СПОСОБ КОРРЕКЦИИ БРОНХООБСТРУКТИВНОГО СИНДРОМА Российский патент 2002 года по МПК A61K9/127 A61K31/65 A61P11/06 

В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, способных контролировать проходимость бронхов и воздействовать на процессы воспаления в дыхательных путях при бронхообструктивном синдроме. Использование носителей для транспорта лекарств в области-мишени признано эффективным методом улучшения селективности и оптимизации действия препаратов (R.Lippens, 1995; I.Muzino et al., 1995; J.Mehta et al., 1995). Липосомы могут рассматриваться в качестве одного из наиболее перспективных носителей, обеспечивающих целенаправленный транспорт лекарственных веществ в клетку (Коровкин Б.Ф и др., 1983; Чучалин А.Г, 1990; Taylor K.M.G., Farr S.J., 1993).

Заключение бронхолитических средств в липосомальную форму позволяет максимально оптимизировать доставку бронхолитических препаратов, поскольку сопровождается увеличением продолжительности пребывания их в легких относительно свободных форм (M.Vidgren et al., 1995) с более выраженной бронходилатацией (Mc Calden Т.А., Radhakrishman R.А., 1991) и одновременным уменьшением проявлений типичной для β₂-агонистов тахикардии и других системных эффектов (Мс Calden T.A, Abra В., Minalko P., 1989).

Из уровня техники известен способ ингаляционного введения липосомальной формы фенотерола в дозе из расчета от 0,006 до 0,02 мкг/кг крысам с экспериментальной моделью БА (Архипенко И.В., 1996).

Однако в практической медицине для эффективного лечения БА нередко требуется назначение высоких доз препаратов с коротким интервалом введения - в среднем 3-6 часов, а для купирования острого приступа бронхиальной астмы интервал введения сокращается до 20 минут. В то же время повышение дозы β-агонистов лимитировано выраженными системными изменениями в виде тахикардии, тремора, гипокалиемии и гипоксемии (Авдеев С.Н., Чучалин А.Г., 1997; N. Saifakas, 1993). Обладая наиболее выраженным бронходилатирующим эффектом, β-агонисты не устраняют основную причину формирования бронхиальной обструкции - воспаление в дыхательных путях. Вследствие чего требуется применение ингаляционных и системных кортикостероидов. Использование последних даже после кратковременного назначения приводит к многим опасным осложнениям - психозам, кровотечениям из ЖКТ, задержке жидкости и натрия, гипокалиемии, острой стероидной миопатии (Dekhujzen P., 1994; Shee С., 1990; Williams Т. et al., 1988). Из литературы известно, что заключение фенотерола в липосомальную форму позволяет сочетать бронходилатирующее действие β-агонистов с противовоспалительным эффектом липосом (Архипенко И.В., 1996). В то же время в избранном нами прототипе противовоспалительное действие фенотерола в свободной и липосомальной формах оценивалось косвенно на основании морфологических изменений бронхиального дерева и состояния тучных клеток, активность которых не связана напрямую с воспалительным процессом, а в большей степени отражает тканевые механизмы нервной регуляции (Мотавкин П.А. с соавт., 1994). В то время как наиболее информативным маркером воспаления в дыхательных путях при БА в настоящее время признается оксид азота (NO) и активность NO-синтазы - фермента, ответственного за синтез NO (Barnes P.J., Kharitonov S.A., 1996).

Принимая во внимание выше сказанное, целью настоящего изобретения явилась разработка способа коррекции бронхообструктивного синдрома, позволяющего использовать максимально высокие дозы ингаляционного β-агониста - фенотерола в липосомальной форме с наиболее полным контролем его противовоспалительного и бронхолитического эффекта.

Оценку эффективности свободного и липосомального фенотерола проводили на адекватной модели бронхиальной астмы (БА) по Andersson P. (1980), созданной у белых нелинейных крыс-самцов. В качестве тест-объектов были выбраны бронхи, являющиеся точкой приложения цитокинов, повреждающих эпителиальный барьер; нитрооксидсинтаза легких (NOS), рассматриваемая как маркер активности воспалительного процесса при бронхиальной астме и тучные клетки - инициаторы воспалительной реакции при астматическом ответе.

