ПРЕПАРАТ ДЛЯ САНАЦИИ СПЕРМЫ ЖИВОТНЫХ "АПРАГЕН" Российский патент 2002 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к животноводству, в частности к препаратам, которые используют для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных в средах для ее разбавления и криоконсервации.

Известен препарат для санации спермы животных, содержащий бензил пенициллин натриевой или калиевой соли, полимиксин М сульфат или полимиксин В сульфат и канамицин сульфат-ППК (1).

Недостатком этого комплексного препарата является низкая широта полезного действия вследствие довольно длительного применения (более 40 лет) таких антибиотиков как пенициллин и полимиксин, что привело к повышению устойчивости к ним микрофлоры.

Чувствительность бактерий, выделенных из сперма быков, в опытах зарубежных и наших ученых составила всего лишь 10,8% для пенициллина и 3-8% для полимиксина.

Целью изобретения является повышение эффективности препарата. Цель достигается за счет увеличения бакторицидной активности санирующего препарата.

Сущность способа заключается в использовании антибиотиков широкого спектра действия апрамицина и гентамицина, в соотношении 300 мг и 400 мг соответственно на 1 л среды для создания высокоэффективного антибактериального препарата.

Предлагаемый способ позволит уменьшить бактериальную загрязненность разбавленной спермы, увеличить срок ее использования и повысить оплодотворяемость маток.

Способ осуществляют следующим образом. В чистую стеклянную колбу вносят 11,5 г лактозы и 100 см³ прокипяченой дистиллированной воды. Колбу помещают в водяную баню и стерилизуют 5-10 мин с момента закипания воды в бане, затем охлаждают до 35-40^oС и добавляют глицерин, желток куриного яйца (в объемах согласно инструкции (2) и санирующий препарат АПРАГЕН - 300 мкг апрамицина и 400 мкг гентамицина. Свежеприготовленная среда представляет собой однородную эмульсию без осадка светло-желтого цвета без запаха, рН 68±0,2, осмотическое давление без глицерина при 0^oС 7,8±0,3 атм.

Для приготовления санирующего препарата используют апрамицина сульфат и гентамицина сульфат. Отвешивают расчетное количество каждого компонента и смешивают в смесителе до однородного состояния. Готовый препарат фасуют по 350-700 мг во флаконы объемом 12,0 см³, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. Готовый препарат представляет собой однородный порошок белого цвета со слабым специфическим запахом, легко растворимый в воде и буферных растворах. Препарат хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25^oС, срок годности - 2 года со дня заготовки.

Показатель абсолютной выживаемости спермиев (S_a) при температуре 2-4^oС составил 898±12 у. е.

Пример 1. Для экспериментальной проверки на токсичность составляют 22 варианта различных доз апрамицина и гентамицина. Каждый вариант препарата испытывают на безвредность для спермиев по их показателю абсолютной выживаемости (S_a у. e. ). Для этого испытуемые антибиотики в разных дозах вносят в ЛГЖ среду для разбавления и криоконсервации спермы из расчета 100-600 мкг на 100 см³ среды.

Свежеполученную и смешанную сперму от 1-2 быков с подвижностью спермиев не ниже 7,5 баллов и концентрацией не ниже 0,8 млрд/см³ разбавляют из расчета 1: 15-20 с проверяемыми препаратами и с базовым - контрольным спермосаном ППК. После разбавления спермы определяют подвижность спермиев, которую в последующем оценивают через каждые 24 часа, до момента их гибели при условии хранения в холодильнике при температуре 2-4^oС. На основе полученных данных рассчитывают показатель абсолютной выживаемости (S_а) спермиев, выраженной в условных единицах (у. е. ).

Каждый вариант препарата оценивают по 5 опытам с последующей статистической обработкой полученных данных.

Влияние различных доз апрамицина и гантамицина на выживаемость сперматозоидов быка в ЛЖГ среде представлено в табл. 1.

Наилучший показатель абсолютной выживаемости спермиев быков в среде с апрамицином, равный 868 у. е. , обеспечивается при использовании 300 мкг/100 см³, а с использованием гентамицина (S_а= 882 у. е. ) при наличии 400 мкг/100 см³ (табл. 1) эти концентрации апрамицина и гентамицина увеличивают абсолютный показатель выживаемости спермы соответственно на 17,0 и 18,8% по сравнению с базовым спермосаном ППК.

Следовательно, введение в среду только апрамицина или гентамицина увеличивает выживаемость сперматозоидов в широком диапазоне концентраций - от 100 до 600 мкг/100 см³ более значительно, чем введение спермосана ППК.

Пример 2. В табл. 2 представлены результаты подбора, произведенного по методу встречных рядов, оптимального сочетания компонентов нового бактерицидного препарата.

Положительный эффект (увеличение абсолютного показателя выживаемости на 15-20% от контроля со спермосаном ППК наблюдается при сочетании компонентов санирующего препарата в широком диапазоне их концентраций в лактозо-глицерино-желточной среде: апрамицина 200-450 мкг, гентамицина 300-500 мкг на 100 мл среды.

