СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КОСТНОГО МОЗГА Российский патент 2000 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам криоконсервирования костного мозга, и может найти применение в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированного костного мозга.

Практически все известные способы криоконсервирования костного мозга построены на линейных термограммах, при которых охлаждение различных клеточных суспензий осуществляют путем заданного равномерного снижения температуры в определенном диапазоне для каждого вида клеток консервируемого биообъекта.

Установлено, что любая суспензия костно-мозговых клеток, как открытая биологическая система (ОБС), неоднородна и состоит из форменных элементов всех ростков кроветворения и степени созревания. Поэтому при линейных режимах охлаждения в разнородной массе суспензии адаптируются только "сильные" клетки.

Известно, что основной причиной повреждения клеток в процессе замораживания является кристаллизация воды и сопутствующие этому явлению фазовые переходы в растворах при низких температурах.

При этом значительный процент биологически полноценных и пригодных для лечебных целей, но не адаптированных к заданному линейному режиму охлаждения костно-мозговых клеток, повреждается и гибнет при криоконсервировании.

Известен также способ консервирования костного мозга путем смешивания с криозащитным раствором и поэтапного замораживания (Авт.св. СССР N 395054, А 01 N 1/02 от 28.VIII.73 г.). Этот способ взят в качестве прототипа. В нем использован линейно-ступенчатый режим замораживания.

Однако принудительное охлаждение с определенной скоростью понижения температуры снижает устойчивость клеток к факторам криоповреждения, что уменьшает выход жизнеспособных деконсервированных клеток.

Перед авторами была поставлена задача: во-первых, повысить устойчивость клеток костного мозга к факторам криоповреждения при фазовых переходах в процессе замораживания ОБС, во-вторых, одновременно обеспечить упрощение процесса консервирования костного мозга.

Цель изобретения - повышение сохранности и выхода жизнеспособных деконсервированных клеток костного мозга.

Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования костного мозга путем поэтапного замораживании в присутствии криозащитного раствора в пластиковом контейнере, суспензию клеток, залитую в мягкий однократного использования контейнер до заполнения на 10-30%, размещенный в металлическом пенале, обеспечивающем толщину слоя суспензий 6-8 мм, на первом этапе помещают в жидкий хладагент с температурой минус 26-30^oC и выдерживают 15-25 мин, после чего на втором этапе помещают и хранилище- холодильник с температурой минус 40-50^oC.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Открытую биологическую систему суспензий костно-мозговых клеток определенного объема при температуре 16-22^oC помещают в мягкий однократного использования полимерный контейнер, распределяют в слой заданной толщины 6-8 мм и помещают для охлаждения в холодовой адаптации в хладагент с температурой минус 26-30^oC на 15-25 мин.

Как показывают исследования термограмм, в течение 1-2 мин происходит охлаждение клеток до минус 2-9^oC, которые реагируют выбросом тепла на 2-й и 3-й мин, осуществляя естественную холодовую адаптацию, присущую для живых клеток. В последующее время, начавшаяся кристаллизация воды обеспечивает такую структуру льда, которая не разрушает клетки. Последующий процесс кристаллизации идет индивидуальным, естественным и безопасным для каждой клетки путем, без механических повреждений. Через 10-15 мин суспензия вступает в фазу термодинамической стабилизации при температуре суспензии минус 22-25^oC.

Практические исследования показали, что этот процесс в зависимости от объема суспензии (50, 100, 140-160 мл) является устойчивым к 15-25 мин с начала ее охлаждения и означает окончание первого этапа замораживания ОБС.

На втором этапе контейнеры в металлическом пенале-холдере помещают в хранилище-холодильник с температурой минус 40-50^oC.

Как показали исследования, на втором этапе окончательное замораживание суспензии костно-мозговых клеток до температуры минус 40-50^oC происходит через 25-30 мин и далее сохраняется до 120 суток в том же хранилище-холодильнике.

