусцептибильности магнитных маркеров, ни способ использования этого свойства.
Следующий аспект изобретения касается способов, которые позволяют обнаруживать место нахождения и количество специфически связанных маркеров без воздействия маркеров, циркулирующих в крови. При этих способах исключается применение радиоактивных веществ, без которых невозможно было обходиться при осуществлении сцинтиграфического способа уровня техники.
Способы согласно изобретению основаны на том, что различия в релаксации между связанными и несвязанными магнитными маркерами в жидкостях, а также изменение доминирующего механизма релаксации за счет привязки магнитных маркеров к твердым фазам могут быть использованы также и для магниторелаксометрического обнаружения веществ или структур на живом организме. Подобные способы называются ниже иммунной магнитографией или иммуномагнитографией.
Измерения в живом организме пространственного распределения пригодных для человека, релаксирующих во временном диапазоне маркеров может осуществляться двумя различными методами измерения:
1. Образованием по возможности гомогенного магнитного поля в интересующем объеме, отключением поля и измерением пространственного распределения релаксирующего магнитного поля с помощью многоканального сенсора. Он должен охватывать по возможности полностью объект измерения. Для создания достаточной информации об измерениях возможно также многократное проведение измерений при последовательном растрировании объекта измерения.
2. Последовательным формированием пространственно ограниченного локального поля, отключением поля и измерением пространственного распределения релаксирующего магнитного поля с помощью одноканального сенсора. Применение мультиканального сенсора является тоже возможным.
При использовании обоих методов для получения максимальной информации следует предпочтение отдавать как намагничиванию объекта измерения, так и измерению результирующего магнитного поля во всех трех пространственных направлениях.
Измерение описывается моделью так, как это происходит при анализе магнитных полей биоэлектрических потоков. В качестве основы там принимается модель магнитного диполя, мультиполюса или мультидиполя. Специальные параметры модели, в частности, местоположения диполей или мультиполей, определяют соответствующим методом аппроксимации, который сводит к минимуму отклонения между данными измерения и параметрами модели. Эти параметры позволяют судить о пространственном распределении намагниченных частиц.
Аналогичная технология известна и доказывает на деле пригодность ее для анализа магнитных полей биоэлектрических потоков.
В качестве способов и соединений, пригодных для иммунной магнитографии, могут применяться все приведенные для магниторелаксометрического обнаружения способы и вещества.
Особенно пригодными для осуществления иммунной магнитографии являются магнитные маркирующие вещества, которые могут биологически расщепляться и являются биологически совместимыми. Это касается, в частности, магнитных маркирующих веществ, которые состоят из окисей железа.
Для проведения специфического в части связывания, магниторелаксометрического обнаружения на живом объекте необходимо, чтобы время релаксации по методу Брауна введенных в человеческий организм комбинаций из ферримагнитных или ферромагнитных веществ с веществами, имеющими специфическую структуру, при температуре тела в жидкостях, содержащихся в организме, было короче, чем время релаксации по методу Нееля.
Под веществами со специфической структурой в иммунной магнитографии следует понимать, в частности, все вещества, которые специфически привязываются к идентифицируемым структурам человеческого организма. Особенно пригодными являются антитела, фрагменты антител, специфически привязывающие к рецепторам агонисты или их антагонисты, специфические пептиды и протеины, рецепторы, энзимы, субстраты энзимов, нуклеотиды, рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, углеводы или липопротеины. Из агонистов, привязывающих к рецепторам, подходят, в частности, цитокины, лимфокины или эндотелины.
Хорошо подходят все имеющие специфическую структуру вещества, имеющие постоянные связи в диапазоне от 105 до 1015 (моль/л)-1. В частности, подходящими являются все имеющие специфическую структуру вещества, которые имеют постоянную связи от 107 до 1015 (моль/л)-1.
Приводимые ниже примеры служат для более подробного пояснения предмета изобретения, но он ими не ограничивается.
ПРИМЕР 1.
