СПОСОБ КОМПЛЕКСНОГО БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДЫ, ПОЧВЫ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ФИТОТЕСТАХ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/18 G01N33/24 G01N33/15 

Изобретение относится к области использования растительных объектов для контроля загрязнения окружающей среды. Может найти применение в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод, почв, а также в фармакологии при оценке безопасности биологически активных веществ.

Известны методы биотестирования на одноклеточных и многоклеточных организмах, в которых применяются визуальный контроль или дорогостоящая специальная измерительная техника [1, 2]. Эти методы не предусматривают учет генетических нарушений.

Известен способ биотестирования, основанный на использовании семян редиса, который также не выявляет генетических нарушений и характер органообразовательного процесса [3].

Известны методы цитогенетического анализа, основанные на использовании семян культурных растений [4] (прототип). Из методов цитогенетического анализа наиболее близким аналогом является метод оценки на семенах лука Allium сера. Недостатком метода является использование внешне однородных семян растения, однако это не гарантирует одинаковую реакцию проростков на изучаемый фактор. Кроме того, данным методом можно определить действие высоких концентраций мутагенов, но учет предмутационных (структурно-метаболических) событий, вызываемых слабыми концентрациями мутагенов, не предусмотрен.

Недостатком вышеуказанных способов является отсутствие комплексной оценки, которая интегрировала бы клеточные и организменные нарушения и прогнозировала эффекты последействия на популяционном уровне.

Изобретением решается задача повышения объективности оценки токсичных, мутагенных факторов за счет учета структурно-метаболических изменений, составляющих основу эффектов последействия.

Способ оценки включает анализ цитогенетических, структурно-метаболических, морфофизиологических нарушений на растительных объектах. Для контроля за структурно-метаболическим состоянием клетки используются показатели: количество клеток с тремя и более ядрышками в ядре, длительность мацерации корешков луковиц А. сера. При интегрированной оценке нарушений могут быть прогнозированы эффекты последействия фактора.

Используют здоровые, не подвергавшиеся токсическим воздействиям луковицы растений А. сера. В процессе тестирования учитывают длительность мацерации при приготовлении цитологического препарата, количество ядрышек в ядрах клеток меристематических тканей, а также определяют митотическую активность ткани и нарушения митоза в анафазе.

Для осуществления морфофизиологической оценки состояния проростков используют семена растений, не произрастающих на загрязненной территории (не адаптированных к загрязнителям). В процессе тестирования определяют вес растений. Учитывают количество непроросших семян, растений с аномалиями развития. Как чувствительный тест используют фасоль Phaseolus vulgaris.

1. Цитогенетическая оценка и выявление структурно-метаболических нарушений.

Исследуют повреждения митотических хромосом и нарушения митоза. В качестве объекта используют лук А. сера. Луковицы проращивают в исследуемом растворе до достижения длины корешков 6-10 мм при температуре 18-20°С, фиксируют уксусным алкоголем, помещают в холодильник (+5°С) на 4 часа. Затем корешки отмывают дистиллированной водой несколько раз. Перед окрашиванием проводят мацерацию 10%-ным раствором соляной кислоты. Время мацерации определяют эмпирически от 2 до 5 минут. Корешки, готовые к окрашиванию, легко разрываются при надавливании препаровальной иглой. Время мацерации записывают в журнал с указанием минут и секунд. Для окраски корни помещают в ацетокармин, доводят до кипения. Корешки после окрашивания переносят на предметное стекло, отступают от чехлика корешка 4-5 мм и отделяют зону деления, наносят каплю 45%-ной уксусной кислоты, прижимают покровным стеклом. Если время для мацерации в растворе соляной кислоты было достаточным, то под микроскопом видна однослойная ткань и клетки в митозе. Если корешки при надавливании не образуют однослойную ткань, а видны волокна ткани, то следует изготовить препарат с увеличением времени мацерации. Митоз можно наблюдать при увеличении объектива ×40 и окуляра ×10 или ×15. Подсчитывают количество клеток в митозе, количество клеток с нарушениями (в анафазе), количество клеток с ядрами, содержащими три и более ядрышек.

Определяют частоту мутаций в %, отношением числа аберрантных клеток к общему числу изученных клеток. Митотическую активность ткани, количество клеток с ядрами, содержащими три и более ядрышек, определяют в промилле (‰).

Исследуют не менее 5 полей зрения для определения митотического индекса (1000 клеток) на каждом препарате.

Митотический индекс определяют как отношение клеток в митозе к общему количеству клеток в поле зрения:

Среднее значение показателя определяют по пяти значениям митотического индекса.

Оценочная шкала:

1. Если относительно контроля митотический индекс снижен в два раза, - это означает, что раствор обладает достоверным ингибирующим эффектом; если митотический индекс относительно контроля ниже 80% и более, то наблюдается тенденция к ингибированию митотического деления. Тенденция к стимулированию митотического деления определяется с показателя 120% к контролю, превышение В два раза - явный стимулирующий эффект.

