ДЕТЕКТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛ-МИШЕНЕЙ В ПРОБЕ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/543 

Настоящее изобретение относится к способу детектирования мишени в пробе. В частности изобретение относится к способам конкурентного анализа, предназначенным для детектирования молекул-мишеней, в особенности мишеней, несущих единственный эпитоп, где мишени конкурируют в растворе с молекулами, прикрепленными к магнитным частицам или к иммобилизованным поверхностям.

Исследовательские работы в области здравоохранения включают развитие способов диагностики, предназначенных для определения присутствия или отсутствия конкретных соединений, таких как ДНК, РНК, гормоны, метаболиты, лекарственные вещества и т.д.

В WO 03/031977 A2, WO 01/14591 А1 и WO 96/07101 описаны анализы и способы применения намагничиваемых частиц, где анализы выполняются в присутствии магнитного поля с целью улучшения кинетики анализов. В US 5981297 описан способ и устройство для детектирования молекул-мишеней в жидкой фазе. Устройство контролирует, связана ли молекула-мишень селективно с агентами узнавания на поверхности сенсора магнитного поля, регистрируя выходные данные сенсора. Агенты узнавания, которые селективно связывают молекулу-мишень или агенты узнавания, которые селективно связывают связанные с сенсором агенты узнавания, ковалентно связаны с намагничиваемыми частицами. Изменение в выходных данных сенсоров магнитного поля указывает на присутствие магнитных частиц, связанных с сенсорами и, таким образом, показывает присутствие и концентрацию молекул-мишеней в пробе. В WO 97/07243 описан способ для определения присутствия и/или концентрации вещества-мишени в жидкости. В описанном способе скомбинированы элементы иммуноанализов, анализов покрытой чашки и магнитного разделения частиц с целью осуществления количественного определения и выделения аналита в растворе. Способ также обеспечивает отсутствие переориентации материала, полученного магнитным способом, путем связывания магнитных частиц с улавливающей поверхностью посредством пары специфического связывания.

Иммунологические исследования обычно используются для определения количества специфических белков в жидкостях организма в целях способствования последующей диагностике и лечению. Наиболее известным принципом детектирования является сэндвичевый анализ. Целевые молекулы в образце жидкости улавливаются (как между слоями "сэндвича") между биологически активной поверхностью сенсора и биологически активными метками (например, магнитными частицами). Таким образом, для сэндвичевого анализа требуются мишени, по меньшей мере, с двумя эпитопами. Однако более мелкие молекулы, такие как молекулы лекарственных веществ, вызывающих наркотическую зависимость, обычно обладают только одним эпитопом и по этой причине не могут детектироваться в стандартном сэндвичевом анализе.

Конкурентный или ингибиторный анализ является способом детектирования указанных молекул. Известный способ конкурентного анализа заключается в соединении целевых молекул-мишеней с поверхностью, а связывающих антител с детекторной меткой (фермент/флуорофор/магнитная гранула). Данная система используется для проведения конкурентного анализа между целевыми молекулами в пробе и целевыми молекулами на поверхности с использованием меченых антител (см. например GB 2404022 A и GB 2404023 A).

Поскольку существует различие в подвижности свободных целевых молекул, присутствующих в растворе, по сравнению с целевыми молекулами, связанными с поверхностью или меткой, конкуренция не справедлива, а кривая зависимости от дозы не будет линейной. Это может помешать использованию анализа для количественных измерений. Кроме того, ограниченная подвижность мишеней, связанных с поверхностью, или метки приводит к относительно медленному протеканию реакции.

Целью настоящего изобретения является преодоление, по меньшей мере, одного из указанных недостатков.

Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение способа конкурентного анализа для детектирования целевых молекул в пробе, который можно выполнить по однокамерной схеме.

Было установлено, что, по меньшей мере, одной из указанных целей соответствуют способы, описанные в п.1 и последующих зависимых пунктах. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу детектирования мишени в пробе, подозреваемой на наличие мишени, включающему:

a) контактирование пробы и первой связывающей молекулой, соединенной с магнитной частицей, в одно и то же время или в разное время, со второй связывающей молекулой, соединенной с твердой подложкой, где первая связывающая молекула способна связываться со второй связывающей молекулой, и где мишень способна препятствовать указанному связыванию; и приложение магнитной силы, вынуждающей магнитную частицу переместиться в положение в непосредственной близости к твердой подложке; и

b) детектирование количества магнитных частиц, связанных с твердой подложкой посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой.

Количество частиц, детектированных на стадии b) заявленного способа, соответствует концентрации мишени в пробе. Количество, которое является пониженным, например пониженным по сравнению с контрольным значением, указывает, что проанализированный образец содержит мишень. Контрольное значение может быть известным значением. В альтернативном варианте оно может быть получено в контрольном анализе, который проводят одновременно или отдельно, используя пробу, которая не содержит какой-либо мишени.

В другом аспекте изобретение относится к применению магнита в целях приложения магнитной силы к магнитной частице, к которой присоединена первая связывающая молекула, вынуждающей переместиться указанную частицу в положение в непосредственной близости к твердой подложке, к которой присоединена вторая связывающая молекула, где первая связывающая молекула способна связываться со второй связывающей молекулой, и где присутствует молекула-мишень, способная препятствовать указанному связыванию.

Указанные и другие аспекты изобретения будут очевидны из и объяснены касательно варианта (вариантов) осуществления, описанного далее.

На фиг.1 приведено схематическое изображение способа конкурентного анализа с одной камерой согласно настоящему изобретению, где молекулы-мишени (a) конкурируют с молекулами-мишенями или гомологами молекул-мишеней (d), присоединенными к магнитной частице с целью связывания с антителами, прикрепленными к поверхности твердой подложки.

