РАДИОЗАЩИТНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2002 года по МПК A61K31/355 A61K31/375 A61K49/00 A61P39/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к радиологии, и может быть использовано для профилактики и раннего лечения лучевых поражений человека.

В современных условиях низкодозовые (нелетальные) радиационные воздействия становятся одними из главных факторов, дестабилизирующих геном млекопитающих. Возможность возникновения радиационных поражений организма при однократном облучении в дозах, не превышающих 1-2 Гр, а также опасность кумулирования цитогенетических эффектов радиации при пролонгированном и повторном (фракционированном) облучении малыми дозами ионизирующих излучений определяют необходимость разработки соответствующих фармакологических средств защиты.

Поскольку ситуации, при которых могут возникать поражения малыми дозами радиации, оказываются чрезвычайно разнообразными, одно из важнейших требований, предъявляемых к указанным средствам, заключается в универсальности последних, то есть:
- способности ослаблять цитогенетические эффекты различных видов низкодозовых радиационных воздействий (кратковременных и пролонгированных, однократных и повторных);
- проявлении защитного эффекта на уровне как соматических, так и половых клеток;
- наличии как профилактического, так и лечебного противолучевого эффекта.

Обязательными требованиями к препаратам, рассчитанным на широкое применение, также являются эффективность при пероральном способе введения и хорошая переносимость при многократном использовании, пригодность для промышленного производства.

Известны вещества, оказывающие радиозащитное действие при низкодозовом облучении. Так, сероазотсодержащие радиопротекторы снижают выход хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, облученных в дозе 1 Гр [1], но защитный эффект этих соединений отмечен только при кратковременном облучении и профилактическом применении препаратов.

Соединения инденового ряда обладают профилактической антимутагенной активностью на уровне половых и соматических клеток при общем рентгеновской облучении в дозах 1-2 Гр [2], а меланин, относящийся к числу хиноидных соединений, частично защищает половые клетки от малых доз радиации [3]. Но разработка инденовых соединений и меланинов остановилась на стадии лабораторных испытаний, и стандартные лекарственные формы этих веществ пока не созданы.

Также известен лекарственный препарат рибоксин, который снижает количество аберрантных митозов в клетках костного мозга, сохраняет пул клеток-предшественников в костном мозге и герминативном эпителии при низкодозовом облучении. Но рибоксин же обладает и своеобразным "радиомиметическим" эффектом, увеличивая количество хромосомных аномалий в миелокариоцитах необлученных животных [4].

Также были изучены в качестве средств защиты от низкодозового облучения лекарственные препараты из числа витаминов - витамин E (α-токоферола ацетат) и витамин C (аскорбиновая кислота). Но полученные данные не позволяют сделать однозначного вывода о влиянии этих витаминов на радиорезистентность биологических объектов. Наряду с радиозащитным эффектом [5, 6] в экспериментах иногда было отмечено отсутствие противолучевого действия указанных витаминов [7, 8]. В опытах же с летальным облучением витамины E и C могли обладать и радиосенсибилизирующим действием [5, 9].

Также была изучена в качестве противолучевого средства рецептура, включающая витамины E, C и A. Пероральное применение этой рецептуры снижало выход хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 3,5 Гр [10]. Данная рецептура рассматривается в качестве прототипа.

Анализ рецептуры-прототипа показал, что, во-первых, она является многокомпонентной, причем один из компонентов (витамин A) проявляет весьма токсичные свойства [11]. Во-вторых, защитный эффект рецептуры был зарегистрирован только на уровне соматических клеток. В-третьих, эффект рецептуры проявился при дозе радиации, существенно превышающей верхнюю границу "малых" доз ионизирующих излучении и приближающейся по биологическому действию на организм к разряду минимальных летальных доз. Наконец, эффективность рецептуры при кратковременном рентгеновском облучении не может служить доказательством ее эффективности при других видах радиационных воздействий.

Учитывая сказанное, целью изобретения явилось изыскание лекарственного средства для защиты организма от низкодозовых радиационных воздействий, отвечающего перечисленным выше требованиям (универсальный характер защитного эффекта, эффективность при пероральном введении, низкая токсичность, технологичность). Эта цель достигается созданием двухкомпонентной рецептуры, включающей витамины E и C в дозе соответственно 10 мг/кг и 20 мг/кг. Известно применение рецептуры аналогичного состава в комбинации с лецитином как антимутагена при воздействии токсических веществ [12], как дополнительного средства к курсу химиотерапии туберкулеза [13], в комбинации с витамином F (линетолом) как средства для лечения неврозов [14]. Комбинация витаминов E и C (в различных дозах и весовых соотношениях) входит в состав многих комплексных витаминных препаратов общетерапевтического применения отечественного (Декамевит, Аэровит, Ундевит, Гендевит, Квадевит и др.) [15] и зарубежного (Макровит, Стресстабс и др.) [16] производства.

Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1.

Эксперименты выполнены на 75 беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г. Животных подвергали общему гамма-облучению на установке ИГУР в дозе 2 Гр в следующих режимах:
а) Однократное облучение с мощностью дозы 1,51 Гр/мин.

б) Фракционированное облучение фракциями по 0,25 Гр с интервалом между воздействиями 1 сут. Мощность дозы облучения 0,75 Гр/мин.

Критерием поражающего действия облучения и эффективности защитного действия препаратов было выбрано количество клеток с хромосомными аберрациями, учитываемое метафазным методом анализа. В каждом варианте опыта использовалось по 5 животных, от каждого животного анализировалось 100 метафаз.

Методика исследования хромосомных аберраций в клетках, костного мозга
Хромосомные аберрации исследовали в миелокариоцитах по методике Форда и Хамертона [17]. В основе этой методики лежит регистрация структурных повреждений хромосом, которые возникают на различных стадиях митотического цикла клетки и в своем развитии доходят до стадии метафазы.

Приготовление препаратов костного мозга проводили через 24 ч после облучения по методу, описанному А.М.Малашенко и Г.Н.Золотаревой [18], а также В. П. Орловым и соавторами [19]. Для этого за 2 ч до забоя животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 0,025 % раствора колхицина. Крыс забивали методом цервикальной дислокации, быстро выделяли большеберцовые кости и вымывали костный мозг подогретой до 37^oC средой N 199 в центрифужную пробирку с 10 мл той же среды. Пробирки с суспензией центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 8 мл подогретого (до 37^oC) 0,56% раствора хлористого калия. Клетки тщательно ресуспендировали и помещали в термостат при 37^oC на 20 мин, после чего вновь подвергали центрифугированию. Надосадочную жидкость отсасывали, оставляя ее около 0,3 мл. После тщательного перемешивания к осадку добавляли 6-8 мл охлажденного фиксатора, состоящего из ледяной уксусной кислоты и метанола, взятых в соотношении 1:3. Смесь готовили перед фиксацией и хранили в холодильнике. Пробирки закрывали пробками, содержимое их перемешивали встряхиванием и помещали в холодильник на 10-15 мин. Затем суспензию вновь центрифугировали и добавляли 5-6 мл свежего фиксатора. Эту процедуру повторяли 2-3 раза.

Перед приготовлением препаратов суспензию центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость отсасывали, а к осадку добавляли 1 мл свежего фиксатора и ресуспендировали пастеровской пипеткой. Затем на обезжиренные, влажные и охлажденные предметные стекла наносили 8-10 капель суспензии и фиксатор выжигали в пламени горелки. Стекла подсушивали на воздухе.

Окраску препаратов осуществляли раствором азур-эозина по Романовскому-Гимза в течение 40 мин. Краску готовили непосредственно перед применением смешиванием 10 мл дистиллированной воды, 5 мл 0,1 % раствора азура, 2 мл 0,1 % раствора эозина и 0,25 мл 5% бикарбоната натрия. После этого стекла промывали проточной водой и высушивали на воздухе.

Анализ препаратов проводили на микроскопе с иммерсионным объектом (увеличение 25х100х1,25), для чего отбирали неразрушенные клетки округлой формы с хорошим разбросом и без наложений хромосом. От каждого животного анализировали не менее 100 метафаз, всего на вариант опыта 500 клеток. Учитывали процент клеток с аберрациями хромосом.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Опыты показали, что отдельно взятые витамины практически не оказывают радиозащитного действия по выбранному критерию. Рецептура же, применяемая однократно за 1 ч до облучения и после облучения, почти в 2 раза снижает выход хромосомных аберраций в костно-мозговых клетках при однократном и фракционированном воздействии.

Пример 2.

Эксперименты выполнены на 60 белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г. Результаты представлены в табл. 2.

Общее однократное острое облучение проводили гамма-квантами в дозе 2 Гр на аппарате ИГУР-1 двумя источниками излучения (цезий-137) при мощности дозы 1,51 Гр/мин, а пролонгированное облучение (в том же диапазоне доз) - с помощью аппарата ЦЕГО при мощности дозы 0,0083 Гр/мин.

Фракционированное облучение осуществляли фракциями по 0,25 и 0,5 Гр с суточным интервалом между ними. Для этого использовали аппарат ИГУР-1 с двумя источниками излучений при мощности дозы 0,75 Гр/мин.

Рецептуру (витамины E+C) вводили через рот за 1 час до облучения (при фракционированном облучении вводили только перед первой фракцией облучения).

Методика определения частоты индуцированных реципрокных транслокаций (РТ)
Под понятием "реципрокные транслокации" понимают взаимные обмены участками негомологичных хромосом.