Модель БА подтверждена морфологически. Эпителиальный пласт в мелких воздухоносных путях крыс был разрыхлен, утолщен, местами десквамирован. Отмечалась типичная гиперплазия бокаловидных клеток с наличием в просвете бронхов густого слизистого секрета. Наблюдался отек подслизистого слоя, его инфильтрация эозинофилами, лимфоцитами и плазматическими клетками. В мелких бронхах происходила гипертрофия мышечного слоя с сужением бронхиального просвета и его закрытием слизистыми пробками, смешанными с отпавшим эпителием. Перибронхиально в адвентиции бронхов располагались группами по 20-25 дегранулирующие тучные клетки с проникновением ряда из них в подслизистый слой и слизистую оболочку.

В зависимости от степени морфологических изменений бронхи разделили на несколько типов:
1. в просвете бронхов увеличено содержание секрета;
2. в просвете бронхов слизь, эозинофилы и опущенные эпителиальные клетки;
3. в просвете бронхов слизь, отек подслизистого слоя в бронхах с хрящевой основой, в слизистой мелких воздухоносных путей, сужение просвета бронха и очаговая отслойка эпителиальных клеток;
4. фестончатость и гофрированность эпителиальной выстилки бронхов, местами напоминающими ее отслоение, отсутствие просвета в бронхе за счет наличия слущенных эпителиоцитов и воспалительных клеток, гиперплазия гладких миоцитов.

В отличие от использованного прототипа нами было проведен точный расчет дозы ингалируемого вещества в определенных условиях с учетом его потерь и терапевтической эффективности. С помощью флюоресцеина было установлено, что ингаляционный объем составил за 10 минут 3,3 мл. После забоя животного удаленные легкие гомогенизировали. Объем гомогената доводили до 25 мл, после центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. В супернатанте определяли содержание флюоресцеина при 517 нм на спектрофлюриметре методом двойного сканирования (облучение 493 нм) с использованием калибровочной кривой флюоресцеина. Соответственно скорость получения одной крысой ингалированного раствора составляет 2,5 мкг/мин. В пересчете на концентрацию фенотерола в ингалируемом препарате 0,1 мг/мл его скорость составляет 0,25 мкг/мин. Проведенный расчет позволяет наиболее точно определять время ингаляции для введения необходимой дозы вещества.

Препараты вводили в дыхательные пути здоровых животных и крыс с БА в условиях, близким к физиологическим, с помощью ультразвукового ингалятора "Thomex L2", который соединяли с герметичной полиэтиленовой камерой с крысами. Использовали курсовое введение препарата. Фенотерол ингалировали в возрастающих концентрациях от 0,0035 до 0,105 мкг/л/мин в течение 30 минут, что соответствовало дозе от 1,6 до 49,5 мкг/кг один раз в сутки 5 дней подряд. Достижение максимальной разовой дозировки (49,5 мкг/кг) было возможно только при использовании липосомальной формы фенотерола. Максимальная разовая дозировка при введении свободной формы составила 9,9 мкг/кг. При ее увеличении наблюдались кардиотоксические и другие побочные эффекты. Применение препарата в дозировке меньшей 1,6 мкг/кг не оказывало терапевтического действия. В отличие от проведенных нами исследований в избранном прототипе токсичность фенотерола была проверена при его внутрибрюшинном введении мышам (Архипенко И. В. Экспериментальное исследование липосомальных форм фенотерола: Автореф. канд. дисс. Владивосток, 1996, с. 7). В нашей работе действие препарата изучено при ингаляционном традиционном способе его применения и с учетом его противовоспалительной активности.

Влияние свободного и липосомального фенотерола на активность NO-синтазы и подвижность бронхов при экспериментальной БА
Согласно современным представлениям о патогенезе бронхиальной астмы в основе формирования бронхиальной обструкции лежит хронический воспалительный процесс дыхательных путей, который определяет подходы к лечению болезни (Чучалин А. Г. , 1997). Исходя из вышеизложенной концепции в отличие от рекомендуемого прототипа в предложенном нами способе рассмотрено действие свободного и липосомального фенотерола при различном режиме дозирования под контролем активности нитрооксидсинтазы, фермента, участвующего в синтезе оксида азота (NO) - вещества, рассматриваемого в качестве маркера воспаления и эффективности противовоспалительной терапии при бронхиальной астме (Barnes P.J., Kharitonov S.A., 1996).

Как видно из данных, представленных в табл. 1, свободный фенотерол снижает синтез NO только в эпителиоцитах мелких бронхов, тогда как липосомальная форма препарата приводит к стабилизации активности фермента практических во всех элементах легкого, маркирующихся на NOS.

