ПРЕПАРАТ ДЛЯ САНАЦИИ СПЕРМЫ ЖИВОТНЫХ "АПРЭРЕМ" Российский патент 2001 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к животноводству, в частности к препаратам, которые используют для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных в средах для ее разбавления и криоконсервации.

Известен препарат для санации спермы животных - полиген, в состав которого входят антибиотики: полимиксина сульфат и гентамицина сульфат [1], который наиболее близок по технической сущности к изобретению.

Недостатком этого препарата является низкая широта полезного действия полимиксина, одного из компонентов этого санирующего препарата. Длительное применение полимиксина в практике ветеринарии (более 30 лет) привело к повышению устойчивости к нему микрофлоры.

В опытах отечественных и зарубежных ученых чувствительность бактерий, выделенных из спермы быков, для полимиксина составила всего лишь 3-8% [2], чувствительность микрофлоры спермы к гентамицину является довольно высокой - 98,6-100%. Однако в некоторых опытах применение гентамицина для санации спермы быков снижало оплодотворяемость коров на 5% [2].

В целом, полиген как санирующий препарат не всегда в должной мере обеспечивает защиту разбавленной спермы от загрязнения и дальнейшего развития микрофлоры. Его эффективность находится в зависимости от начального осеменения микроорганизмами нативной спермы.

Так, из наставления по применению полигена следует, что при наличии в сперме 100 тыс. микробных тел и более в 1 см³ следует внести 600 мкг препарата на 100 см³ разбавленной спермы, а при содержании менее 100 тыс. микроорганизмов в 1 см³ вносят 300 мкг препарата [1]. Эта рекомендация, очевидно, исходит из того факта, что повышенное содержание гентамицина отрицательно влияет на оплодотворяемость коров, о чем было показано выше [2].

Кроме того, указание наставления о применении 300 мкг или 600 мкг препарата, исходя из различной обсемененности спермы, на практике не выполнимо, так как инструкцией работы племпредприятия предусматривается проводить ветеринарно-санитарную оценку спермы (количество микроорганизмов и коли-титр) один раз в квартал [3], а у неблагополучных производителей - 1 раз в 6-10 дней.

Целью изобретения является повышение эффективности препарата.

Поставленная цель достигается за счет увеличения бактерицидной активности санирующего препарата.

Сущность способа заключается в использовании антибактериального препарата, содержащего апрамицин и эремомицин, обладающие высокой бактерицидной активностью, в равном соотношении - 350 мг каждый на 1 л среды.

Предлагаемый способ позволит уменьшить бактериальную загрязненность разбавленной спермы, увеличить срок ее использования и повысить оплодотворяемость маток. Сухие заготовки лактозо-желточно-глицериновой среды готовят согласно наставлению по их применению [3]. В стерильную химическую колбу наливают необходимый объем прокипяченной дистиллированной воды (1 л) и добавляют лактозу. Для полного растворения препарата и его стерилизации колбу помещают в водяную баню и стерилизуют в течение 5-10 мин с момента закипания воды в бане, затем охлаждают до 35-40^oC и добавляют желток куриного яйца, глицерин и антибиотики (спермосан апрэрем) в дозе: апрамицин - 350 мг и эремомицин - 350 мг.

Свежеприготовленная среда представляет собой однородную эмульсию без осадка, слабо-желтого цвета, pH 6,8±0,2, осмотическое давление без глицерина при 0^oC 7,8±0,3 атм.

Показатель абсолютной выживаемости спермиев (S_a) при температуре 2-4^oC составляет не менее 900 условных единиц.

Готовый препарат спермосана - апрэрем представляет собой сыпучий однородный порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде. Сохраняет свою активность в течение 2-лет в сухом помещении при температуре не выше 20^oC.

Пример 1. Для экспериментальной проверки на токсичность составляют 22 варианта доз препарата с различными концентрациями апрамицина и эремомицина. Каждый вариант препарата испытывают на безвредность для спермиев по их показателю абсолютной выживаемости - S_a, в условных единицах (у.е.). Для этого испытуемые антибиотики в разных дозах вносят в ЛГЖ среду для разбавления и криоконсервации спермы из расчета 100-600 мкг/мл.

Далее, свежеполученную и смешанную от 1-2 быков сперму с подвижностью не ниже 7,5 баллов и концентрацией не ниже 0,8 млрд/мл разбавляют из расчета 1: 15-20 указанной средой с проверяемыми вариантами антибиотиков и с базовым прототипом - спермосаном полиген (контроль).

После разбавления спермы определяют подвижность спермиев, которую в последующем оценивают через каждые 24 часа, до момента их гибели при условии хранения в холодильнике при температуре +2 - +4^oC. На основе полученных данных подсчитывают показатель абсолютной выживаемости (S_a) спермиев. Каждый вариант препарата оценивают по 5 опытам, с последующей статистической обработкой полученных данных.

Влияние различных доз апрамицина и эремомицина на выживаемость сперматозоидов показано в табл. 1.

В исследованиях наиболее высокий абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов быков в среде с апрамицином был равен 880 y.e., а в среде с эремомицином - 900 y.e. при содержании в каждом варианте антибиотиков соответственно 350 мкг/мл и 400 мкг/мл. Это на статистически достоверную величину выше, соответственно на 112,2 и 114,8%, чем в контроле (табл. 1).

Пример 2. В табл. 2 представлены результаты подбора оптимального сочетания компонентов нового бактериального комплекса, произведенного по методу встречных рядов (табл. 2).