100 мкг моноклонального антитела, направленного против Collagen III, называемого ниже анти-Collagen III, растворяют в 500 мкл 0,1 М раствора бикарбоната натрия. 1 мл суспензии магнетита с добавкой декстрана (Meito Sangyo) с 1 моль Fe/л и размером частиц приблизительно 40 нм пропускают через колонну "Sephadex" (Pharmacia PD 10) с 0,1 М бикарбоната натрия с приданием раствору буферных свойств. К суспензии добавляют 0,5 мл 10 ммоль раствора периодата натрия. Раствор оставляют настаиваться в темноте в течение 2 часов. Затем через PD 10 производят вымывание 0,1 М раствора бикарбоната натрия. К суспензии добавляют раствор анти-Collagen III. Смесь настаивают в течение 3 часов при 4oC в темноте. После этого добавляют 5 мг NaBH4 в виде твердого вещества и немного покачивают. Смесь настаивают 8 часов при 4oC в темноте. После этого маркированные магнетитом анти-Collagen III (ниже называемые маг-анти-Collagen III) элюируют через колонну PD 10 с раствором поваренной соли, имеющим буферные свойства фосфата (ниже это - PBS, pH 7,4). Раствор 5 мкг Collagen III в 200 мкл буфера (раствор поваренной соли с буферными свойствами фосфата (PBS)) инкубируют в сосуде из полистирола, предназначенном для проб. Затем сбрасывают жидкую фазу. Сосуд, предназначенный для проб, промывают три раза раствором поваренной соли с буферными свойствами фосфата, содержащим 0,1% (Tween® 20 (ниже называемый PBST). К пробе добавляют 5 мкл маг-анти-Collagen III в 200 мкл PBST. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем пробу намагничивают в магнитно экранированной камере в поле с напряженностью 2 мТ 4 см под детектором Squid (см. фиг. 1). Спустя 400 миллисекунд после отключения магнитного поля в течение 100 с производят измерение релаксации. На пробе релаксацию определяют по затухающему полю. Проба, содержащая сигнал релаксации присутствия Collagen III, представлена на фиг. 2.
ПРИМЕР 2.
Раствор 5 мкг Collagen V в 200 мкл PBS буферного раствора pH 7,4 инкубируют в сосуде из полистирола, предназначенном для проб. Затем сбрасывают жидкую фазу. Сосуд, предназначенный для проб, промывают три раза PBST промывочным буферным раствором, имеющим pH 7,4. К пробе добавляют 5 мкл маг-анти-Collagen III, приготовленного в соответствии с примером 1, в 200 мкл PBST. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем пробу намагничивают в магнитно экранированной камере в поле с напряженностью 2 мТ 4 см под детектором Squid (см. фиг. 1). После отключения магнитного поля пробу замеряют. Спустя 400 миллисекунд после отключения магнитного поля в течение 100 с производят измерение релаксации. На пробах, содержащих Collagen V, в рамках надежности измерения не может быть обнаружено затухающее магнитное поле (см. фиг. 3).
ПРИМЕР 3.
К раствору, содержащему 100 мкг Collagen III в 1 мл PBS, добавляют 100 мкл раствора глутардиальдегида (3% в воде). Раствор перемешивают 24 ч при 4oC и после этого центрифугируют. Осадок после центрифугирования содержит выпавший в осадок сетчатый Collagen III. Сетчатый Collagen III суспендируют в 1 мл PBS. (Проба 1). К раствору 100 мкг Collagen V в 1 мл PBS добавляют 100 мкл раствора глутардиальдегида (3% в воде). Раствор перемешивают в течение 24 ч при 4oC и центрифугируют. Осадок после центрифугирования содержит выпавший в осадок, сетчатый Collagen V. Сетчатый Collagen V суспендируют в 1 мл PBS. (Проба 2). К пробам 1 и 2 добавляют по 5 мкл суспензии маг-анти-Collagen III из примера 1. Инкубируют в течение 1 часа при 37oC. Затем обе пробы намагничивают в экранированной камере в магнитном поле с напряженностью 2 мТ под детектором SQUID. Замер релаксации производят в течение 400 миллисекунд после отключения намагничивающего поля. В случае пробы 1 замеряют затухающее поле. В случае пробы 2 затухающее поле не обнаруживается.