На фиг.2 приведена кривая зависимости от дозы анализа конкурентного связывания с морфином, с использованием и без воздействия магнитного поля для концентрирования магнитных гранул, покрытых анти-OPI антителами, на поверхности, покрытой БСА-OPI.

На фиг.3 приведена эффективность покрытия антителами к морфину поверхности золота, детектированная морфин-HRP и люминол-люминисцентным анализом.

На фиг.4 показана функциональность микрочастиц (MPs), с которыми был связан морфин, детектированная связыванием MP-морфина с антителами к морфину, прикрепленными к поверхности.

На фиг.5 показаны результаты конкурентного анализа, в котором связывание MP-морфина с антителами к морфину, прикрепленными к поверхности, детектировали в присутствии различных количеств морфина в растворе.

"Мишень" может являться любой молекулой, чья концентрация или присутствие как таковое должны быть определены. Примерами подходящих мишеней в контексте настоящего изобретения являются молекулярные мишени, такие как маленькие молекулы, лекарственные вещества, белки, ферменты, гормоны, пептиды и нуклеиновые кислоты. Молекулярные мишени часто определяют концентрацию и/или присутствие более крупных частиц, например клеток, вирусов или фракций клеток или вирусов, экстракта ткани и т.д.

Особо предпочтительными мишенями являются мишени с единственным эпитопом, включая одноэпитопные маленькие молекулы, лекарственные вещества, гормоны и пептиды. Особо предпочтительными в качестве мишеней являются лекарственные вещества, вызывающие наркотическую зависимость. Примером лекарственного вещества, вызывающего наркотическую зависимость, предпочтительного в качестве мишени, является морфин. Другими лекарственными веществами, вызывающими наркотическую зависимость, предпочтительными в качестве мишеней, являются кокаин, ТГК, анаболические стероиды или лекарственные вещества группы амфетамина/метамфетамина. Мишень может также присутствовать в анализируемой пробе или может образовываться in situ, например, на стадии контакта, например в результате реакции, которая протекает на указанной стадии. Если для контроля за ходом реакции используется сенсор, мишень может например являться исходным продуктом реакции или продуктом реакции.

Следует учитывать, что мишень, детектируемая согласно способу настоящего изобретения, будет представлять собой мишень, которая конкурентным способом препятствует связыванию между первой связывающей молекулой и второй связывающей молекулой. Кроме того, следует учитывать, что первая и вторая связывающие молекулы будут выбраны так, чтобы детектируемая мишень препятствовала их связыванию друг с другом конкурентным способом. Продукты реакции могут быть непосредственно детектированы чувствительным способом. Помимо прочего, продукты реакции могут быть дополнительно обработаны перед детектированием. Примером дополнительной обработки является добавление некоторых материалов или изменение (био)химических или физических свойств мишени с целью облегчения детектирования.

Как указано выше, способ согласно настоящему изобретению включает стадию контактирования пробы и первой связывающей молекулы, которая присоединена к магнитной частице, со второй связывающей молекулой, связанной с твердой подложкой. Контакт будет происходить в растворе.

Используемое в настоящем описании понятие "в растворе" означает, что стадия, реакция (связывания) или анализ, упомянутые в данном контексте, проводятся в жидкой среде. Предпочтительно жидкая среда представляет собой водную жидкую среду. Используемые реагенты не должны быть обязательно растворены в жидкой среде, и могут также присутствовать в суспендированном или диспергированном состоянии. Контакт пробы и первой связывающей молекулы, присоединенной к магнитной частице, со второй связывающей молекулой, связанной с твердой подложкой, может произойти в одно и то же время или в разное время. Например, сначала проба может контактировать со второй связывающей молекулой на твердой поддержке, а вскоре после этого может быть добавлена первая связывающая молекула, прикрепленная к магнитной частице. В альтернативном варианте сначала первая связывающая молекула, прикрепленная к магнитной частице, может контактировать со второй связывающей молекулой на твердой подложке, а вскоре после этого может быть добавлена проба.

В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения проба и первая связывающая молекула, прикрепленная к магнитной частице, будут контактировать со второй связывающей молекулой, связанной с твердой подложкой, в одно и то же время. Это может быть выполнено, например, посредством того, что проба и первая связывающая молекула, присоединенная к магнитной частице, смешиваются, а затем контактируют со второй связывающей молекулой, связанной с твердой подложкой. В альтернативном варианте проба и первая связывающая молекула, присоединенная к магнитной частице, могут добавляться отдельно, но одновременно, ко второй связывающей молекуле, связанной с твердой подложкой.

Кроме того, способ настоящего изобретения включает приложение магнитной силы на стадии a) для того, чтобы переместить указанную частицу в положение в непосредственной близости к твердой подложке. Другими словами, под действием магнитной силы частицы оседают на твердую подложку. Данная стадия воздействия магнитного поля обычно приводит к сокращению времени реакции в отношении связывания компонентов, участвующих в анализе конкурентного связывания. Кроме того, было неожиданно установлено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения на чувствительность анализа можно влиять следующим образом. Магнитная сила на стадии воздействия предпочтительно приложена таким способом, чтобы уменьшить или устранить влияние различия в подвижности между мишенью и первой связывающей молекулой, присоединенной к магнитной метке при связывании. Таким образом, магнитная сила приложена с целью концентрирования магнитных частиц на твердой подложке, например поверхности сенсора, для компенсации сниженной подвижности первой связывающей молекулы, присоединенной к магнитной частице.

