ХЛАДООГРАЖДАЮЩИЙ РАСТВОР ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ Российский патент 2012 года по МПК A61K35/00 A01N1/02 

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования лейкоцитов, в частности, человека.

В качестве прототипа нами использована работа Н.Н.Абезгауза и В.А.Леонтовича «Замораживание белых клеток периферической крови для их длительного хранения при ультранизких температурах» (ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1966. - №9. - С.24-29). Существенным недостатком прототипа является то, что предложенный его авторами ограждающий раствор содержит глицерин в 15% концентрации и после отогрева требует отмывания, что дополнительно травмирует высокочувствительные к разного рода повреждающим факторам ядерные клетки крови. Кроме того, взамен используемого в прототипе дисахарида сахарозы нами применен полисахарид комаруман, обладающий рядом положительных эффектов в отношении лейкоцитов: экзоцеллюлярным, иммуномодулирующим и противовоспалительным.

С целью консервирования лейкоцитов при субумеренно низкой температуре в учреждениях криобиологического и медицинского профиля, обеспеченных электроморозильниками на -20°С, в предложенный протекторный раствор включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - комаруман, 1) обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -20°С выраженный криобиологический (технический) эффект и 2) оказывающий иммуномодулирующие и противовоспалительное действие на лейкоциты (Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Antiinflammatory acrivity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre L. // Fitoterapia. 2005. Vol.76, №3-4. P.281-287; Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов: Автореф. дис. док. биол. наук; Сыктывкар, 2010. - 37 с.), поэтому включение комарумана в криоконсервант усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 70% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев - Наукова думка, 1978. - с.5-64), используется в нетоксичной для клеток концентрации, поэтому не требует отмывания перед применением; антикоагулянт - трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), имеющий широкое применение в производстве медицинских препаратов и при консервировании.

Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.

Пример использования средства

Консервирующий раствор, содержащий глицерин в концентрации 6%, комаруман - 0,25%, трилон Б - 0,1%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре, охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым 96% спиртом до -20°С в течение 9-14 минут. Затем замороженный лейкоконцентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющую температуру -20°С. Термограмму записывают по термопаре, введенной в контейнер «Компопласт» с хладоограждающим раствором, в конечной концентрации. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35-50 секунд при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - №9. - С.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов консерванта представлен в таблице 1.

Таблица 1 Номер варианта криоконсерванта Состав хладоограждающего раствора Комаруман в % Глицерин в % Трилон Б в % Вода для инъекций в мл 1 0,35 6,0 0,1 До 100 2 0,25 6,0 0,1 До 100 3 0,15 6,0 0,1 До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта №1, №2 и №3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2 Номер варианта криоконсерванта Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесью Комаруман в % Глицерин в % Трилон Б в % Вода для инъекций в мл 1 0,175 3,0 0,05 До 200 2 0,125 3,0 0,05 До 200 3 0,075 3,0 0,05 До 200

Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (таблица 3).

Таблица 3 Вариант консервирующего раствора Показатели в % к исходному уровню Жизнеспособность лейкоцитов Морфологическая сохранность гранулоцитов Фагоцитарная активность нейтрофилов Верхний предел дозировок ингредиентов раствора 76,8±4,9 (n=5) 67,0±7,4 (n=5) 61,2±4,6*(n=5) Оптимальное соотношение ингредиентов раствора 75,5±2,9 (n=6) 70,0±6,9 (n=6) 82,8±7,7 (n=6) Нижний предел дозировок ингредиентов раствора 36,0±4,1*(n=5) 34,4±3,5*(n=5) 19,2±2,3*(n=5) * - различие достоверное (р<0,05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения-отогрева при использовании криоконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.

Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при замораживании лейкоцитов до -20°С.

Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -20°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных ядерных клеток крови. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине и касается создания раствора для консервирования ядерных клеток крови при субумеренно низкой температуре и сохранения их в физиологически активном состоянии после отогрева. Раствор содержит глицерин, комаруман и трилон Б. Соотношение ингредиентов: глицерин 6,0%, комаруман 0,35-0,15%, трилон Б 0,1%, вода для инъекций до 100 мл. Его рН составляет 7,0-7,4. Смешивание лейкоконцентрата 1:1 с данным раствором, замораживание до -20°С, хранение при данной температуре в течение одних суток и отогрев позволяют сохранить 75,5±2,9% жизнеспособных лейкоцитов и 70,0±6,9% физиологически полноценных нейтрофильных клеток, 82,8±7,7% из которых способны к фагоцитозу. Использование заявленного хладоограждающего раствора обеспечивает сохранность высокого процента активных ядерных клеток крови. 3 табл., 1 пр.

Хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови, содержащий глицерин, комаруман, трилон Б и воду для инъекций при рН раствора 7,0-7,4 и следующем соотношении ингредиентов, %:
Глицерин 6,0 Комаруман 0,35-0,15 Трилон Б 0,1 Вода для инъекций До 100 мл