КРИОЗАЩИТНЫЙ РАСТВОР ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ УМЕРЕННО-НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ Российский патент 2002 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания средства - криозащитного раствора для замораживания лейкоцитов, в частности человека.

В качестве прототипа использована работа В.А. Аграненко и соавт. (1986) Криоконсервирование гранулоцитов с раствором "Лейкокриодмац" [Аграненко В.А. , Абезгауз Н. Н. , Трошина В.М. и др. Криоконсервирование гранулоцитов с раствором "Лейкокриодмац"// Гематол. и трансфузиол. - 1986. - 12. - с.26-29] .

Существенным недостатком прототипа является то, что диметилацетамид (ДМАЦ), использованный в растворе для криоконсервирования гранулоцитов, обладает выраженной токсичностью. По данным А.А.Цуцаевой [Цуцаева А.А., Аграненко В. А. , Федорова Л.И. и др. Криоконсервирование клеточных суспензий// Под общ. ред. А.А. Цуцаевой. - Киев: Наукова Думка, 1983 - 240 с.], ЛД₅₀ ДМАЦ составляет 4,2 г/кг массы мыши. Кроме того, "Лейкокриодмац" не содержит в своем составе антиоксиданта, который способствует быстрому восстановлению энергетических процессов в клетке после ее выхода из холодового анабиоза. Надо отметить, что "Лейкокриодмац" для замораживания лейкоцитов до -50^oС не использовался, т.к. этот метод не был разработан: охлаждение производилось жидким азотом по линейной программе до -196^oС. К тому же вещество ДМАЦ в России не производится.

В криозащитном растворе для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре применен отечественный криопротектор - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (кратко ГМБТОЭМ), имеющий наименьшую токсичность из всех эффективных протекторов: его ЛД₅₀ равна 15,5±0,6 г/кг массы мыши [Сведенцов Е. П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения// Автореферат дисс. доктора мед. наук. - Л., 1987. - 45 с. ДСП]; по сравнению с ДМАЦ ГМБТОЭМ имеет меньшую токсичность в 3,7 раза. В раствор включен антиоксидант - фумарат натрия. Известно [Несмеянов А.Н., Несмеянов Н.А. Начало органической химии. Книга 1. - М.: Химия, 1974. - с.314-315, с.436-437] , что фумаровая кислота, наряду с лимонной участвует в цикле Кребса, обеспечивающим жизнедеятельность клетки. рН раствора составляет 7,0-7,4, что является физиологической нормой для лейкоцитарных клеток. Для поддержания рН на указанном уровне в раствор введена лимонная кислота. Все ингредиенты, использованные в криозащитном растворе, производятся в РФ.

Пример
Криозащитный раствор, содержащий ГМБТОЭМ в концентрации 30%, фумарат натрия 2,8%, лимонную кислоту 0,06%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4 в отношении 1: 1, смешивают с лейкоконцентратом в полимерном контейнере "Компопласт". Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре, а затем охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-х литровой спиртовой ванне до -28^oС в течение 15-20 мин. После этого этапа биоматериал переносят в камеру электроморозильника до -50^oС. Термограмму записывают по датчику, установленному в контейнере "Компопласт" с испытуемым раствором. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38^oС в течение 45-60 с при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Далее определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитов, их жизнеспособность по витальному красителю (проба Шрека) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом. Расчет делают в процентах в сравнении с подобными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Приготовлены три варианта криозащитных растворов для лейкоконцентрата, различающихся по процентному содержанию входящих в него ингредиентов. Состав растворов представлен в табл. 1.

При смешивании 1:1 с лейкоцитами из крови донора конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов 1, 2 и 3, оказывалась в 2 раза ниже исходной (табл. 2), рН среды не изменялась, оставалась в пределах 7,0-7,4.

Охлаждение производят по двухступенчатой экспоненциальной программе: на первом этапе погружают контейнер с лейкоконцентратом в 4-литровую спиртовую ванну, охлажденную до -28^oС, через 15-20 мин контейнер с биообъектом вынимают из ванны и помещают в камеру электроморозильника для замораживания до -50^oС, на что тратилось 8-10 мин. Контроль замораживания осуществляют по термограмме, записываемой по датчику, находящемуся в контейнере с имитатором-раствором криоконсерванта с конечной концентрацией его ингредиентов. Размораживание производят в 20-литровой водяной ванне, нагретой до +38^oС. Контейнер с лейковзвесью отогревают до +2^oС - +4^oС в течение 45-60 с. Производили исследования лейкоцитов на морфологическую сохранность и функциональную активность (см. табл.3).

Самым надежным тестом биологической полноценности лейкоцитов, в частности нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот показатель физиологического свойства клеток оказался лучшим после замораживания - оттаивания при оптимальном соотношении ингредиентов криозащитного раствора.

Готовый раствор прозрачен, с легким желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4. Он хорошо смешивается с взвесью лейкоцитов, предотвращает их конгломерацию, обеспечивает морфологическую сохранность при положительной температуре. Раствор обладает выраженным хладоограждающим действием при замораживании лейкоцитов до -50^oС по двухступенчатой экспоненциальной программе: на первом этапе от +20 до -28^oС, на втором этапе с -29 до -50^oС. Размораживают лейковзвесь в водяной ванне при температуре +38^oС в течение 45-60 с до температуры биообъекта в контейнере +2^oС - +4^oС. После отогрева сохраняются 76±5% физиологически активных лейкоцитарных клеток.

Таким образом, предлагаемый криозащитный раствор позволил сохранить при замораживании лейковзвеси до -50^oС высокий процент физиологически полноценных клеток. Он найдет применение в медицинских учреждениях, где имеются отделения длительного хранения крови и электрохолодильники на -50^oС.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию криозащитных растворов для замораживания лейкоцитов. Криозащитный раствор содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину 24,0-36,0%, фумарат натрия 2,4-3,2%, лимонную кислоту 0,03-0,09% и воду для инъекций - до 100 мл. Технический результат: криозащитный раствор обеспечивает высокий процент физиологически полноценных клеток при замораживании лейковзвеси до -50^oС. 3 табл.

Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно низкой температуре, отличающийся тем, что содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, фумарат натрия, лимонную кислоту и воду при следующем соотношении ингредиентов, %:
Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина - 24,0-36,0
Фумарат натрия - 2,4-3,2
Лимонная кислота - 0,03-0,09
Вода для инъекций - До 100 мл