В опытах было установлено, что на статистически достоверную величину - 46-96 у.е. показатель абсолютной выживаемости спермиев 4-8 вариантов был выше контроля.

Наиболее высокий показатель выживаемости сперматозоидов быков был у шестого варианта и равнялся 912 ед., т.е. на 14,8% выше контроля, в котором для санаций спермы использовали полиген. Шестой вариант на 100 мл воды содержал по 350 мкг апрамицина и эремомицина.

Пример 3. Проведено сравнительное испытание прототипа - полигена и нового антибактериального комплекса с оптимальным соотношением компонентов - по 350 мкг апрамицина и эремомицина.

Для этого разбавленную ЛГЖ средой, смешанную от 2-3 быков сперму делят на 5 равных частей (по 100 мл) и добавляют туда антибиотики - 5-7 вариант, показавшие наиболее высокий результат сочетанного воздействия на выживаемость сперматозоидов. В первую часть спермы антибиотики не добавляют. Во вторую часть пробы вносят спермосан - прототип 300 мкг полигена. В третью часть вносят пятый вариант - 300 мкг апрамицина и 400 мкг эремомицина, в четвертую - вносят по 350 мкг апрамицина и эремомицина. В пятую часть вносят 400 мкг апрамицина и 300 мкг эремомицина.

Далее указанные пробы спермы эквилибрируют в течение 4-х часов и замораживают на фторопластовой пластине гранулами по 0,2 мл в парах жидкого азота. Замороженную сперму хранят в течение 2-х месяцев в азоте, после чего гранулы размораживают и каждую пробу высевают в 5-ти чашках с 2% МПА и 1% глюкозы. Посевы инкубируют при температуре 37-30^oC в течение 72 час. Подсчитывают среднее число выросших колоний.

Данные по микробной контаминации замороженно-оттаянной спермы быков в зависимости от каждого санирующего препарата показаны в табл. 3.

Опыты показывают, что каждый испытанный вариант нового антибактериального комплекса проявляет более высокое бактерицидное действие (в 2,5-9,9 раз) при различной обсемененности разбавленной спермы.

Наибольшей бактерицидной активностью (в 6,5-9,9 раз по сравнению с базовым вариантом) обладает шестой вариант рекомендуемого комплекса, в котором содержалось по 350 мкг/100 мл апрамицина и эремомицина.

Пример 4. Проведено сравнительное испытание бактерицидного действия прототипа - полигена и нового антибактериального комплекса - апрэрема, содержащего оптимальное количество апрамицина и эремомицина - по 350 мкг/100 мл каждого.

Для анализа использовали кровяной мясопептонный агар (5% крови КРС), разлитый в чашки Петри, в которые высевали образцы спермы с известной микробной контаминацией. Инкубацию посевов проводили при 37^oC в течение 24 часов. Расчет количества микроорганизмов осуществляли путем подсчета колоний (КОЕ/мл) на питательной среде в чашке.

Эффективность санирования разбавленной спермы быков в зависимости от средней (КОЕ/мл = 15500), большой (КОЕ/мл= 86 тыс.) и очень большой (КОЕ/мл = 210 тыс.) начальной обсемененности представлена в табл.4.

В исследованиях было установлено, что спермосан полиген (контр.) снизил обсемененность образцов разбавленной спермы на 95,3-95,7%. Однако расчеты показывают, что такое снижение является недостаточным, так как инструкция допускает наличие в 1 дозе (0,2- 0,5 мл) не более 500 микробных тел.

Санирующая способность рекомендуемого (опытного) комплекса удовлетворяет требованиям инструкций при каждом из рассмотренных уровней обсемененности спермы.

Пример 5. Комплексный санирующий препарат - спермосан апрэрем испытан в производственных условиях на оплодотворяющую способность спермиев быков после искусственного осеменения коров и телок в хозяйствах Белгородской области.

Результаты производственных испытаний представлены в табл. 5.

Исследованиями установлено, что в опытной группе нетелей после осеменения телок было больше, чем в контрольной группе на 10,2%, а стельных коров - на 7,2%. Это свидетельствует о более высокой оплодотворяющей способности спермы быков, санированной предлагаемым спермосаном апрэрем.

Таким образом, применение нового антибактериального препарата, состоящего из апрамицина (350 мг/л) и эремомицина (350 мг/л) обеспечивает снижение бактериальной загрязненности в 9,1-14,6 раз, повышение абсолютного показателя выживаемости спермиев на 14,8%, и повышение оплодотворяемости телок и коров соответственно на 10,2 и 7,2% по сравнению со спермосаном полиген.

Источники информации
1. Наставление по применению препарата "Поливен" для санации спермы и эмбрионов сельскохозяйственных животных. Москва, 1997.

2. В. Г. Семаков. Криоконсервация спермы быков и баранов: Обзорная информация. Информ/ВНИИТЭагропром. М., 1991.

3. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1981.

Изобретение относится к животноводству. Способ заключается в использовании антибактериального препарата, содержащего апрамицин и эремомицин при следующем соотношении компонентов на 1 литр среды для разбавления и криоконсервации спермы, мг: апрамицин 350; эремомицин 350. Способ позволяет уменьшить бактериальную загрязненность разбавленной спермы, увеличить срок ее использования и повысить оплодотворяемость маток за счет увеличения бактерицидной активности санирующего препарата. 5 табл.

Препарат для санации спермы животных, включающий антибиотики, отличающийся тем, что в качестве антибиотиков препарат содержит апрамицин и эремомицин при следующем соотношении компонентов на 1 литр среды для разбавления и криоконсервации спермы, мг:
Апрамицин - 350
Эремомицин - 350о