Одновременно с увеличением дозы липосомального фенотерола наряду с нарастанием бронхолитического эффекта препарата увеличивалось его противовоспалительное действие в виде снижения активности нитрооксидсинтазы.

При ингаляции обоих форм препарата наблюдается релаксация бронхов, более значимая при введении липосомальной формы β-агониста (0,71±0,032 против 0,62±0,024, Р<0,05) (табл. 2).

Детальный анализ показал, что введение β-агониста вызывало эффекты, зависимые от морфологического состояния эпителиальной выстилки (фиг. 1).

При ингаляции свободного фенотерола крупные бронхи практически не отличались от интактных животных, в мелких воздухоносных путях почти в два раза увеличилось количество свободно-проходимых бронхов и приблизительно в три раза уменьшилось число бронхов 4 типа (с резко суженным просветом). При лечении крыс с БА фенотеролом, инкапсулированным в липосомы, большинство крупных бронхов (91%) свободно проходимы. В сравнении с крысами, получившими свободный фенотерол, значительно увеличено количество неизмененных бронхов и уменьшено число бронхов с различной степенью изменений (фиг. 1).

Состояние активности NO-синтазы определяло двигательную реакцию бронхов на введение β-агониста (фиг. 2). Наиболее значимые показатели коэффициента релаксации наблюдались в бронхах с нормальным или незначительно повышенным уровнем фермента. В то время как в бронхах с высокой экспрессией энзима (21,4±0,52 у. е. ) и наиболее резкими морфологическими изменениями (4 тип) расширение просвета было незначительным (0,32±0,05, Р<0,05 по отношению к интактной группе животных) (фиг. 2).

Проведенный корреляционный анализ показал, что при ингаляции фенотерола между состоянием двигательной активности мелких бронхов и активностью NO-синтазы существует обратная корреляционная зависимость r = -0,92. Степень релаксации бронхов тем выше, чем состояние энзима ближе к показателям контрольной группы животных. Наиболее заметными темпами снижение активности NOS и соответственно увеличение степени релаксации бронхов происходило при воздействии липосомального фенотерола.

Итак, ингаляционное введение липосомального фенотерола крысам с экспериментальной БА способствует более интенсивному по сравнению со свободной формой препарата снижению уровня нитрооксидсинтазы в эпителиоцитах воспалительно измененных бронхов и клетках, участвующих в реализации раннего астматического ответа, заметному уменьшению признаков воспаления и улучшению показателей двигательной реакции бронхов. При этом эффект зависит от дозы препарата и максимален при его наиболее высокой дозировке 49,5 мкг/кг.

Полученное нами значительное увеличение дозы фенотерола (в 31 раз выше терапевтической) при заключении препарата в липосомы представляет большой практический интерес. Поскольку современные подходы лечения синдрома бронхиальной обструкции, особенно его тяжелых форм, предусматривают использование для β-агонистов так называемого "режима больших доз", при котором препарат вводится в дыхательные пути с помощью специального прибора небулайзера в дозировках, превышающих обычные в 10 и более раз (табл. 3) (van Herwaarden CLA, Repine IE, Yermeire P, van Weel C, 1996).

Однако введение препаратов в высоких дозах усиливает частоту побочных и фармакологически обусловленных эффектов, а именно тахикардию, тремор, головную боль и при явлениях дыхательной недостаточности - гипоксемию и гипокалиемию (N. Saifakas, 1993). При заключении фенотерола в липосомы частота побочных эффектов резко снижается и одновременно отмечается противоспалительное действие препарата, которое зависит от дозы и наиболее выражено при максимальной концентрации фенотерола - 49,5 мкг/кг, что также было продемонстрировано нами впервые.

Для выяснения липосомально-клеточных взаимодействий помимо ингаляционного введения свободного и липосомального фенотерола были проведены эксперименты in vitro с использованием органной культуры медиастинальной плевры крыс.

У 10 крыс с экспериментальной БА после декапитации тотчас извлекали медиастинальную плевру, помещали на предметное стекло и инкубировали в термостате при 37^oС в течение двух часов со свободным, липосомальным фенотеролом и физиологическим раствором. Доза фенотерола и липида составляла 0,0007 мкг и 0,007 мкг на 1 г ткани соответственно.