Магнитная сила может быть приложена с помощью электромагнита. Впрочем, подходящими также являются катушка без сердечника или постоянный магнит.

В одном из вариантов осуществления способа настоящего изобретения первая связывающая молекула способна селективно связывать как мишень в пробе, так и вторую связывающую молекулу. Кроме этого, стадия контакта включает обеспечение конкуренции второй связывающей молекулы с мишенью за указанное селективное связывание с первой связывающей молекулой.

Примерами подходящих первых связывающих молекул являются Affibodies™, антитела, молекулы рецепторов, аптамеры и хелатирующие агенты.

В случаях, когда мишенью является нуклеиновая кислота, первая связывающая молекула будет включать нуклеиновые кислоты, нуклеотидная последовательность которых комплементарна части последовательности мишени.

Особо предпочтительными в качестве первых связывающих молекул являются антитела, специфично связывающие мишень.

В случае если первая связывающая молекула способна селективно связывать как мишень в пробе, так и вторую связывающую молекулу, вторая связывающая молекула идентична мишени, или является гомологом мишени. Используемое в настоящем описании понятие "гомолог мишени" означает конструкцию, которая содержит, по меньшей мере, часть мишени, предпочтительно часть, которая отличает мишень от других подобных молекул, либо конструкцию, которую первая связывающая молекула связывает с такой же силой, как и мишень. Связывание подобной силы определяется как имеющее значение К_а предпочтительно порядка 10³, более предпочтительно порядка 10², наиболее предпочтительно порядка 10 или меньше. Не желая быть связанными с какой-либо теорией, предполагается, что очень часто мишень и гомолог мишени одновременно используют одни и те же эпитопы для связывания со связывающим сайтом.

В соответствии со способом изобретения первая связывающая молекула присоединена к магнитной частице. Подходящие для использования в способе изобретения магнитные частицы являются магнитными частицами, на которые может воздействовать магнитная сила. Магнитные частицы могут быть любой формы или типа. Они могут являться магнитными, диамагнитными, парамагнитными, суперпарамагнитными, ферримагнитными или ферромагнитными, то есть, обладать любым типом магнетизма, который генерирует магнитный диполь в электрическом поле, постоянно или временно.

В другом варианте осуществления способа изобретения вторая связывающая молекула способна селективно связывать как мишень в пробе, так и первую связывающую молекулу. Кроме этого, стадия контакта включает обеспечение конкуренции первой связывающей молекулы с мишенью за указанное селективное связывание со второй связывающей молекулой.

Указанный вариант осуществления изображен в качестве примера на фигуре 1. На данной фигуре изображена схема конкурентного анализа, которая может использоваться для количественного детектирования молекул с единственным эпитопом (хотя также могут детектироваться молекулы с двумя или более эпитопами). Схема не требует предварительного смешивания отдельных реагентов, то есть она может быть выполнена в режиме однокамерного конкурентного анализа. Данная схема обеспечивает конкуренцию мишени (a) с первыми связывающими молекулами (d), присоединенными к магнитным частицам, в растворе. В частности, молекулы-мишени (a) конкурируют за связывание со вторыми связывающими молекулами (b) на твердой подложке (c), например поверхности сенсора, с молекулами-мишенями или их гомологами (d), которые прямо или косвенно присоединены к магнитным частицам. Различие подвижности между свободными молекулами-мишенями (a) и молекулами-мишенями или их гомологами (d), связанными с магнитными частицами, может быть преодолено приложением магнитной силы (магнитного воздействия). Таким образом, кривая зависимости от дозы неожиданно может быть скорректирована до линейной кривой. Указанная схема анализа является наиболее подходящей для количественных измерений молекул-мишеней в пробе.

Примерами подходящих вторых связывающих молекул опять же являются Affibodies™, антитела, молекулы рецепторов, аптамеры и хелатирующие агенты.

В случае, когда мишенью является нуклеиновая кислота, вторая связывающая молекула будет включать нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, комплементарную части последовательности мишени.

Особо предпочтительными в качестве вторых связывающих молекул являются антитела, специфично связывающие мишень.

В случае если вторая связывающая молекула способна селективно связывать как мишень в пробе, так и первую связывающую молекулу, первая связывающая молекула идентична мишени, или является гомологом мишени, причем понятие "гомолог мишени" обладает значением, определенным выше.

Магнитные частицы, подходящие для использования в способах настоящего изобретения, могут иметь размер приблизительно от 10 нм до нескольких микрометров, более предпочтительно приблизительно от 50 нм до приблизительно 1 мкм. Также предпочтительными являются частицы с размерами приблизительно от 100 нм до приблизительно 500 нм, например частицы размером приблизительно 300 нм или частицы размером приблизительно 200 нм. В предпочтительном варианте осуществления магнитные частицы больше, чем отдельные молекулы-мишени в пробе, анализируемой с помощью анализа в соответствии с изобретением.

Присоединение первой связывающей молекулы к магнитной частице может быть выполнено посредством покрытия частиц первой связывающей молекулой. Это также может быть выполнено посредством ковалентного связывания, непосредственно или с помощью спейсерной молекулы. Подходящие спейсерные молекулы будут известны специалистам в данной области техники, и включают, например, алкилендиамин или этилендиамин.

В предпочтительном варианте осуществления присоединение осуществляется посредством пары сильного связывания. В данном варианте осуществления один связывающий участник пары сильного связывания будет присоединен к магнитной частице, а другой связывающий участник пары сильного связывания будет присоединен к первой связывающей молекуле, или является первой связывающей молекулой непосредственно.