Предлагаемый способ обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток после деконсервирования на 77-91%.

При исследовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа консервирования костного мозга.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждают изобретательский уровень.

Способ осуществляют следующим образом.

Концентрат заготовленных клеток костного мозга смешивают в соотношении 1:1 с криозащитным раствором "Гекмолит" (см. патент РФ N 2049391, 1977 г.) и заливают в контейнер. В качестве контейнера используют устройство "Гемакон 500" (ТУ 64- 2-293-60), которое представляет собой мягкий пластиковый, стерильный, обеспечивающий герметизацию, однократного использования, пакет емкость которого 500 мл. Объем клеточной суспензии, вводимой в контейнер "Гемакон 500", может быть выбран, исходя из практики трансфузиологии, 50 мл, 100 мл или 140-160 мл. Контейнер герметизируют и подворачивают таким образом, чтобы оставшийся объем был заполнен на 10-30%. Затем контейнер помещают в металлический пенал-холдер, фиксируя объем суспензии с равномерным слоем 6-8 мм. Заполнение контейнера менее чем на 10% невыгодно, заполнение более чем на 30% увеличивает толщину фиксированного слоя суспензии и не обеспечивает эффективного равномерного охлаждения данной ОБС.

После выдержки (эквилибрации костного мозга с криозащитным раствором "Гекмолит") при комнатной температуре в течение 20-30 мин холдер помещают в камеру замораживания электрического морозильника - шок-фризера, заполненную охлажденным до минус 26-30^oC с 96^o этиловым спиртом. Затем холдер с контейнером, содержащим объем суспензии клеток 50 мл, выдерживают при таких условиях 15-16 мин, объем 100 мл - выдерживают 20-21 мин, объем 140-160 мл - выдерживают 23-25 мин, после чего их переносят для окончательного замораживания и хранения в электрохолодильник-хранилище, где поддерживают температуру минус 40-50^oC.

Хранение костно-мозговых клеток при температуре минус 40-50^oC можно производить в течение 60-120 суток.

Размораживание костного мозга производят в холдере путем погружения в водяную баню при температуре + 40 - 45^oC, обеспечивая согревание деконсервированной ОБС в течение 30-60 мин до температуры +2-5^oC.

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств деконсервированных клеток свидетельствуют о высокой эффективности разработанной безазотной технологии низкотемпературного консервирования костного мозга:
- количество жизнеспособных миелокариоцитов составляет 77-91%,
- количество коммитированнмх клеток-предшественников - 60-66%.

В качестве подтверждения осуществимости способа проведены следующие исследования.

Пример 1. Был взят объем замораживаемой ОБС 50 мл. В контейнер "Гемакон 500" (освобожденный от гемоконсерванта) ввели 25 мл концентрата костно-мозговык клеток и к ним добавили 25 мл криозащитного раствора "Гекмолит, в результате чего объем контейнера заполнили на 10%, герметизировали, подвернули, создавая толщину слоя суспензии 6-8 мм, затем уложили в холдер. При исходной температуре (после 20- минутной выдержки при комнатной температуре) + 20,5^oC (контроль проводили по датчику, установленному в контейнер с ОБС), холдер поместили в морозильную камеру в хладагент с температурой -26^oC. Через 1 мин температура суспензий достигала - 3,2^oC, далее через 15-18 мин ОБС охладилась до температуры - 24^oC, а температура хладагента одновременно повысилась до минус 24,4^oC. Эти показатели в последующем были устойчиво стабильными и указывали на наступление термодинамического равновесия ОБС, а также окончание первого стала замораживания костного мозга.

На втором этапе в течение 20 с холдер перенесли в морозильник-биохранилище с температурой воздуха минус 40-50^oC. Через 20 мин температура костного мозга в контейнере составила -40^oC.

Через 68 суток хранения провели размораживание взвеси в холдере в водяной бане при температуре +42^oC в течение 30 с для ее исследования.