2. Исследуемый раствор не является индуктором хромосомных нарушений, если в 1000 анафазных клеток не обнаружены нарушения типа отставаний хромосом, мостов, фрагментов.

3. Любое увеличение количества клеток с ядрами, где обнаруживается три и более ядрышек, свидетельствует о повышении синтетической активности в клетках, расценивается как состояние метаболического стресса.

4. Если время мацерации в опыте отличается от времени мацерации в контроле, то это означает, что под действием изучаемого фактора нарушился транскорневой потенциал, изменились структура и функция клеточных мембран. Если время мацерации увеличилось, то происходит накопление токсинов в клеточной оболочке, если время мацерации сократилось, то токсины легко проникают через клеточную мембрану и могут оказать повреждающий эффект на поздних этапах онтогенеза.

2. Морфофизиологическая оценка и интегрирование результатов для прогнозирования эффектов последействия на популяционном уровне

Используется стерильная посуда. Чашки Петри стерилизуют сухим паром при температуре 110°С в течение 60 минут. Предварительно внутрь чашек помещают фильтровальную бумагу, а сами чашки оборачивают термостойкой оберточной бумагой. Перед началом тестирования необходимо семена Р. vulgaris стерилизовать 40%-ным раствором этилового спирта в течение 2 минут, отмыть от стерилизующего раствора стерильной дистиллированной водой. 120 семян (по 20 семян на чашку) фасоли проращивают на фильтровальной бумаге при t=22-25°С в чашках Петри до появления семядольных листьев. По мере набухания семян и появления проростков необходимо доливать исследуемый раствор. Подсчитывают количество проросших семян, определяют всхожесть в %.

Затем переносят растения в растильни, где продолжают полив качественной питьевой водой. Осмотр растений проводят каждые сутки и фиксируют аномалии развития: изменения формы и расположения листовых пластинок, нарушения жилкования, пигментации, некротические образования. После того как больше половины растений в контроле сформируют третий лист (не считая семядольных), по весу на 100 растений определяют признаки соматической стимуляции и ингибирования.

Во всех вычислениях контроль берут за 100%, в том числе и спонтанные изменения, наблюдаемые в контроле. Замечено, что при действии солей металлов (при микроэлементном загрязнении) может незначительно повыситься всхожесть семян. Этот эффект можно отнести к эффектам стимуляции. Однако позже проростки могут погибнуть или сформировать слабые вегетативные органы. Всхожесть семян определяют отношением числа проростков длиной стебля от 5 мм к числу проращиваемых семян в %.

Оценочная шкала:

1. Если относительно контроля показатели всхожести, массы 100 растений ниже 80% и более, то наблюдается тенденция к ингибированию роста и развития; если те же показатели снижены в два раза, то раствор обладает достоверным ингибирующим аффектом. Тенденция к стимулированию определяется с показателя 120% к контролю, превышение в два раза - явный стимулирующий эффект.

2. Прогнозирование способности вещества к последействию проводят по частоте морфофизиологических аномалий, мутаций, структурно-метаболических нарушений в клетках. Превышение частоты морфозов или аберрантных клеток в 2 раза относительно спонтанного фона, а также одновременное проявление любой степени изменчивости митотической активности, превышения количества ядрышек в ядрах клеток, изменения длительности мацерации, сообщает о достоверной индукции нарушений тканеобразовательного и органообразовательного процессов и свидетельствует о способности веществ вызывать эффекты последействия в популяциях растений.

3. Если при цитогенетическом анализе не выявляются индукции аберрантных клеток, клеток, содержащих ядра с тремя и более ядрышками, не изменяется длительность мацерации корешков относительно контроля, то изменения морфофизиологических признаков и митотической активности ткани нужно отнести к несущественным, следовательно, данный фактор не может вызвать эффекты последействия в популяции растений.

4. При определении зависимостей доза-эффект необходимо учитывать, что доза мутагена может быть так мала, что не вызывает превышения частоты аберрантных клеток относительно фона. При этом причиной морфозов могут быть нарушения в ферментной системе и мембранном аппарате клетки (структурно-метаболические нарушения), вызванные исследуемым фактором. Такие нарушения могут привести к изменению качества популяции.

Пример

1. Анализ цитогенетического состояния (табл.1)

1. Образец сточных вод ОГПК вызывает тенденцию к стимулированию митоза, не индуцирует хромосомные и митотические нарушения, повышает метаболическую активность клеток, истончает клеточную стенку и ослабляет межклеточные связи.

2. Ил с ЕСР ингибирует митоз, не индуцирует хромосомные и митотические нарушения, повышает метаболическую активность клеток, истончает клеточную стенку и ослабляет межклеточные связи.

3. Водная вытяжка почвы ЗПО стимулирует митоз, не вызывает хромосомных нарушений, индуцирует повышение метаболической активности, уплотняет клеточную оболочку и вызывает огрубление ткани.

