СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биологической медицины и экологии и может быть использовано для мониторинга генотоксического эффекта низких доз радиации и химических загрязнителей, находящихся в окружающей среде.

Как правило, живые организмы в естественных и производственных условиях подвергаются действию целого ряда повреждающих факторов окружающей среды. Наиболее опасными и часто встречающимися среди них являются радиационный и химический. Настоящее исследование посвящено выявлению таких сочетанных поражений. Определение их генотоксического эффекта имеет большое значение для характеристики водоемов в плане оценки их пригодности для использования в качестве источника водозабора и других народнохозяйственных потребностей, а также для формирования степени риска отдельных групп населения и прогнозирования отдаленных последствий, как например, увеличение частоты опухолеобразования или сокращение продолжительности жизни.

В настоящее время для оценки генотоксичности факторов окружающей среды, что находит выражение в виде мутагенных, канцерогенных или тератогенных отдаленных эффектов, чаще всего используется способ определения частоты хромосомных аберраций лимфоцитов.

Способ состоит в том, что в пенициллиновый флакон стерильно вводится 1,6 мл среды Игла, 0,4 мл сыворотки крупного рогатого скота, фитогемагглютинин, разведенный в соотношении 1:5 стерильной дистиллированной водой (0,01-0,03 мл на 1 инкубационной среды), по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина и 0,2 мл цельной периферической крови.

После осторожного перемешивания крови со средой флаконы помещаются в термостат для культивирования при 37^oC в течение 67-69 ч до введения в культуру колхицина (0,02-0,05 мкг/мл), затем инкубация продолжается еще 3 ч.

После окончания инкубации клетки крови, растущие пластом по дну пенициллиновых флаконов, легким взбалтыванием переводятся в клеточную суспензию, которую переливают в центрифужные пробирки. Остатки слоя клеток на дне флаконов снимают подогретым до 37^oC уравновешенным солевым раствором Хенкса легким пипетированием и переливают в те же центрифужные пробирки. Затем клеточную суспензию в течение 6 мин центрифугируют при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 5 мл теплого раствора Хенкса и сразу центрифугируют. Надосадочную жидкость вновь сливают, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,55%-ного раствора KCL, подогретого до 37^oC. Пробирки с клеточной суспензией в этом растворе помещают в термостат на 10-20 мин. После этого суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, оставив над осадком примерно 1,0 мл раствора, к которому приливают 8-10 капель охлажденного до 4^oC метилового фиксатора (3 ч.) метилового спирта и 1 ч. ледяной уксусной кислоты). В этом растворе осадок ресуспендируют и по стенке пробирок осторожно добавляют по 3 мл фиксатора. Пробирки закрывают пробками и ставят в холодильник на 40-60 мин. После этого клеточную суспензию перемешивают с верхним слоем фиксатора и выдерживают еще 10 мин в холодильнике. Суспензию вновь центрифугируют и клетки выдерживают в новых порциях фиксатора (по 3 мл) несколько раз по 10 мин в ресуспендированном состоянии в холодильнике с последующим центрифугированием до тех пор, пока осадок не станет белым. Перед изготовлением препаратов суспензию клеток в фиксаторе центрифугируют, удаляют надосадочный фиксатор, а осадок тщательно ресуспендируют в 0,5-1,0 мл свежего фиксатора.

Из клеточной суспензии каждого флакона 0,1-0,2 мл раскапывают на предметные стекла и высушивают на воздухе. Дифференциальную окраску сестринских хроматид в метафазных пластинках проводят путем добавки бромдезоксиуридина в концентрации 5-10 мкг/мл в культуру лимфоцитов крысы за 26 ч до фиксации. Препараты на следующие сутки после приготовления помещают на 20 мин в водный раствор акридина оранжевого (3 мкг/мл), промывают проточной водой, высушивают, покрывают тонким слоем 0,07 М раствора Na₂HPO₄ и облучают 90 мин бактерицидной лампой ДБ-30 на расстоянии 30 см. После облучения препараты промывают проточной водой, подсушивают, помещают на 20 мин в насыщенный раствор гидроокиси бария, вновь тщательно промывают проточной водой, высушивают и окрашивают профильтрованным 20%-ным раствором краски Романовского-Гимза на фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 20 мин.

Метафазы фотографируют с помощью микроскопа МБИ-6 (об. 90х1.30, ок. 10х) на пленку микрат-30 и подвергают статистическому анализу. Изменения в хромосомном наборе, т. е. аберрации числа хромосом, дают возможность судить о генотоксическом действии радиационных и химических факторов окружающей среды. Способ позволяет определить генотоксические эффекты физико-химических повреждающих агентов в низких дозах. Однако этот метод трудоемок, длителен, требует относительно большого количества материала анализа, что практически исключают возможность длительных индивидуальных наблюдений за изменением в хромосомах под влиянием изменяющихся параметров воздействующих факторов окружающей среды у мелких лабораторных животных. Вместе с тем, имеющиеся в литературе сведения по микрометоду культивирования лимфоцитов периферической крови мелких лабораторных животных трудновоспроизводимы и не всегда дают удовлетворительные результаты.