- количество жизнеспособных миелокариоцитов составило 91%,
- количество коммитированных клеток-предшественников составило - 65,3%.

Пример 2. Был взят объем замораживаемой ОБС 160 мл: суспензии костно-мозговых клеток 80 мл, криозащитного раствора "Гекмолит" - 80 мл. Контейнер "Гемакон 500" заполнили суспензией на 30%, поместили в холдер, фиксировали толщину слоя суспензии 8 мм, сделали 20-минутную экспозицию с криозащитным раствором при комнатной температуре 19^oC, холдер поместили в 96^o этиловый спирт с температурой - 30^oC. Через 2 мин температура суспензии достигла - 9^oC, через 25 мин температура костного мозга стабилизировалась на отметке - 22,2^oC, а температура хладагента -22,5^oC, что подтверждало окончание I этапа. На втором этапе в течение 25 с холдер перенесли в холодильник - биохранилище с температурой -50^oC на дальнейшее замораживание и хранение.

Через 120 суток хранения ОБС размораживали в холдере в водяной бане при температуре + 45^oC в течение 60 с и исследовали:
- количество жизнеспособных миелокариоцитов составило 80%,
- количество коммитированных клеток-предшественников составило 61%.

Предлагаемая технология замораживания костного мозга не требует постоянного температурного контроля охлаждения ОБС. Учитывается объем замораживаемой суспензии и время ее нахождения в хладагенте с начальной заданной температурой.

Использоваиие в предлагаемом способе в качестве контейнера известного в широкой лечебной практике полимерного контейнера " Гемакон 500", а также криозащитного раствора" Гекмолит", не требующего отмывания криопротектора, позволяет значительно упростить криоконсервирование костного мозга и последующее его использование. Стерильность, ареактогенность и устойчивость материала "Гемакон 500" к криозащитному раствору и температуре от 45^oC до 60^oC обеспечивают биологическую полноценность замораживаемых клеток и существенно снижают риск посттрансфузионных осложнений.

Простое оборудование для ведения процесса замораживания, не требующего снижения температуры хладагента с заданной скоростью, существенно уменьшает энергетические и материальные затраты.

Использование в качестве хладагента 96^o этилового спирта также уменьшает энергетические и материальные затраты.

Предлагаемая технология консервирования костного мозга замораживанием, не требующая постоянного температурного контроля, использующая доступное недорогое оборудование, полимерные устройства однократного использования и криозащитный раствор, не требующий отмывания криопротектора, найдет широкое применение в медицинской практике.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам криоконсервирования костного мозга, и может найти применение в гематологических и онкологических центрах для лечения больных трансплантацией консервированного костного мозга. Способ осуществляют путем поэтапного замораживания в присутствии криозащитного раствора, при котором суспензию клеток, залитую в мягкий однократного использования контейнер до заполнения на 10-30 %, размещенный в металлическом пенале, обеспечивающем толщину слоя суспензии 6-8 мм, на первом этапе помещают в жидкий хладагент с температурой минус 26-30°С и выдерживают 15-25 мин, на втором этапе помещают в хранилище-холодильник с температурой минус 40-50°С. Технический результат: способ обеспечивает высокую сохранность морфологической и функциональной полноценности деконсервированных миелокариоцитов и коммитированных клеток-предшественников после 120 суток хранения костного мозга.

Способ консервирования костного мозга путем смешивания с криозащитным раствором и последующего поэтапного замораживания полученной клеточной суспензии, отличающийся тем, что суспензию клеток, залитую в мягкий однократного использования контейнер до заполнения на 10 - 30%, размещенный в металлическом пенале, обеспечивающем толщину слоя суспензии 6 - 8 мм, на первом этапе помещают в жидкий хладагент с температурой минус 26 - 30^oC и выдерживают 15 - 25 мин, после чего на втором этапе помещают в хранилище - холодильник с температурой минус 40 - 50^oC.