По последним показателям делаем заключение о метаболическом стрессе клеток и структурно-функциональных повреждениях клеточной мембраны.

2. Анализ морфофизиологического состояния (табл.2)

1. Образец сточных вод, ОГПК снижает всхожесть семян в пределах биологической нормы реакции, проявляет тенденцию к стимулированию развития вегетативной массы растений, индуцирует морфозы.

2. Ил ЕСР проявляет тенденцию к ингибированию всхожести семян и вегетативного развития растений, индуцирует морфозы.

3. Водные вытяжки почв снижают всхожесть семян в пределах биологической нормы реакции, проявляют тенденцию к стимулированию развития вегетативной массы растений, индуцируют морфозы.

3. Прогнозирование эффектов последействия (табл.3)

В тест-объекте А. сера во всех вариантах проявляются признаки структурно-метаболических изменений (увеличивается количество ядрышек, что свидетельствует о повышении синтетических процессов; изменяется реакция клеточных оболочек и характер гидролиза межклеточного вещества при мацерации), кроме того, изменяется интенсивность митоза, следовательно, возникнут изменения и в тканеобразовательном процессе и органогенезе.

Эти события происходят за счет изменения химии и структуры мембран, нарушения транспорного и обменного потенциала клеток.

В тест-объекте Р. vulgaris индуцируются морфозы, что представляет факт реального изменения характера органогенеза под действием изучаемых агентов среды. Нарушения типа морфозов могут восприниматься как фенотипическое воплощение сбоя в генетических программах пространственной организации органов, а также как результат наследуемой клеточной летальности, которая начинает проявляться в стимулирующих дозах. Стимулирующими эффектами на формирование вегетативной части растений обладают мутагены, представленные в слабых концентрациях. Действие слабых доз мутагенов не вызывает хромосомные аберрации, их первичное действие связано с деструктивными процессами в молекулах липидов, белков мембраны и цитоплазмы.

Отсюда делаем заключение о том, что исследуемые растворы биологически активны, изменяя биологическую конституцию растений, способны индуцировать отдаленные эффекты на популяционном уровне.

Источники информации

1. РД 118-02-90 «Методическое руководство по биотестированию воды», М., Госкомприрода, 191, 26 с.

2. Патент РФ №97118211/13 6С12М от 31.10.97 г.

3. Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения. СанПиН 2.1.7.573-96. - М.: Инф. - изд. центр Минздрава России, 1997. - 54 с.

4. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1988. С.145-149. (прототип).

Пример

Таблица 1Анализ цитогенетичесвюго состояния на А. сераВариантМитотический индекс, ‰Митотический индерсс к контролю, %Частота аберраций к контролю, %Количество клеток с тремя и более ядрышками, ‰Количество клеток с тремя и более ядрышками к контролю, %Время мацерацииВремя мацерации к контролю, %Контроль80100нет210031001. Образец сточных вод ОГПК* (ЕСР**)132165нет147002662. Ил с ЕСР4860нет2613002663. Водная вытяжка образца почвы ЗПО***160200нет3417004200* Оренбургский газоперерабатывающий комплекс;* *Емкость сезонного регулирования; *** Земледельческие поля орошения. Жирным шрифтом обозначены анализируемые показатели

Изобретение относится к области использования растительных объектов для контроля загрязнения окружающей среды. Может найти применение в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод, почв, а также в фармакологии при оценке безопасности биологически активных веществ. Способ заключается в комплексной оценке цитогенетических, структурно-метаболических и морфофизиологических нарушений, наблюдаемых в фитотестах. Цитогенетические и структурно-метаболические нарушения выявляют у луковиц Allium сера, при этом показателями цитогенетических нарушений служат увеличение частоты аберрантных клеток и изменение митотического индекса, показателями структурно-метаболических нарушений - увеличение клеток с тремя и более ядрышками в ядре и изменение длительности мацерации корешков луковиц. Морфофизиологические нарушения выявляют у Phaseolus vulgaris, при этом показателями морфофизиологических нарушений служат снижение всхожести семян, увеличение частоты морфозов и изменение зеленой массы растений. Способ позволяет объективно прогнозировать эффекты последействия фактора на популяционном уровне. 3 табл.

Способ комплексного биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ, предусматривающий выявление цитогенетических, структурно-метаболических и морфофизиологических нарушений в фитотестах, интеграцию полученных результатов, отличающийся тем, что цитогенетические и структурно-метаболические нарушения выявляют у луковиц Allium сера, при этом показателями цитогенетических нарушений служат увеличение частоты аберрантных клеток и изменение митотического индекса, показателями структурно-метаболических нарушений - увеличение клеток с тремя и более ядрышками в ядре и изменение длительности мацерации корешков луковиц, а морфофизиологические нарушения выявляют у Phaseolus vulgaris, при этом показателями морфофизиологических нарушений служат снижение всхожести семян, увеличение частоты морфозов и изменение зеленой массы растений, после интеграции полученных результатов прогнозируют эффекты последействий на популяционном уровне.