Примерами предпочтительных пар сильного связывания являются авидин/биотин, гаптен/антитело, белок или пептид/антитело, белок/углевод, белок/белок, нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота, белок/нуклеиновые кислоты и гаптен/нуклеиновые кислоты.

Взаимодействие между белком авидином и молекулой биотином широко применяется для связывания биологических молекул с другими молекулами. Константа аффинности (Ka) авидина к биотину является одной из самых высоких известных Ka и имеет значение порядка 10¹⁵ л/моль, и, таким образом, связывание считается необратимым при нормальных условиях анализа. В дополнение к высокой аффинности на каждой молекуле авидина существует четыре сайта связывания, доступных для биотина. Биотинилирование или химическое мечение белков биотином является мягким и не снижает биологическую активность. Авидин может быть также химически сшит с другими белками с помощью стандартных сшивающих агентов, включающих карбодиимид. Существует множество коммерчески доступных марок авидина, включающих стрептавидин и нейтравидин, которые отличаются по степени гликозилирования, изоэлектрической точке и свойствам неспецифического связывания. Другой альтернативой является пара Strep-tag^®II/Strep-tactin^®.

Антитела высокой аффинности могут быть индуцированы к гаптенам или маленьким молекулам, включая красители, лекарственные вещества, гормоны и витамины. В целом могут быть получены антитела к почти любому гаптену, при этом для таких молекул, как дигоксигенин, 2,4-динитрофенил (ДНФ) и флюоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ) существует множество антител высокой аффинности с К_а более 10¹¹ л/моль. Существует несколько известных простых методик гаптенилирования для химического мечения молекул гаптенами. Присоединение антител может быть достигнуто также химическими способами, подобными описанным для авидина, или с помощью рекомбинантных способов получения слитых белков.

Специфичность и высокая аффинность связывания белков или пептидов антителами к ним является основой многих способов иммуноанализа. Константа аффинности таких взаимодействий может достигать 10¹³ л/моль и может варьироваться в пределах многих порядков величин в зависимости от конкретного используемого пептида или белка.

Белок-белковое связывание происходит между определенными типами белков. Например, A-белок и G-белок известны своей высокой аффинностью к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. Аналогичным образом конканавалин А представляет собой лектин, который связывается с углеводной фракцией гликопротеинов, хотя и не так сильно, как A- и G-белок связываются с иммуноглобулинами. Указанные взаимодействия являются менее специфичными и могут использоваться только в тех анализах, в которых проба не содержит Fc-фрагмент или в которых проба не является гликопротеином. Чтобы достичь требуемой специфичности и уменьшить перекрестный ответ, антитела и белки, используемые в анализе, в котором не нужны указанные связывающие взаимодействия, могут быть модифицированы. Например, можно синтезировать рекомбинантные антитела, в которых удалены Fc-фрагменты или гликозилированные области.

В другом предпочтительном варианте осуществления присоединение первой связывающей молекулы к микрочастице выполняется путем покрытия частицы белком (например, бычьим сывороточным альбумином, БСА), с которым связана связывающая молекула. Например, если первая связывающая молекула является морфином или гомологом морфина, или другим лекарственным веществом, вызывающим наркотическую зависимость, БСА используется в качестве белка, с которым могут быть связаны указанные лекарственные вещества. Затем коньюгатом БСА-морфин, БСА-гомолог морфина или БСА-лекарственное вещество, вызывающее наркотическую зависимость, покрывают частицу.

Способ настоящего изобретения обычно включает стадию отмывки, которую выполняют перед стадией детектирования. В ходе стадии отмывки удаляются первые связывающие молекулы, которые не были связаны со второй связывающей молекулой в ходе стадии a). Предпочтительным способом удаления несвязанных первых связывающих молекул является приложение магнитной силы, например, генерируемой электромагнитом, катушкой без сердечника или постоянным магнитом. Впрочем, промывка промывочным раствором также возможна.

Как было упомянуто ранее, вторая связывающая молекула присоединена к твердой подложке. В предпочтительном варианте осуществления твердая подложка представляет собой поверхность сенсорного устройства. Сенсорное устройство может содержать любой детектор, подходящий для детектирования метки. Подходящими детекторами являются магнитные детекторы, оптические детекторы, звуковые детекторы, детекторы радиоактивности или электрические детекторы. Детектор может представлять собой любой сенсор, подходящий для детектирования наличия магнитных частиц на поверхности или вблизи поверхности сенсора, на основании любого свойства частиц, например, сенсор может детектировать с помощью магнитных методов (например, магниторезистивного, Холла, индуктивного), оптических методов (например, экспонирования, флюоресценции, хемилюминесценции, поглощения, рассеивания, методы рассеянного поля, поверхностного плазмонного резонанса, Рамана и т.д.), звукового детектирования (например, с использованием поверхностной акустической волны, объемной акустической волны, консоли, кристалла кварца и т.д.), электрического детектирования (например, электропроводности, полного сопротивления, амперометрического способа, окислительно-восстановительного цикла) и т.д.

Особо предпочтительным в контексте настоящего изобретения является магнитный детектор.

Детектор может быть любым подходящим сенсором, основанным на детектировании магнитных свойств частицы на поверхности или вблизи поверхности сенсора, например катушкой, проводом, магнеторезистивным сенсором, магнеторестриктивным сенсором, сенсором Холла, плоским сенсором Холла, индукционным сенсором, сверхпроводящим квантовым интерференционным сенсором, магниторезонансным сенсором и т.д. Впрочем, другие сенсоры, например оптический сенсор, также являются предпочтительными.

В особо предпочтительном варианте осуществления поверхность представляет собой поверхность золота, стекла или прозрачного пластика, в частности поверхность золота, стекла или прозрачного пластика, покрытую белком, с которым связана вторая связывающая молекула.