Наиболее близким к предлагаемому является микроядерный тест.

Способ заключается в том, что проба крови объемом 0,2 мл стерильно переносится во флакон, содержащий 2,0 мл среды 199 и 0,80 мл эмбриональной бычьей сыворотки, 0,1 мл раствора фитогемагглютинина и 0,1 мл раствора, содержащего 100 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина. Пробу инкубируют в стерильных условиях 72 ч, затем центрифугируют в течение 8 мин при 1000 об/мин. Осажденные клетки ресуспендируют и добавляют к ним 5-7 мл раствора 0,75 М KCL (4-10^oC). Через 4 мин добавляют по каплям 0,2 мл фиксатора (метанол-ледяная уксусная кислота), перемешивают и вновь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 8 мин. К ресуспендированному осадку по каплям добавляют 3-5 мл холодного фиксатора (приготовленного ex tempore из метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Пробы выдерживают при 4^oC 10-20 мин и центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин. Процедуру повторяют дважды, а затем ресуспендируют клетки в 0,3-0,5 мл свежего фиксатора. Затем клетки раскапывают на охлажденные влажные стекла и высушивают при 40-60^oC. Препараты окрашивают по Гимза. Микроядра анализируют только в живых клетках с хорошо сохранной цитоплазмой. Подсчитывают 1000 клеток в препарате при увеличении 900. Клетки, в которых трудно выделить основное ядро, анализу не подвергают. В каждой лаборатории должна быть построена своя калибровочная кривая. По увеличению более, чем в 2 раза числа клеток с микроядрами на 1000, по сравнению с контролем, диагностируют генотоксический эффект.

Способ позволяет определить радиационные воздействия в дозах 10-25 сГр, а также генотоксический эффект солей тяжелых металлов.

Основными недостатками метода являются: сравнительно большой объем крови, требующийся для анализа (0,2 мл), что не всегда возможно у мелких лабораторных животных, трудоемкость и длительное время определения и расчета показателя (более суток), что не позволяет использовать этот метод для экспрессного мониторинга генотоксического эффекта, вызываемого отдельными факторами окружающей среды или их сочетаниями.

Технический результат настоящего изобретения состоит в сокращении времени оценки генотоксического эффекта радиационно-химических воздействий и уменьшении количества биологического материала, необходимого для его осуществления.

Этот результат достигается тем, что в известном способе выявления генотоксического эффекта радиационно-химического воздействия путем исследования периферической крови живых организмов, согласно изобретению, кровь обрабатывают лизирующей смесью до получения нуклеоидов, определяют ее фоновую флуоресценцию при λ_в= 350 и λ_фл= 450 нм, затем окрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом и вновь определяют ее флуоресценцию, после чего добавляют к ней раствор ДНК в концентрации 5-10 мкг/ мл и снова определяют флуоресценцию, а затем рассчитывают концентрацию ДНК нуклеоидов на 1 лейкоцит исследуемой пробы крови по формуле

где
ИФ_о интенсивность фоновой флуоресценции нуклеоидов;
ИФ₁ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после их окрашивания
ИФ₂ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после добавления раствора ДНК;
K коэффициент, учитывающий разбавление нуклеоидов и ДНК;
L число лейкоцитов в 1 мл пробы
и при снижении ее концентрации в сравнении с таковой у интактных организмов не менее, чем на 30% устанавливают генотоксичность радиационно-химического воздействия.

Целесообразно в качестве лизирующей смеси использовать раствор, содержащий 2,0 M хлористый натрий, 0,1 M трилон Б, 0,1 М трис, 0,5% тритон Х-1000 при pH 7,8-8,2.

Осуществление лизиса пробы крови до получения нуклеоидов с помощью данной смеси позволяет получить ДНК крови в компактном суперспирализованном состоянии, близком к естественному, но лишенном белковых, липидных и других экранирующих полинуклеотид связей. ДНК в виде нуклеоида, с одной стороны, практически беспрепятственно доступна для взаимодействия с флуоресцентными красителями, а, с другой стороны, дает возможность манипулировать с микрообъемами анализируемого материала.

