СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ Российский патент 2002 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования замораживанием клеток костного мозга и компонентов крови человека, и может найти применение в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения и инфекционными осложнениями.

Известен способ консервирования клеток костного мозга в эластичных упаковках, заполненных на 10-30%, в охлажденном жидком хладагенте путем поэтапного замораживания в растворе этилового спирта 96 об.% с выдерживанием при температуре холодовой адаптации и последующего охлаждения до -40÷-50^oС в морозильнике (Авт. св. 2144290, А 01 N 1/02). Этот способ взят в качестве прототипа. В нем использован экспоненциальный линейно-ступенчатый режим замораживания, повышающий сохранность и устойчивость любых открытых биологических систем (ОБС), в том числе, суспензии донорских клеток костного мозга, лейкоцитов и тромбоцитов к факторам криоповреждения.

Однако использование в технических целях раствора этилового спирта 96 об. % высокой очистки в качестве жидкого хладагента-выбора затратно и нежелательно, поскольку оказывает высокое токсическое воздействие на организм, а также является профессиональной и бытовой вредностью.

Кроме того, не выдерживается соотношение объема замораживаемых контейнеров с биосредой и объема жидкого хладагента в морозильной камере. Поэтому не представляется возможным стандартизировать условия консервирования клеточных суспензий замораживанием и тем самым повысить сохранность биологических объектов.

Задача изобретения: заменить раствор этилового спирта 96 об.% на дешевый и менее токсичный хладагент.

Другая задача изобретения состоит в необходимости стандартизировать условия криоконсервирования клеточных суспензий.

Цель изобретения - повысить сохранность клеток и экономичность их криоконсервирования.

Поставленная цель достигается тем, что в вышеописанном способе при замораживании упаковок, заполненных на 10-20%, и температуре холодовой адаптации -22÷-25^oС используют в качестве жидкого хладагента раствор этилового спирта 38-40 об.%, а при замораживании упаковок, заполненных на 25-33,3%, и температуре холодовой адаптации -26÷-30^oС в качестве жидкого хладагента используют раствор этилового спирта 42-45 об.%, при этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Суспензию клеток в растворе криопротектора при 18-20^oС расфасовывают в упаковку из 1-4 эластичных полимерных контейнеров вместимостью 300 или 500 мл до заполнения на 10-33,3% и контейнера-спутника, после чего упаковку помещают в морозильную камеру с предварительно охлажденным хладагентом - раствором этилового спирта. В зависимости от количества суспензии в контейнере и биологических особенностей на первом этапе упаковку, заполненную на 10-20%, помещают в раствор этилового спирта 38-40 об.%, охлажденный до -22÷-25^oС, и выдерживают в нем 23-25 мин, упаковку, заполненную на 25-33,3%, помещают в раствор этилового спирта 42-45 об.%, охлажденный до -26÷-30^oС, и выдерживают в нем 25-30 мин. При этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере. После завершения холодовой адаптации клеток на втором этапе упаковку помещают в морозильник и замораживают до -40÷-80^oС.

Как показывают исследования термограмм, в течение 2-4-й мин первого этапа происходит охлаждение клеток до -2÷-9^oС, которые реагируют выбросом тепла на 4-5-й мин. В последующее время идет процесс кристаллизации и переохлаждения клеток консервируемой открытой биологической системы. Охлажденные через 22-24 мин до -22÷-25^oС или через 25-30 мин до -26÷-30^oС, клетки переходят в фазу холодовой термодинамической стабилизации, после чего (во время второго этапа) происходит окончательное замораживание клеток до - 40÷-80^oС, Продолжительность второго этапа составляет 30-60 мин. Замороженные клеточные суспензии пригодны к использованию до 2,5 лет (срок наблюдения). Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания на 80-93% и экономию до 2450 мл этилового спирта 96 об.% высокой очистки на каждой операции криоконсервирования клеточных суспензий.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа консервирования клеточных суспензий.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию клеток в растворе криопротектора при 18-20^oС расфасовывают по 50, 75 или 100 мл в полимерные контейнеры "Гемакон" 300, "Гемакон" 500 или "Компопласт" 300 вместимостью, соответственно, 300 или 500 мл, до заполнения на 10-33,3%. Упаковку из 1-4 таких контейнеров и контейнера-спутника помещают на 23-30 мин в морозильную камеру с предварительно охлажденным до -22÷-30^oС раствором этилового спирта 38-45 об.%. При этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере. Охлажденную до -22÷-30^oС и выдержанную при температуре холодовой адаптации упаковку с замороженной клеточной суспензией затем помещают в морозильник с температурой -40÷-80^oС, которую они достигают за 30-60 мин.

Замороженную суспензию клеток при данных условиях хранят от нескольких суток до 2,5 лет.

Размораживание клеток производят путем погружения упаковки в водяную баню и покачивания в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-42^oС до согревания суспензии клеток до 2-4^oС (костный мозг, лейкоциты) и 37^oС (тромбоциты).

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств замороженных-оттаянных клеток по различным методам оценки свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа консервирования клеток при умеренно низких температурах:
- количество жизнеспособных миелокариоцитов, лейкоцитов и тромбоцитов по различным методам оценки составляет 77-91%;
- экономия этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) на каждой операции составляет 550-2030 мл.