Обычно присоединение второй связывающей молекулы к твердой подложке, например, поверхности сенсора, может быть достигнуто путями, описанными выше, подходящими для присоединения первой связывающей молекулы к магнитной частице. Например, это может быть выполнено путем покрытия твердой подложки второй связывающей молекулой. Также это может быть выполнено посредством ковалентного связывания, непосредственно или с помощью спейсерной молекулы. Опять же, подходящие спейсерные молекулы будут известны специалистам в данной области техники, и включают, например, алкилендиамин или этилендиамин.

В предпочтительном варианте осуществления присоединение выполнено посредством пары сильного связывания. В данном варианте осуществления один связывающий участник пары сильного связывания будет присоединен к твердой подложке, а другой связывающий участник пары сильного связывания будет присоединен ко второй связывающей молекуле, или является второй связывающей молекулой непосредственно.

Как и в случае присоединения первой связывающей молекулы к магнитной частице, примерами предпочтительных пар сильного связывания для присоединения второй связывающей молекулы к твердой подложке являются авидин/биотин, гаптен/антитело, белок или пептид/антитело, белок/углевод, белок/белок, нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота, белок/нуклеиновые кислоты и гаптен/нуклеиновые кислоты.

Как было также упомянуто выше, подходящие в данном отношении марки авидина включают стрептавидин и нейтравидин. Другой альтернативой является пара Strep-tag^®II/Strep-tactin^®.

Подходящими антителами высокой аффинности являются антитела, индуцированные к гаптенам или маленьким молекулам, включая красители, лекарственные вещества, гормоны и витамины. Как было упомянуто выше, такие антитела включают антитела против дигоксигенина, 2,4-динитрофенила (ДНФ) и флюоресцеин-5-изотиоцианата (ФИТЦ).

Белок-белковое связывание также является подходящим, например, связывание A-белка или G-белка с иммуноглобулинами через их Fc-фрагмент. Лектины, такие как конканавалин А, которые связываются с углеводной фракцией гликопротеинов, также являются подходящими.

В другом предпочтительном варианте осуществления присоединение второй связывающей молекулы к твердой подложке выполняется посредством покрытия твердой подложки белком (например, бычьим сывороточным альбумином, БСА), с которым связана связывающая молекула. Например, если вторая связывающая молекула является морфином или гомологом морфина, или другим лекарственным веществом, вызывающим наркотическую зависимость, БСА используется в качестве белка, с которым могут быть связаны указанные лекарственные вещества. Затем коньюгатом БСА-морфин, БСА-гомолог морфина или БСА-лекарственное вещество, вызывающее наркотическую зависимость, покрывают твердую подложку.

Детектирование реакции связывания согласно стадии b) способа настоящего изобретения может обеспечиваться различными способами. Например, детектирование количества магнитных частиц, связанных с твердой подложкой посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой, может быть выполнено с помощью магнитного сенсорного устройства.

Кроме того, сенсор может быть любым сенсором, подходящим для детектирования присутствия магнитных частиц на поверхности или вблизи поверхности сенсора, на основании любого свойства частиц, например, сенсор может детектировать с помощью магнитных методов (например, магниторезистивного, Холла, индуктивного), оптических методов (например, экспонирования, флюоресценции, хемилюминесценции, поглощения, рассеивания, методы рассеянного поля, поверхностного плазмонного резонанса, Рамана и т.д.), звукового детектирования (например, с использованием поверхностной акустической волны, объемной акустической волны, консоли, кристалла кварца и т.д.), электрического детектирования (например, электропроводности, полного сопротивления, амперометрического способа, окислительно-восстановительного цикла) и т.д. Сенсор может быть любым подходящим сенсором, основанным на детектировании магнитных свойств частицы на поверхности или вблизи поверхности сенсора, например катушкой, проводом, магнеторезистивным сенсором, магнеторестриктивным сенсором, сенсором Холла, плоским сенсором Холла, индукционным сенсором, сверхпроводящим квантовым интерференционным сенсором, магниторезонансным сенсором и т.д.

Детектирование может произойти со сканированием или без сканирования сенсора относительно поверхности биосенсора.

Сенсор и способы детектирования, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться в качестве быстрых, надежных и удобных в обращении биосенсоров, используемых на месте для проб малых объемов. Реакционная камера может являться одноразовым изделием, которое используется вместе с компактным считывающим датчиком, содержащим одно или более устройств, генерирующих магнитное поле, и одно или более детектирующих устройств. Кроме того, сенсор и способы детектирования настоящего изобретения могут применяться в автоматизированном высокопроизводительном анализе. В данном случае реакционная камера представляет собой, например, луночный планшет или кювету, вставляемые в автоматизированный прибор. Данные измерения могут быть получены как измерение конечных результатов, а также посредством динамической или периодической регистрации сигналов.

Мишени могут быть непосредственно детектированы способом детектирования. Также частицы могут быть дополнительно обработаны перед детектированием. Пример дополнительной обработки заключается в добавлении материалов или изменении (био)химических или физических свойств мишеней с целью облегчения детектирования.

Кроме того, анализ, устройство, сенсор или способы детектирования настоящего изобретения подходят для мультиплексирования сенсора (т.е. параллельного использования различных сенсоров и сенсорных поверхностей), мультиплексирования метки (т.е. параллельного использования различных типов меток или мишеней) и мультиплексирования камеры (т.е. параллельного использования различных реакционных камер). В альтернативном варианте детектирование магнитных частиц, связанных с твердой подложкой посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой, может быть выполнено путем связывания третьей связывающей молекулы с первыми связывающими молекулами, присоединенными к указанным частицам, и последующего детектирования указанного связывания. Третья связывающая молекула является молекулой, способной селективно связываться с первой связывающей молекулой. В одном варианте осуществления первые связывающие молекулы на магнитных частицах детектируются на данной стадии, которая не включена в связывание ни с одной из вторых связывающих молекул на твердой подложке.