Получение ДНК в виде нуклеоида таким образом позволило проводить ее флуориметрическое определение непосредственно в лизате крови, т.е. практически экспрессно. Для определения концентрации ДНК в клетке разработана формула

где
ИФ₀ интенсивность фоновой флуоресценции нуклеоидов;
ИФ₁ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после их окрашивания;
ИФ₂ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после добавления раствора ДНК;
K коэффициент, учитывающий разбавление нуклеоидов и ДНК;
L число лейкоцитов в 1 мл крови, определяемое в камере Горяева.

При этом определение флуоресценции осуществляют при λ_в= 350±2 и λ_фл= 450±2 нм, поскольку эти длины волн соответствуют максимумам возбуждения и флуоресценции 4',6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ).

Использование этого соединения в качестве красителя дает возможность определить искомую величину концентрацию ДНК крови, как показано с наименьшей погрешностью.

Добавление раствора стандартной ДНК в измеряемую пробу связано с необходимостью учета примесей, обусловливающих гашение флуоресценции красителя в комплексе с ДНК в каждой из определяемых проб. Как показано для этого достаточным количеством является 0,02 мл раствора ДНК в концентрации 5-10 мкг/мл.

Как показали проведенные эксперименты, гамма-облучение в дозе 50 сГр приводит примерно к 25% снижению концентрации ДНК в лейкоцитах крови. Введение ионов свинца с питьевой водой в концентрации 100 мкг/мл (ПДК) незначительно изменяет величину определяемого показателя. Однако при сочетании воздействии радиации и ионов свинца имеет место более, чем 30% снижение измеряемой величины уже при гамма-воздействии в дозе 25 сГр. Так как снижение концентрации ДНК на 25-28% вызывалось "чистым" облучением в дозе, допустимой для примененной в эксперименте модели (при экстраполяции с человека), то это позволило определить 30% снижение, как критерий значимости генотоксического эффекта радиационно-химического воздействия.

Сущность способа заключается в следующем.

Проба крови организма, подвергшегося подвергающим воздействиям окружающей среды в виде радиационного, химического или сочетанного воздействия, обрабатывают лизирующей смесью в течение 3-5 мин, окрашивают ДАФИ, добавляют раствор стандартной ДНК, определяя на каждом из этих этапов ее свечение при λ_в= 350 и λ_фл= 450 нм. Одновременно определяют число лейкоцитов в 1 ил той же пробы крови. Затем по формуле I рассчитывают концентрацию ДНК на 1 лейкоцит исследуемой крови и в зависимости от степени снижения ее величины делают заключение о наличии или отсутствии генотоксического эффекта.

Пример. Предельно допустимая доза облучения для человека 25 сГр, предельно допустимая концентрация свинца в воде 1000 мкг/л. В связи с этим было проведено однократное равномерное гамма-облучение крыс-самок массой 180-200 г в дозах 25 и 50 сГр (поскольку известно, что крыса примерно в 2 раза радиорезистентнее человека, была использована и двойная доза облучения) на установке "ИГУР-1" (137 Cs мощность дозы 1,9 Гр/мин) через месяц после введения PbCl₂ с питьевой водой в концентрации 100 мкг/л и без введения свинца. Пробы крови отбирали из хвостовой вены животных для подсчета числа лейкоцитов стандартным способом и определения концентрации ДНК, как предлагается в настоящем описании. Для этого 0,01 мл цельной крови обрабатывали 10-кратным количеством (0,1 мл) лизирующей смеси, содержащей 0,1 М Трилона Б, 2,0 М хлористого натрия, 0,01 М триса, 0,5% тритона Х-100, pH 7,8-8,2, в течение 3-5 мин до просветления. После этого определяли в пробе концентрацию ДНК флуориметрическим способом с помощью ДАФИ. Для этого к 1 мл буферного раствора 0,01 М трис; 0,01 М Трилон Б; 0,1 М хлористый натрия, pH 7,0-7,2) добавляли 0,05 мл лизированной пробы и измеряли интенсивность ее флуоресценции (ИФ₀ при λ_в= 350±2 и λ_фл= 450±2 нм. Затем в пробу добавляли ДАФИ (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и измеряли интенсивность флуоресценции ИФ₁, после чего к измеряемому образцу добавляли раствор ДНК с известной концентрацией (8,15 мкг/мл) и снова измеряли флуоресценцию пробы ИФ₂. Общее время измерения 5 10 мин. Искомую концентрацию в анализируемом образце рассчитывали по формуле (I). Результаты оценки генотоксических эффектов сочетанного радиационно-химического воздействия в разных дозах, в сопоставлении с контролем, а также с "чистым" облучением и химическим воздействием на геном лейкоцитов крыс приведены в таблице.