В качестве подтверждения осуществимости способа проведены следующие исследования.

Пример 1. Был взят объем замораживаемой ОБС - суспензии донорских тромбоцитов на растворе криопротектора 60 мл. В эластичный контейнер "Гемакон" 500 (освобожденный от гемоконсерванта) ввели 50 мл суспензии, в результате чего объем контейнера заполнили на 10%, и 10 мл суспензии ввели в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 91 мл. При исходной температуре 18-20^oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 910 мл раствора этилового спирта 38-40 об. %, охлажденного до температуры холодовой адаптации -22÷-25^oС, при этом объем упаковки составил 10% объема хладагента. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -3,2^oС, после 23-25 мин выдержки ОБС охладилась до -24÷-25^oС. Эти показатели были стабильными.

На втором этапе упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -40-80^oС.

Через 20 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерном контейнере в водяной бане при 37-38^oС в течение 25-30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС:
- количество тромбоцитов составило 87%;
- адгезия тромбоцитов к стеклу - от 12 до 25%;
- агрегация тромбоцитов (с АДФ) - 25,3%;
- экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 550 мл.

Пример 2. 85 мл суспензии лейкоцитов донорской крови на растворе криопротектора расфасовали в эластичный контейнер "Компопласт" 300 75 мл до заполнения на 25% и 10 мл - в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали согласно паспортных данных консервируемого биопродукта, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 108 мл. При исходной температуре 18-20^oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 1080 мл раствора этилового спирта 45 об. %, охлажденного до температуры холодовой адаптации -26÷-30^oС. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -2,9^oС, после 25-30 мин выдержки ОБС охладилась до -26÷-28^oС. Эти показатели были устойчиво стабильными.

На втором этапе в течение 10 с упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -60-80^oС.

Через 48 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерных контейнерах в водяной бане при 38^oС в течение 30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС:
- количество лейкоцитов составило 89%;
- жизнеспособность лейкоцитов 74%;
- фагоцитарная активность нейтрофилов 45%;
- экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.%) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 573,7 мл.

Пример 3. 310 мл суспензии костномозговых клеток на растворе криопротектора расфасовали в три эластичных контейнера "Гемакон" 300 по 100 мл в каждый до заполнения на 33,3% и 10 мл суспензии - в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали согласно паспортных данных консервируемого биопродукта, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 391 мл. При исходной температуре 18-20^oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 3910 мл раствора этилового спирта 42 об.%, охлажденного до температуры холодовой адаптации -26÷-30^oС. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -3,2^oС, после 25-30 мин выдержки ОБС охладилась до -26÷-28^oС. Эти показатели были устойчиво стабильными.

На втором этапе в течение 10 с упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -40÷-80^oС.

Через 120 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерных контейнерах в водяной бане при 39-42^oС в течение 30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС:
- количество жизнеспособных миелокариоцитов составило 93%;
- количество коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза составило 64,8%;
- экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 2030 мл.

Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания на 80-93%, экономию 550-2030 мл этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) на каждой операции, а также снижение профвредности технологии криоконсервирования клеточных суспензий.

Использование в предлагаемом способе стандартных порций фасуемых консервируемых суспензий клеток в стандартные эластичные контейнеры, отношения объема замораживаемых упаковок с ОБС к объему хладагента, равным 10, и снижение об.% рабочего раствора этилового спирта (по отношению к этиловому спирту 96 об.% высокой степени очистки), в зависимости от температуры холодовой адаптации, позволяет значительно упростить криоконсервирование различных ОБС, прогнозировать высокий процент сохранных клеток, снизить затратность технологии и ее профвредность.

Предлагаемая технология криоконсервирования клеток костного мозга и компонентов крови в установленных стандартах технологии предельно проста в реализации, дает стабильный положительный результат, экономию материальных средств и снижение профвредности и найдет широкое применение в медицинской практике.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования замораживанием клеток костного мозга и компонентов крови человека. Способ консервирования клеточных суспензий осуществляют путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладоагенте в виде раствора этилового спирта с фиксированной температурой холодовой адаптации и с последующим перемещением для замораживания в хранилище, при этом упаковку, заполненную на 10-20% помещают в раствор этилового спирта 38-40 об.% с температурой холодовой адаптации от -22 до -25^oС, упаковку, заполненную на 25-30% помещают в раствор этилового спирта 42-45 об.% с температурой холодовой адаптации от -26 до -30^oC с последующим замораживанием в хранилище при температуре от -40 до -80^oC. Технический результат: способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток.

Способ консервирования клеточных суспензий путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладоагенте в виде раствора этилового спирта, с фиксированной температурой холодовой адаптации и с последующим перемещением для замораживания в хранилище, отличающийся тем, что упаковку, заполненную на 10-20%, помещают в раствор этилового спирта 38-40 об. % с температурой холодовой адаптации от -22 до -25^oС, упаковку, заполненную на 25-30%, помещают в раствор этилового спирта 42-45 об. % с температурой холодовой адаптации от -26 до -30^oС с последующим замораживанием в хранилище при температуре от -40 до -80^oС.