Детектирование связывания третьей связывающей молекулы с первой связывающей молекулой в вышеуказанном варианте осуществления выполняется посредством детектируемой метки. Данная метка может быть непосредственно связана с третьей связывающей молекулой. В альтернативном варианте детектируемая метка может быть присоединена к третьей связывающей молекуле, обеспечивая связывание агента, связанного с детектируемой меткой и способного селективно связываться с третьей связывающей молекулой, с третьей связывающей молекулой.

Метки могут быть детектированы непосредственно чувствительным способом. Помимо этого частицы могут быть дополнительно обработаны перед детектированием. Примером дополнительной обработки является добавление материалов или изменение (био)химических или физических свойств метки с целью облегчения детектирования. Кроме того, анализ, устройство, сенсор или способ детектирования настоящего изобретения являются подходящими для мультиплексирования метки (т.е. параллельного использования меток различных типов).

Подходящими метками в связи с этим являются метки, выбранные из группы, состоящей из флуоресцентной метки, колориметрической метки, хемилюминесцентной метки, ферментной метки (например, пероксидазы хрена (HRP) или щелочной фосфатазы (AP)), радиоактивной метки, электростатически заряженной метки, а также донорно-акцепторной метки. Предпочтительной меткой является HRP. Другой предпочтительной меткой является AP.

Способ настоящего изобретения применим к различным видам проб. Например, он может быть применен к пробам мочи, пробам крови, пробам пота, пробам глазной жидкости, пробам внутриротовой жидкости (слюны) или пробам волос. Также могут использоваться пробы, полученные из вышеперечисленных проб путем обработки жидкостей организма, ткани или клеток с целью довести их до состояния, подходящего для того, чтобы подвергнуть анализу согласно изобретению. Такая обработка может включать смешивание проб с подходящими буферными или солевыми растворами, хаотропными агентами, детергентами или растворителями, перемешивание, экстрагирование с использованием химических или механических средств и т.п.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению первой связывающей молекулы, при этом первая связывающая молекула присоединена к магнитной частице, второй связывающей молекуле, или вторая связывающая молекула присоединена к твердой подложке любым из способов, описанных и/или заявленных в настоящем документе, где первая связывающая молекула, магнитная частица, вторая связывающая молекула и твердая подложка может быть любой из первых связывающих молекул, магнитных частиц, вторых связывающих молекул и твердых подложек, определенных в настоящем описании и формуле.

Приведенные ниже фигуры и примеры должны иллюстрировать сущность изобретения, не ограничивая возможности изобретения.

Пример 1: Количественное определение морфина в пробе

A. Получение магнитных частиц (МР), присоединенных к антителу (Ab) против морфина

В коллекторе магнитных частиц (MPC), MPs выделяли из 100 мкл раствора магнитных частиц (Ademtech, 200 нм, покрытые G-белком MP, партия №0433) и растворяли в 100 мкл PBS+0,65% Tween 20. После добавления 10 мкл моноклональных антител мыши (стоковый раствор 1 мг/мл) смесь перемешивали в течение 1 ч при КТ, с последующей двухкратной промывкой, используя MPC, 100 мкл PBS+0,65% Tween 20 и однократной промывкой 100 мкл триэтаноламина (0,2 М, pH 8). MPs растворяли в 1 мл раствора DMP (20 мМ) в триэтаноламине (0,2 М, pH 8), после чего раствор перемешивали в течение 30 минут при КТ. Реакцию сшивания останавливали добавлением 50 мкл Tris (1 М, pH 7,5, кон.конц.=50 мМ), после чего перемешивание продолжали в течение 15 минут при КТ. MPs выделяли и однократно промывали, используя MPC, 100 мкл Tris (50 мМ, pH 7,5) и однократно в MPC буфером для хранения, и, наконец, растворяли в 100 мкл буфера для хранения.

B. Анализ

Золотые диски матировали и покрывали БСА или БСА-OPI (3 мкг/мл) в буфере для нанесения (15 мМ карбонат натрия, 35 мМ бикарбонат натрия, 0,05% азид натрия, pH 9,6). Покрытые диски 3 раза промыли промывочным буфером (0,05% Tween 20 в PBS). Серию разведений морфина приготовили в пробирках в буфере для разбавления (PBS+0,65% Tween 20+10 мг/мл БСА; 2x проверяемая концентрация). Предварительно перемешанный раствор МР (0,1% масс/об=1 мг/мл МР в буфере) добавляли к каждому раствору в пробирках (раствор МР:раствор морфина=1:1). 50 мкл каждого из полученных растворов поместили в лунку, после чего на MPs воздействовали приложением магнитной силы в течение 30 сек (6-24 фН) или оставляли оседать в течение 30 мин. Затем несвязанные MPs удаляли посредством приложения магнитной силы (70 фН) в течение 30 сек, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл IgG-HRP против антител мыши (разведение стока 1:3000 в буфере для разбавления), с последующей инкубацией в течение 60 мин при КТ. Диски промывали 4 раза по 200 мкл промывочного буфера на лунку и переносили в белые титровальные микропланшеты, в лунках которых содержался промывочный буфер. Промывочный буфер удаляли и добавили 100 мкл смеси AB (ECL; A+B смешивали 1:1), после чего инкубировали в течение 5 минут при КТ. Затем считывали люминесценцию.