Как следует из данных таблица, при облучении крыс в дозе 50 сГр имеет место незначительное уменьшение измеряемой величины (на 23 28%). Введение только ионов свинца мало изменяет содержание ДНК в лейкоцитах, однако сочетанное воздействие PbCl₂ и гамма-облучения не только в дозе 50 сГр, но и в дозе 25 сГр вызывает снижение концентрации ДНК лейкоцитов более, чем на 30% Это свидетельствует об усилении генотоксического эффекта радиации ионами свинца, что имеет место в повседневной жизни. Наблюдение за выживаемостью этих животных показало, что при комбинированном воздействии имеет место 2-кратное сокращение продолжительности жизни, по сравнению с контролем.

Представленные результаты о синергическом действии двух вышеназванных факторов согласуются и известными данными других авторов, которые изучали генотоксические эффекты ионов свинца и рентгеновского облучения с помощью микроядерного теста прототип в опытах in vitro.

Таким образом, предлагаемый способ, как видно из приведенного примера, требует для осуществления 5-10 мин с использованием 0,01-0,02 мл крови, т.е. практически является экспрессным. Так как подобных методов для серийного определения генотоксичности в настоящее время не существует, предлагаемый может быть широко использоваться для этой цели.

Способ по сравнению с известными имеет ряд существенных преимуществ.

1. Способ позволяет значительно уменьшить материалоемкость для осуществления анализа крови в 10 20 раз в сравнении с прототипом;
2. Значительно сокращается время выполнения процедуры до 5 10 ми в то время как известные методы и прототип требует не менее суток, что может быть решающим в случае чрезвычайных ситуаций;
3. Способ значительно проще всего известных и требует только флуориметра, который может быть портативным.

Способ разработан в лаборатории биотестирования токсических факторов окружающей среды ЦНИРРИ Минздравмедпрома РФ на моделях с предельно допустимыми дозами облучения и ПДК вредных химических веществ. Метод был апробирован на ряде водоемов Ленинградской области.

Способ определения генотоксического эффекта радиационно-химических воздействий относится к области биологической медицины и экологии и может быть использован для мониторинга генотоксического эффекта низких доз радиации и химических загрязнителей, находящихся в окружающей среде. Способ заключается в том, что кровь обрабатывают лизирующей смесью до получения нуклеоидов, определяют ее фоновую флуоресценцию при λ_в= 350 и λ_фл= 450 нм затем, окрашивают 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом и вновь определяют ее флуоресценцию, после чего добавляют к ней раствор ДНК в концентрации 5 - 10 мкг/мл и снова определяют флуоресценцию, а затем рассчитывают концентрацию ДНК нуклеоидов на 1 лейкоцит исследуемой пробы крови по формуле

где ИФ₀ - интенсивность фоновой флуоресценции нуклеотидов, ИФ₁ - интенсивность флуоресценции нуклеоидов после их окрашивания, ИФ₂ - интенсивность флуоресценции нуклеоидов после добавления раствора ДНК; К - коэффициент, учитывающий разбавление нуклеоидов и ДНК; L - число лейкоцитов в 1 мл пробы и при снижении ее концентрации в сравнении с таковой у интактных организмов не менее, чем на 30% устанавливают генотоксичность радиационно-химического воздействия. В качестве лизирующей смеси используют раствор, содержащий 2,0 М хлористый натрий, 0,1 М трилон Б, 0,01 М трис, 0,5% тритон Х-100 при рН 7,8 - 8,2. В отличие от известных методов предлагаемый способ позволяет снизить материалоемкость анализа в 10 - 20 раз и сократить время определения показателя до 5 - 10 мин, что делает его практически экспрессным. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ выявления генотоксического эффекта радиационно-химического воздействия путем исследования периферической крови живых организмов, отличающийся тем, что кровь обрабатывают лизирующей смесью до получения нуклеоидов, определяют ее фоновую флуоресценцию при λ_в= 350 и λ_фл= 450 нм, затем окрашивают 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом и вновь определяют ее флуоресценцию, после чего добавляют к ней раствор ДНК в концентрации 5 10 мкг/мл и снова определяют флуоресценцию, а затем рассчитывают концентрацию ДНК нуклеоидов на 1 лейкоцит исследуемой пробы крови по формуле

где ИФ₀ интенсивность фоновой флуоресценции нуклеоидов;
ИФ₁ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после их окрашивания;
ИФ₂ интенсивность флуоресценции нуклеоидов после добавления раствора ДНК;
K коэффициент, учитывающий разбавление нуклеоидов и ДНК число лейкоцитов в 1 мл пробы,
и при снижении ее концентрации в сравнении с таковой у интактных организмов не менее чем на 30% устанавливают генотоксичность радиационно-химического воздействия. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве лизирующей смеси используют раствор, содержащий 2,0 М хлористый натрий, 0,1 М трилон Б, 0,01 М трис, 0,5% тритон Х-100 при pH 7,8 8,2.