Наиболее высокий показатель выживаемости сперматозоидов быков 898 у. е. или 121,3% от контроля со спермосаном ППК обеспечивает следующее сочетание компонентов на 100 мл среды: апрамицин - 300 мкг, гентамицин - 400 мкг.

Пример 3. Проведено сравнительное испытание бактерицидных свойств контрольного спермосана ППК (прототип) и нового антибактериального комплекса, содержащего оптимальное количество компонентов (апрамицин 300 мкг/100 см³ и гентамицина 400 мкг/100 см³ (табл. 3).

Разбавленную лактозо-глицерино-желточной (ЛГЖ) средой пробу спермы быков делят на 5 равных частей. В первую часть пробы антибиотики не вносят; во вторую часть пробы вносят апрамицин из расчета 300 мкг/100 мл; в третью часть вносят гентамицин из расчета 400 мкг/100 мл; в четвертую часть вносят предлагаемый препарат в оптимальных дозах (апрамицин 300 мкг/100 мл + гентамицин 400 мкг/100 мл), в пятую часть вносят базовый препарат спермосан - ППК (100 тыс. ЕД/10 мл).

Далее, указанные пробы спермы быков эквилибрируют в течение 4 час и замораживают на фторопластовой пластине в парах жидкого азота. Замороженную сперму хранят в жидком азоте в течение месяца, после чего гранулы спермы размораживают и каждую пробу высевают в 5 чашек с 2% МПА и 1% глюкозы. Посевы инкубируют при температуре 37-38^oС в течение 72 час. Подсчитывают среднее число выросших колоний по 5 чашкам для каждой пробы спермы.

Данные по микробной контаминации замороженно-оттаянной спермы быков в зависимости от каждого санирующего препарата представлены в табл. 3.

Опыт показал, что каждый препарат антибактериального комплекса оказался эффективное спермосана-ППК в 36-100 раз (табл. 3). Совместное (сочетанное) применение апрамицина и гентамицина проявляет более высокое бактерицидное действие, чем каждый препарат в отдельности (проявляется феномен синергизма).

Следовательно, новый антибактериальный комплекс при применении его в образцах спермы с высокой бактериальной обсемененностью (67-108 тыс. /мл) оказался эффективнее базового спермосана ППК в 80-125 раз.

Пример 4. Проведено сравнительное испытание бактерицидного действия спермосана ППК (прототип) и нового предлагаемого санирующего препарата, содержащего оптимальное количество компонентов - апрамицина 300 мг и гентамицина 400 мг на 1 литр среды.

Эффективность санирования разбавленной спермы быков в зависимости от средней (КОЕ/мл 18 тыс. ), большой (КОЕ/мл 276 тыс. ) и очень большой (КОЕ/мл 606 тыс. ) начальной обсемененности представлена в табл. 4.

Для анализа использовали кровяной мясопептонный агар (5% крови крупного рогатого скота), разлитый в чашках Петри, в которые высевали образцы спермы с указанной микробной контаминацией.

Инкубацию посевов проводили при 37^oС в течение 24 час. Расчет количества микроорганизмов осуществляли путем подсчета колоний на питательной среде (табл. 4).

Предлагаемый новый спермосан апраген по своим бактерицидным свойствам оказался эффективнее базового спермосана - ППК на 18-24% при различном уровне микробной контаминации спермы (табл. 4).

Пример 5. Комплексный санирующий препарат спермосан - апраген испытан в производственных условиях на оплодотворяющую способность спермиев быков после искусственного осеменения коров и телок в хозяйствах Ивановской области. Результаты производственных испытаний представлены в табл. 5.

Приведенные исследования свидетельствуют о более высокой оплодотворяющей способности спермы быков, санированной предложенным спермосаном - апрагеном (табл. 5). В опытной группе стельных коров было больше, чем в контроле на 10,9%, а неталей - на 9,2%.

Таким образом, применение нового предлагаемого антибактериального комплекса обеспечивает снижение бактериальной загрязненности и повышение биологической полноценности сперматозоидов: выживаемости и оплодотворяющей способности спермиев по сравнению с использованием спермосана - ППК.

Источники информации
1. Авторское свидетельство 1727228. Препарат для санации спермы животных "Спермосан-ППК". БИ 14, 1992.

2. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению с. -х. животных. М. : Колос, 1981.

Изобретение относится к животноводству. Способ заключается в использовании антибактериального препарата, содержащего апрамицин и гентамицин в следующем соотношении компонентов на 1 л среды для разбавления, криоконсервации и хранения спермы: апрамицин (мг) - 300, гентамицин (мг) - 400. Способ позволяет уменьшить бактериальную загрязненность разбавленной спермы, увеличить срок ее использования и повысить оплодотворяемость маток за счет увеличения бактерицидной активности санирующего препарата. 5 табл.

Препарат для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных, включающий антибиотики, отличающийся тем, что в качестве антибиотиков содержит апрамицин и гентамицин при следующем соотношении компонентов среды для разбавления, криоконсервации и хранения спермы, мг/л:
Апрамицин - 300
Гентамицин - 400