Используя данную схему анализа, морфин, связанный с БСА в качестве носителя, наносили на поверхность золота (физическая сорбция). Антитела против морфина (моноклональные) были связаны с магнитными частицами (MPs), покрытыми G-белком. С использованием луночного планшета была получена кривая зависимости от дозы, используя свободный морфин для конкуренции с морфином на поверхности за сайты связывания антител на гранулах (показаны в описании на фигуре 2). Как было объяснено выше, гранулы притягивали к биологически активной поверхности, используя постоянные магниты, расположенные под поверхностью золота, или оставляли оседать на поверхность. Несвязанные гранулы извлекали из раствора, поместив постоянный магнит в раствор над поверхностью золота. Чтобы определить количество MPs, связанных с поверхностью, выполняли инкубацию с вторичным антителом (антитело козы против мыши), связанным с HRP (пероксидазой хрена), после чего несвязанное вторичное антитело удаляли промывкой. Затем, используя люминол (субстрат HRP), определяли количество связанной HRP путем измерения люминесценции.

Как может быть видно из фигуры 2, магнитное воздействие делает кривую зависимости от дозы более крутой, что приводит к большей чувствительности анализа.

Пример 2

A. Нанесение Ab на поверхность золота

Для альтернативного варианта осуществления способа настоящего изобретения авторам сначала было нужно поместить Ab на поверхность золота. Как показано на фигуре 3, лучше всего это удавалось, когда на поверхность сначала помещали G-белок (pG). В данном случае для покрытия поверхности золота использовали 50 мкг/мл G-белка. Затем поверхность промывали и инкубировали с различными количествами Ab. После этого поверхность инкубировали с HRP-морфином и промывали. Затем количество связанного морфина определяли, используя люминол/люминесценцию. Полученный сигнал отражал количество функционального Ab на поверхности. Темно-серый прямоугольник на фигуре 3 (Ab) представляет Ab, связавшееся непосредственно с поверхностью золота (физическая сорбция), при удалении G-белка. Белый прямоугольник представляет поверхность золота, покрытую БСА (без Ab, без G-белка), с целью контроля на предмет неспецифического связывания.

B. Нанесение морфина на магнитные частицы (MPs)

Для данного формата анализа также требовался морфин, связанный с MPs. В данном случае использовали COOH MPs, полученные от Ademtech (использовали гранулы размером 200 нм и 300 нм).

Морфин-3-глюкуронид связывали с COOH-частицами, первоначально активируя COOH-группы с использованием EDC/NHS. Затем активированные группы подвергали реакции с этилендиамином (чтобы получить свободные NH₂-связывающие сайты). Морфин-3-глюкуронид в свою очередь активировали с использованием EDC/NHC и подвергали реакции с обработанными MPs. На фигуре 4 показан тест на функциональность данных гранул. Ab против морфина поместили на поверхность (посредством G-белка), как описано выше, а затем гранулы, связанные с морфином, притягивали к поверхности, используя постоянные магниты, расположенные под поверхностью. Несвязанные гранулы извлекали из раствора, поместив постоянный магнит в раствор над поверхностью. После этого выполняли инкубацию с биотинилированным вторичным Ab (наблюдали, что, по всей видимости, из-за высокого уровня биотинилирования данное Ab не связывалось с G-белком), а после стадий промывки проводили инкубацию со HRP-стрептавидином. Затем с помощью люминол/люминесценции определили количество HRP, связанной с поверхностью.

Результаты показаны на фигуре 4. Первые два прямоугольника представляют два различных разведения МР, третий прямоугольник представляет параллельный анализ, в котором Ab не было связано с поверхностью (для контроля на предмет неспецифического связывания MP-морфина с поверхностью), четвертый прямоугольник представляет тот же анализ, выполненный параллельно с MPs, которые не были связаны с морфином.

Одним из преимуществ, которое наблюдали при использовании данной схемы анализа, являлся тот факт, что гранулы, покрытые морфином, не имеют тенденцию к агрегации (в отличие от MPs, покрытых Abs, которые имеют тенденцию к агрегации). Агрегация гранул часто становится проблемой, когда предполагается детектирование одиночных гранул.

C. Конкурентный анализ

Конкурентный анализ выполняли в луночном планшете, используя MPs и поверхности, описанные выше. Результаты приведены на фигуре 5. http://www.wipo.int/pctdb/images/PCT-IMAGES/22112007/IB2007051578 22112007 gz en.x4-b.jpg