Цитологический анализ частоты РТ в стволовых сперматогониях исследовали через 45-60 дней после воздействия (то есть в постстерильный период) в сперматоцитах на стадии диакинеза-метафазы первого мейотического деления на постоянных воздушно-сухих препаратах, приготовленных по методике, предложенной Ивенсом, Фордом и соавторами [20].

Самцов забивали путем смещения шейных позвонков. Семенники извлекали, освобождали от оболочек, измельчали в 2,2% растворе цитрата натрия. Обравки тканей и оболочек семенных канальцев осаждали центрифугированием в течение 30 с при 100 g. Надосадочную жидкость подвергали повторному центрифугированию в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 1% растворе цитрата натрия для гипотонической обработки в течение 10 мин. После повторного центрифугирования клетки фиксировали в смеси метилового спирта и уксусной кислоты (3: 1) с добавлением 2-3 капель хлороформа. После двухкратной смены фиксатора 2 капли суспензии клеток в фиксаторе наносили на предметное стекло и просушивали под лампой. Препараты окрашивали уксусно-кислым лактоорсеином.

Анализ сперматоцитов проводили на стадии диакинеза-метафазы 1 мейотического деления. От каждого самца анализировали 200 метафаз (на вариант опыта - 1000). В норме на этой стадии сперматоциты содержат 21 бивалент, образованный при конъюгации гомологичных хромосом. В случае наличия РТ хромосомы с транслоцированными участками при конъюгации образовывали мультивалентные конфигурации из трех, четырех и более хромосом в виде "колец" или "цепей". Общее число бивалентов в этом случае меньше 21. Чаще всего наблюдались конфигурации в виде квадривалентов, указывающие на наличие одной РТ. Иногда в метафазе присутствуют ассоциации из трех и более бивалентов или имеются два и больше квадривалента, что указывает на наличие двух или более РТ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стъюдента.

Опыты показали, что при различных вариантах низкодозового облучения рецептура (витамины E+C) обладает выраженным защитным эффектом по критерию учета частоты реципрокных транслокаций в сперматогониях облученных мышей при всех вариантах радиационного воздействия.

Использованные в составе рецептуры дозы витамина E (10 мг/кг) и витамина C (20 мг/кг) не превышают средних терапевтических доз для человека при многократном ежедневном пероральном применении [6, 21, 22].

В экспериментах рецептура не обладала побочным действием и не оказывала заметного влияния на поведенческие реакции животных. Животные хорошо переносили рецептуру и при 20-кратном увеличении доз входящих в ее состав витаминов, взятых в весовом соотношении 1:2.

Изобретение соответствует критерию "новизна", так как впервые рецептура, составленная из витаминов E и C, взятых в весовом соотношении 1:2, использована для защиты организма одновременно на уровне соматических и половых клеток от низкодозовых радиационных воздействий.

Изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень", так как на основании известных из источников информации сведений возможность использования указанной рецептуры в качестве универсального лечебно-профилактического радиозащитного средства при низкодозовом облучении не представлялась очевидной.

Соответствие изобретения критерию "пригодность для промышленного применения" подтверждается приведенными примерами и тем, что оба компонента рецептуры выпускаются медицинской промышленностью. Биологическая совместимость витаминов E и C, примененных перорально в указанном весовом соотношении, показана в клинике [14].

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о достижении цели изобретения.

Доказана возможность существенного расширения сферы применения витаминов E и C. Предлагаемая рецептура может найти применение как радиозащитное средство для защиты человека от излучений местности, загрязненной радиоактивными веществами, при диагностическом и лечебном использовании источников ионизирующих излучений в амбулаторной и клинической практике, в случаях профессионального низкодозового облучения людей. Рецептура может быть использована как табельное радиозащитное средство в аптечках и специальных укладках, предназначенных для оказания медицинской помощи населению в случае возникновения чрезвычайных ситуаций.

Компоненты рецептуры являются физиологически приемлемыми веществами, химически и фармакологически совместимыми друг с другом официальными лекарственными средствами [23, 24].

Список литературы
1. Красильников И. И., Антушевич А.Е., Деев С.П., Мясоедов А.Ф. Способ профилактики биологических эффектов облучения, вызванных малыми (сублетальными) дозами радиации. Тез. докл. Всесоюз. конф. "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской АЭС", 30 окт.-1 ноября 1991 г., Минск, 1991, с. 63.

2. Моссэ И. Б. Проблема химической защиты в радиационной генетике. Минск. Наука и техника, 1974. - 152 с.

3. Моссэ И.Б., Лях И.П., Плотникова С.И., Кострова Л.Н. К вопросу о профилактике отдаленных последствий облучения. Тез. докл. IV Всесоюз. конф. "Химия, фармакология и механизмы действия противолучевых средств". М., 23-25 окт. 1990 г. М., 1990, с. 45-47.