ПРИМЕР 4.
Из 10 мл раствора 1,9 мг/мл Collagen III в PBS (pH 7,4) получают соответственно 5 мл приводимых ниже разбавленных растворов:
10000 нг/мл, 1000 нг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл
Из каждого разбавленного раствора в трубочку из полистирола капают из пипетки три раза по 1 мл (емкость 2,5 мл). Ингибируют 1 ч при 37oC. После этого содержание трубочек сбрасывают. Трубочки промывают 3 раза каждый раз по 1 мл PBST. В каждую трубочку добавляют 1 мл разбавленного в соотношении 1:100 раствора маркированного магнетитом антитела, полученного по примеру 1. Трубочки оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого пробы намагничиваются с помощью измерительного устройства, схематическое изображение которого дается на фиг. 1 (2 мТ), и после отключения намагничивающего поля в течение 100 с производят замер релаксации. Определение разности замеренных значений плотности В магнитных потоков, 200 миллисекунд и 100 секунд после отключения намагничивающего поля в зависимости от концентрации Collagen в пробе представлено на фиг. 4.
ПРИМЕР 5.
100 мкг моноклонального антитела, направленного против Collagen III, называемого ниже анти-Collagen III, растворяют в 500 мкл 0,1 М раствора бикарбоната натрия. 1 мл суспензии магнетита с добавкой декстрана 1 моль Fe/л и размером частиц приблизительно 40 нм пропускают через колонну "Sephadex" (Pharmacia PD 10) с 0,1 М бикарбоната натрия с приданием раствору буферных свойств. К суспензии добавляют 0,5 мл 10 ммоль раствора периодата натрия. Раствор оставляют настаиваться в темноте в течение 2 ч, затем через PD 10 производят вымывание 0,1 М раствора бикарбоната натрия. К суспензии добавляют раствор анти-Collagen III. Смесь настаивают в течение 3 ч при 4oC в темноте. После этого добавляют 5 мг NaBH4 в виде твердого вещества и немного покачивают. Смесь настаивают 8 ч при 4oC в темноте. После этого маркированные магнетитом анти-Collagen III (ниже называемые маг-анти-Coliagen III) элюируют через колонну PD 10 с раствором поваренной соли, имеющим буферные свойства фосфата (PBS, pH 7,4). Каждые 20 мкл суспензии маг-анти-Collagen III разбавляют 390 мкл раствора поваренной соли с буферными свойствами фосфата с pH 7,4, который содержит дополнительно 0,1% PBST, и разливают в три сосуда для проб из полиакриловой кислоты, которые имеют емкость соответственно 500 мкл каждый. К первому сосуду для проб добавляют 100 мкл водного раствора сывороточного альбумина (1 мг альбумина/мл) (проба 1). Ко второму сосуду для проб добавляют 100 мкл раствора Collagen V в PBST (1 мкг Collagen V/мл) (проба 2). К третьему сосуду для проб добавляют 100 мкл раствора Collagen III в PBST (1 мкг Collagen III/мл) (проба 3). В течение 200 с после добавления протеиновых растворов пробы намагничиваются с помощью измерительного устройства, схематичное изображение которого дается на фиг. 1, (2 мТ), и в течение 20 миллисекунд после отключения намагничивающего поля, начиная через 1 секунду, определяется соответственно магнитная релаксация, в пробах 1 и 2 в рамках надежности измерений не может обнаруживаться затухающее магнитное поле. В пробе 3, наоборот, может обнаруживаться затухающее магнитное поле. Замеры повторяются после опустошения сосудов для проб и после трехкратного промывания - каждый раз 500 мкл PBST. Сейчас ни в одном из сосудов для проб в рамках надежности измерения не может обнаруживаться затухающее магнитное поле.
ПРИМЕР 6.