Изобретение относится к области медицины, а именно способам детектирования мишени в пробе. Способ включает контакт пробы и первой связывающей молекулы, присоединенной к магнитной частице, в одно и то же время или разное время, со второй связывающей молекулой, присоединенной к твердой подложке. Первая связывающая молекула способна связываться со второй связывающей молекулой, а мишень способна препятствовать указанному связыванию. Магнитная сила прикладывается с целью перемещения магнитной частицы в положение в непосредственной близости к твердой подложке. Детектируют количество магнитных частиц, связанных с твердой подложкой посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой, где указанное число магнитных частиц определяется посредством обеспечения связывания третьей связывающей молекулы, способной к селективному связыванию с первой связывающей молекулой, с первыми связывающими молекулами, присоединенными к указанным магнитным частицам, с последующим детектированием третьих связывающих молекул, связанных с указанными первыми связывающими молекулами, где первые связывающие молекулы, с которыми обеспечено связывание указанной третьей связывающей молекулы, являются первыми связывающими молекулами, которые не включены в связывание со второй связывающей молекулой. Применение магнита для приложения магнитной силы, с целью перемещения магнитной частицы в положение в непосредственной близости к твердой подложке. Использование заявленного изобретения позволяет повысить точность определения присутствия или отсутствия конкретных соединений. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Способ детектирования мишени, имеющей только один эпитоп, в пробе, подозреваемой на наличие мишени, включающий:
a) контактирование пробы и первой связывающей молекулой, присоединенной к магнитной частице, в одно и то же время или в разное время, со второй связывающей молекулой, присоединенной к твердой подложке, где первая связывающая молекула способна связываться со второй связывающей молекулой, и где мишень способна препятствовать указанному связыванию; и приложение магнитной силы для перемещения магнитной частицы в положение в непосредственной близости к твердой подложке; и
b) детектирование количества магнитных частиц, связанных с твердой подложкой посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой, где указанное число магнитных частиц определяется посредством обеспечения связывания третьей связывающей молекулы, способной к селективному связыванию с первой связывающей молекулой, с первыми связывающими молекулами, присоединенными к указанным магнитным частицам, с последующим детектированием третьих связывающих молекул, связанных с указанными первыми связывающими молекулами, и где первые связывающие молекулы, с которыми обеспечено связывание указанной третьей связывающей молекулы, являются первыми связывающими молекулами, которые не включены в связывание со второй связывающей молекулой.

2. Способ по п.1, где первая связывающая молекула способна селективно связывать мишени в пробе и вторую связывающую молекулу, и где стадия контактирования а) включает обеспечение конкуренции второй связывающей молекулы с мишенью за указанное селективное связывание с первой связывающей молекулой.

3. Способ по п.2, где вторая связывающая молекула идентична мишени или является гомологом мишени.

4. Способ по п.1, где вторая связывающая молекула способна селективно связывать мишени в пробе и первую связывающую молекулу и где стадия контактирования а) включает обеспечение конкуренции первой связывающей молекулы с мишенью за указанное селективное связывание со второй связывающей молекулой.

5. Способ по п.4, где первая связывающая молекула идентична мишени или является гомологом мишени.

6. Способ по п.1, где мишень выбрана из группы, состоящей из маленькой молекулы, лекарственного вещества, белка, пептида, фермента, гормона и нуклеиновой кислоты.

7. Способ по п.6, где мишень представляет собой лекарственное вещество, например лекарственное вещество, вызывающее наркотическую зависимость.

8. Способ по п.7, где лекарственное вещество, вызывающее наркотическую зависимость, является морфином, кокаином, ТГК, анаболическими стероидами или лекарственным веществом группы амфетамина/метамфетамина.

9. Способ по п.1, где магнитная сила приложена таким способом, чтобы уменьшить или устранить влияние различия в подвижности между мишенью и первой связывающей молекулой, присоединенной к магнитной метке, на связывание со второй связывающей молекулой.

10. Способ по п.9, где магнитная сила приложена посредством электромагнита, катушки без сердечника или постоянного магнита.

11. Способ по п.1, дополнительно включающий перед стадией детектирования b) стадию удаления первых связывающих молекул, несвязанных со второй связывающей молекулой в ходе стадии а).

12. Способ по п.11, где первые связывающие молекулы, несвязанные со второй связывающей молекулой, удаляют посредством приложения магнитной силы.

13. Способ по п.1 или 11, где первая связывающая молекула присоединяется к указанной магнитной частице через спейсерную молекулу, белок или пару сильного связывания.

14. Способ по п.13, где спейсерная молекула представляет собой алкилендиамин или этилендиамин.

15. Способ по п.1, где твердая подложка представляет собой поверхность сенсорного устройства, например магнитного сенсорного устройства.

16. Способ по п.15, где поверхность сенсора представляет собой поверхность золота.

17. Способ по п.16, где поверхность золота покрыта белком, с которым связана вторая связывающая молекула.

18. Способ по п.17, где указанный белок представляет собой А-белок или G-белок и где вторая связывающая молекула представляет собой антитело, способное к связыванию А-белком или G-белком соответственно.

19. Способ по п.1, где указанное детектирование выполняется посредством детектируемой метки, которая связана с третьей связывающей молекулой.

20. Способ по п.1, где указанное детектирование выполняется посредством обеспечения связывания агента, который связан с детектируемой меткой и способен к селективному связыванию с третьей связывающей молекулой, с третьими связывающими молекулами, связанными с указанными первыми связывающими молекулами, с последующим детектированием указанной детектируемой метки.

21. Способ по п.19 или 20, где детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентной метки, колориметрической метки, хемилюминесцентной метки, ферментной метки (например, пероксидазы хрена), радиоактивной метки, электростатически заряженной метки и донорно/акцепторной метки.

22. Способ по п.1, где указанная проба состоит из или получена из мочи, крови, пота, глазной жидкости, внутриротовой жидкости (слюны) или волос.

23. Способ по п.1, где магнитная частица выбрана из группы, состоящей из магнитной, диамагнитной, парамагнитной, суперпарамагнитной, ферримагнитной и ферромагнитной частицы.

24. Способ по п.23, где магнитная частица имеет размер приблизительно от 10 нм до приблизительно 10 мкм, приблизительно от 50 нм до приблизительно 1 мкм, приблизительно от 100 нм до приблизительно 500 нм, приблизительно 300 нм или приблизительно 200 нм.

25. Применение магнита для приложения магнитной силы с целью перемещения магнитной частицы в положение в непосредственной близости к твердой подложке в любом из способов по пп.1-24.

26. Применение по п.25, где магнит представляет собой электромагнит, катушку без сердечника или постоянный магнит.