4. Абдуль Ю. А. с соавт. Современная система противорадиационной медицинской защиты участников ликвидации последствий крупномасштабных радиационных аварий. В сб.: Военная медицина. Проблемы профилактики, диагностики, лечения экстремальных состояний. М.: ВИ, 1994, с.76-85.

5. Тиунов Л.А., Васильев Г.А., Вальдштейн Э.А. Противолучевые средства. М. -Л.: Наука, 1964, с. 38-40.

6. Алексеенко К.К. Влияние витамина C на показатели периферической крови при проведении лучевой терапии рака молочной железы. Тез. докл. IX Всесоюз. науч. конф. "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях", Л., окт. 1986 г. Л., 1986, с. 166-167.

7. Umegaki К., Ikon Т., Ichikawa T. Effect of vitamin E on chromosomal damage in bone marrow cells of mice having received low dose of x-ray irradiation/Int.J.Vitamin and Nutrition Research, 1994, v.64, N 4, p. 249-252.

8. Eldor A., Vlodavsky I., Riklis E., Fuks Z. Recovery of prostacyclin capacity of irradiated endothelial cells and the protective effects of vitamin C/Prostaglandins, 1987, v.34, N 2, p.241-255.

9. Srinivasan V. , Weiss J.F. Radioprotection by vitamin E: injectable vitamin E administered alone or with WR-3689 enhances survival of irradiated mice/Int.J.Radiat. Oncology.Biol., Phys., 1992, v.23, N 4, p.841-845.

10. Алиев А. А. Антимутагенные свойства некоторых витаминов в условиях индукции аберраций хромосом ионизирующим излучением. ВИНИТИ, 15.07.83, N 3969 - 83 Дуп (цит. по РЖ Радиобиология, 1983, N 10, 10.70.56ДЕП, с.9).

11. Машковский М.Д. Ретинол. Витамин A. Лекарственные средства. T.2. Харьков, "Торсинг", 1997, с.70-72.

12. Minnunni М., Wolfeb U., Mueller O. a.an. Natural antioxidants as inhibitors of oxygen species induced mutagencity //Mutat.Res. Fund. and Mol. Mutagen., 1992, v.269, N 2, p. 193-200.

13. Щербакова И. В. Клиническое значение состояния системы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты у больных инфильтративным туберкулезом легких//Сборник рефератов НИР и ОКР, Сер. 8, ч.1, 1993, N 1-2, с. 204.

14. Ковалев Ю.В., Кондаков B.С. О комбинированном применении антиоксидантов в клинике неврозов//Бюл.экспер.биол. и мед., 1994, т. 117, N 2, с. 209.

15. Машковский М. Д. Лекарственные средства. T. 2. Харьков, "Торсинг", 1997, 590 с.

16. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М., АстраФармСервис, 1995, 1168 с.

17. Ford C. E. , Hamerton J. L. Chromosomes of five rodent species //Nature. - 1956. - Vol. 31. - P. 247-254.

18. Малашенко А. М. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (мет. указания). М., 1977, 12 с.

19. Орлов В.П., Г.А.Чудиновская, Е.П.Крюкова. Исследование хромосомных наборов млекопитающих. Мет. руководство. М.: Наука, 1976, 15 с.

20. Evans E. P., Brecon G., Ford C.C. An air drying method for meiotic preparations from mammalian tests.-Cytogenetics, 1964., vol.2, p.289-294.

21. Андрусенко М.П., Дикая В.И., Жаркова Н.Б., Кострикина И.Е. Использование антиоксидантов для коррекции побочных двигательных эффектов психофармакотерапии//Бюл.экспер. биол. и мед., 1994, т.117, N 2, с.199-200.

22. Яковлева О.Б., Пятницкий А.Н. Роль α-токоферола в лечении побочных эффектов антидепрессивной терапии больных старческого возраста//Бюл.экспер. биол. и мед., 1994, т.117, N 2, с.224.

23. Машковский М.Д. Токоферола ацетат. Лекарственные средства. Т. 2, с. 95-96.

24. Машковский М.Д. Кислота аскорбиновая. Витамин C. Лекарственные средства. Т. 2, с. 88-89.9

Изобретение относится к медицине, а именно к радиологии. Изобретение заключается в том, что радиозащитное средство включает витамины Е и С в дозах соответственно 10 и 20 мг/кг. Изобретение обеспечивает изыскание лекарственного средства для защиты организма от облучения малыми (нелетальными) дозами радиации, обладающего рядом важных в практическом отношении свойств, в частности универсальным характером радиозащитного эффекта, низкой токсичностью эффективностью при пероральном применении. 2 табл.

Лечебно-профилактическое средство для защиты организма от низкодозовых радиационных воздействий, включающее витамин Е в количестве 10 мг/кг и витамин С в количестве 20 мг/кг.