100 мкг авидина растворяют в 500 мкл 0,1 М раствора бикарбоната натрия. 1 мл суспензии магнетита с добавкой декстрана с 1 моль Fe/л и размером частиц приблизительно 40 нм пропускают через колонну "Sephadex" (Pharmacia PD 10) с 0,1 М бикарбоната натрия с приданием раствору буферных свойств. К суспензии добавляют 0,5 мл 10 ммоль раствора периодата натрия. Раствор оставляют настаиваться в темноте в течение 2 часов. Затем через PD 10 производят вымывание 0,1 М раствора бикарбоната натрия. К суспензии добавляют раствор авидина. Смесь настаивают в течение 3 часов при 4oC в темноте. После этого добавляют 5 мг NaBH4 в виде твердого вещества и немного покачивают. Смесь настаивают 8 часов при 4oC в темноте. После этого маркированный магнетитом авидин (ниже называемый маг-авидин) элюируют через колонну PD 10 с раствором поваренной соли, имеющим буферные свойства фосфата (PBS, pH 7,4).
1 мг альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота сопрягается с биотин-N-гидроксисукцинимидом (Sigma) (ниже обозначается как биотин-альбумин) и разбавляется до концентрации 1 мкг/мл в PBS.
1 мл разбавленного раствора биотин-альбумина инкубируют в течение 3 часов при комнатной температуре в сосуде для проб из полистирола. После этого отгоняется жидкая фаза. Сосуд для проб три раза промывается раствором поваренной соли, обладающим буферными свойствами фосфата, который содержит 0,1% TweenTween® 20 (PBST). К пробе добавляются 5 мкл маг-авидина. В течение 1 ч проводят инкубирование при комнатной температуре. Затем проба намагничивается в магнитно экранированной камере в поле напряженностью 2 мТ 4 см под детектором SQUID (см. фиг. 1). Спустя 400 миллисекунд после отключения магнитного поля в течение 100 с производится измерение релаксации. На пробе замеряется затухающее магнитное поле.
1 мл разбавленного раствора альбумина крупного рогатого скота в PBS (0,1 мг/мл) инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре в сосуде для проб из полистирола. После этого отгоняется жидкая фаза. Сосуд для проб три раза промывается раствором поваренной соли, обладающим буферными свойствами фосфата, который содержит 0,1% Tween® 20 (PBST). К пробе добавляют 5 мкл маг-авидина. В течение 1 часа проводят инкубирование при комнатной температуре. Затем проба намагничивается в магнитно экранированной камере в поле напряженностью 2 мТ 4 см под детектором SQUID (см. фиг. 1). Спустя 400 миллисекунд после отключения магнитного поля в течение 100 секунд производится измерение релаксации. На пробе в рамках надежности измерения не замеряется затухающее магнитное поле.
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может применяться для магниторелаксометрического количественного обнаружения аналитов в жидких и твердых фазах. Проводят качественное и/или количественное обнаружение аналитов в жидких и/или твердых фазах, при этом ферромагнитные или ферримагнитные коллоидальные частицы используют в качестве определяемой магнитной маркировки в иммунных методах или прочих методах связывания, а релаксацию их намагничивания определяют в качестве измеряемой величины. Релаксация по методу Брауна в условиях измерения протекает быстрее, чем релаксация по методу Нееля. Иммуномагнитографию проводят путем маркировки веществ ферримагнитными или ферромагнитными коллоидальными частицами, а затем эти маркированные, имеющие специфическую структуру вещества вводят в живой организм, с помощью прикладываемого снаружи магнитного поля намагничивают интересующий объем организма, а после отключения внешнего поля замеряют релаксацию намагничивания магнитных маркеров с помощью сенсоров магнитного поля. Способы обеспечивают повышение чувствительности обнаружения аналитов. 8 с. и 21 з.п. ф-лы, 4 ил.
| T | |||
| Chard An Introduction to Radio-immunoassay and Related Techniques: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 4 | |||
| ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1990 | |||
| Способ размножения копий рисунков, текста и т.п. | 1921 |
|
SU89A1 |
| Способ размножения копий рисунков, текста и т.п. | 1921 |
|
SU89A1 |
| WO 9117428 А, 14.11.1991 | |||
| WO 9115243 А, 17.10.1991. | |||