После аппликации свободного и липосомального фенотерола на медиастинальную плевру крыс с моделью БА тучные клетки значительно уменьшились в размерах (табл. 4). Увеличилось число интактных клеточных форм и соответственно снизился коэффициент дегрануляции. При этом плотность цитоплазматических включений возросла и не отличалась от контрольной группы животных (Р>0,05).

Более детальный анализ (табл. 5) показал, что при аппликации липосомального фенотерола стабилизация состояния тучных клеток происходила более быстрыми темпами. Как следует из данных, представленных в табл. 5, в этом случае уменьшение размеров клеток превосходило действие свободного препарата почти в два раза. Более активно в клетках происходили процессы регрануляции, о чем свидетельствовало уменьшение коэффициента дегрануляции на 24% и возрастание плотности цитоплазматических гранул на 22,3% в сравнении со свободной формой препарата.

При оценке действия двух форм фенотерола в опытах in vivo оценивалось состояние тучных клеток в адвентициальной оболочке бронхов (табл. 6) и в медиастинальной плевре (табл. 7).

Как следует из данных, представленных в табл. 6, ингаляционное введение фенотерола значительно уменьшало миграцию тучных клеток в дыхательные пути. Так, количество тучных клеток в адвентиции бронхов уменьшилось на 15,6% и 33,9% от исходного уровня при введении свободного и липосомального фенотерола соответственно (табл. 5). Действие заключенного препарата превысило эффект свободного почти в два раза.

Так же как в опытах in vitro, в экспериментах in vivo установлено стабилизирующее действие фенотерола на состояние тучных клеток. При этом снижение коэффициента дегрануляции, увеличение плотности цитоплазматических гранул и уменьшение размеров профильного поля клеток происходило как в адвентиции бронхов, так и в медиастинальной плевре. Более заметным действием обладал липосомальный фенотерол. Его эффект превышал свободную форму препарата по всем показателям (табл. 5). При этом действие препарата относительно состояния тучных клеток в опытах in vivo при его ингаляционном применении зависело от дозы фенотерола и было максимальным при дозе 49,5 мкг/кг.

Таким образом, сравнительный анализ функционального состояния тучных клеток у животных с экспериментальной моделью БА при аппликации фенотерола на медиастинальную плевру и после его ингаляционного введения подтвердил имеющиеся в литературе данные о возможности β-агониста стабилизировать тучные клетки на ранних стадиях астматической реакции. При этом фенотерол, заключенный в липосомальную форму, обладает более выраженным мембраностабилизирующим действием на тучные клетки, что связано с взаимоусиливающим действием препарата и фосфатидилхолина, составляющего основу Лс (Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986). Возможности фенотерола в липосомальной форме зависят от дозы препарата и наиболее проявляются при дозировке 49,5 мкг/кг.

Итак, предлагаемый нами способ коррекции бронхообструктивного синдрома при экспериментальной бронхиальной астме у животных путем ингаляционного введения липосомальной формы фенотерола в дозе от 1,6 до 49,5 мкг/кг однократно в сутки на протяжении 5 дней подряд обеспечивает выраженный бронходилатирующий эффект. Одновременно наблюдается уменьшение воспалительных проявлений астматической реакции в дыхательных путях, подтверждаемое морфологическими признаками, состоянием нитрооксидсинтазы легких и тучных клеток. Сочетание бронходилатирующего и противовоспалительного действия липосомальной формы β-агониста определяет экономический эффект разработанного способа коррекции, так как возможно уменьшение затрат на проведение дорогостоящей и не всегда безопасной противовоспалительной терапии, включающей применение препаратов интала и глюкокортикостероидов.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для коррекции бронхообструктивного синдрома при экспериментальной бронхиальной астме у животных. Липосомальную форму фенотерола вводят ингаляционным путем. Максимальная терапевтическая дозировка составляет от 1,6 до 49,5 мкг/кг. Вводят ее однократно в сутки на протяжении 5 дней подряд. Способ позволяет сочетать бронходилатирующий эффект препарата с противовоспалительным действием липосом. Это повышает эффективность лечения. 7 табл., 2 ил.

Способ коррекции бронхообструктивного синдрома при экспериментальной бронхиальной астме у животных путем ингаляционного введения липосомальной формы фенотерола, отличающийся тем, что фенотерол используют в максимальной терапевтической дозировке от 1,6 до 49,5 мкг/кг однократно в сутки на протяжении 5 дней подряд.