СПОСОБ БИНАРНОЙ ПЕРФУЗИИ ПИЩЕВОДА Российский патент 2002 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии.

Современные морфологические исследования любого органа или ткани подразумевают его изучение не только на клеточном, но и субклеточном уровне. Однако в доступной нам отечественной и зарубежной литературе обнаружена лишь одна работа [Баженов Д.В. Мышечные ткани пищевода млекопитающих./Актуальные вопросы гистогенеза, структурной организации и регенерации/ Автореф. дисс. д-ра мед. наук. - Л., 1988. - 37 с.], посвященная анализу структуры мышечной оболочки пищевода у млекопитающих и человека с использованием методики электронной микроскопии. Вместе с тем только знание ультраструктуры клеток позволяет судить о механизмах изменений, происходящих на органном и организменном уровнях.

Одна из классических методик подготовки материала для электронно-микроскопического изучения, которая была использована в этом исследовании, подразумевает вскрытие занаркотизированного животного и выделение у него пищевода. Затем орган помещают на чашке Петри в фиксатор, разрезают его на фрагменты размером 5 мм х 5 мм, которые переносят в бюкс с фиксирующим раствором [Palade G. A study of fixation for electron microscopy. / J. Exp. Med. - 1952. - V. 95. - 3. - Р. 285-287].

Недостатком описанного способа является то, что фиксатор оказывает действие только на поверхность кусочка ткани, пропитка глубоких слоев происходит достаточно медленно. Кроме того, замедлению течения процесса фиксации способствует образование зоны уплотнения на поверхности фрагмента пищевода из-за дополнительных молекулярных сцеплений.

В связи с вышеизложенным наиболее распространенным в настоящее время методом фиксации тканей является способ перфузии тканей раствором фиксатора - 2,5% раствора глютарового альдегида на 0,2М фосфатном буфере (рН 7,4). Для проведения перфузии наркотизированное животное фиксируют на предметном столике, после чего на передней поверхности грудобрюшной стенки делают разрез. Фиксацию тканей начинают еще до взятия кусочков, вводя фиксатор в орган in situ. В качестве наиболее эффективного средства доставки фиксатора в глубокие отделы тканей органа используется его перфузия в кровеносную систему животного. Иглу, соединенную с перфузионной системой, вводят в главную артерию, питающую данный орган, и закрепляют на ней лигатурой. Для оттока крови и жидкости перерезают главную вену, отводящую кровь от этого органа. После непродолжительного промывания органа изотоническим раствором хлорида натрия (50-70 мл) приступают к перфузионной фиксации. После чего пережимают вену и несколько увеличивают давление фиксатора для того, чтобы сосуды расширились и фиксатор прошел по ним в ткань [Б. Уикли. Электронная микроскопия для начинающих. "Мир", Москва, 1975]. Затем орган иссекается как можно быстрее и переносится в свежий раствор фиксатора, помещенный в чашку Петри. После этого его режут на фрагменты размером 5 мм х 5 мм, которые помещают в бюкс с новой порцией фиксирующего раствора. Количество перфузионного раствора составляет около 200 мл, продолжительность перфузии - 25 мин. Этот метод забора с предварительной фиксацией рекомендуют использовать при исследовании клеток миокарда, мозга, периферической нервной системы и почек [Sabatini D., Barnett R., Cytochemistry and electron microscopy - the preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. / J. Cell. Biol. - 1972. - P. 19-28].

Из недостатков способа перфузии можно отметить следующие. Во-первых, значительная продолжительность процесса префиксации не позволяет уменьшить изменения в тканях, вызываемых гипоксией, автолизом и гетеролизом, связанными с нарушением функций ферментов. Вместе с тем основным требованием при проведении фиксации материала для электронной микроскопии является сокращение сроков между моментом прекращения жизнедеятельности объекта и началом фиксации. Кроме того, перфузия мышечной оболочки пищевода неэффективна вследствие относительно низкой скорости проникновения фиксатора в ткани ввиду ее срединного положения (между эпителием и адвентицией). Во-вторых, нерационально используется большой объем фиксирующей жидкости, который не обеспечивает прицельную фиксацию изучаемого органа. В-третьих, снижается вероятность качественной фиксации органа через микроциркуляторное русло, обусловленное длительным наркотическим состоянием животного. В-четвертых, давление, под которым вводится фиксатор в сосуд, приходится регулировать эмпирически и существует опасность разрыва тканей, если давление окажется очень сильным. Вместе с тем подача фиксатора под слабым давлением не позволит фиксатору приникать в сосуды микроциркуляторного русла.

Предлагаемый авторами способ бинарной (то есть двойной) перфузии создает наиболее благоприятные условия для сохранения ультраструктуры гладкомышечных клеток и поперечно-полосатых волокон мышечной ткани пищевода и других внутренних органов, в стенке которых имеется мышечный слой. Перфузия осуществляется в два этапа: вначале применяется 0,1 н. раствор никотиновой кислоты в течение 1-3 минут, затем 2,5% раствор глютарового альдегида на 0,2М фосфатном буфере (рН 7,4). Предварительная перфузия раствором никотиновой кислоты обеспечивает расширение сосудов (вазодилятаторный эффект), что ускоряет процесс проникновения фиксатора в ткани. Изучаемым животным под наркозом вскрывали полость тела в проекции пищевода и сердца и отсепаровывали кровеносные сосуды, питающие эти органы. В отпрепариванные сосуды (у представителей классов рыб и земноводных - спинная аорта; у рептилий - аорта; у мелких птиц - безыменная артерия; у крупных птиц и млекопитающих - пищеводная артерия) вводили иглу перфузионной системы и фиксировали ее лигатурой. Объем никотиновой кислоты, используемый для перфузионной фиксации, составлял 3-5 мл, а глютарового альдегида 20-50 мл в зависимости от размеров и массы животного. Время фиксации - 3-5 мин. Затем пищевод тщательно отделяли от топографически близких органов и тканей, орошая его при этом раствором фиксатора. После препарирования и иссечения части пищевода фиксирующий раствор с помощью пипетки вводили в его просвет. Таким образом достигалась одновременная поверхностная и глубокая префиксация тканей пищевода. Извлеченный участок пищевода помещался в бюкс с раствором фиксатора. Дальнейшая фиксация проводилась по общепринятой методике.

Преимуществами способа бинарной перфузии пищевода являются:
1. Сокращение времени фиксации и ускорение проникновения фиксатора в мышечные ткани в связи с сосудорасширяющим действием никотиновой кислоты на все компоненты сосудистого русла (артерии, вены и капилляры).

2. Возможность использования раствора никотиновой кислоты для создания вазодилятаторного эффекта у всех животных, независимо от типа их обмена веществ (холоднокровные, теплокровные).

3. Снижение вероятности возникновения артефактов при фиксации вследствие того, что никотиновая кислота является антиоксидантом и стабилизирует мембраны клеток.

4. Отсутствие токсичного действия никотиновой кислоты на ткани с одновременной активацией работы ионных насосов мембран клеток, что также способствует ускоренному проникновению фиксатора в ткани.

5. Экономия дорогостоящего фиксатора, используемый объем которого уменьшается благодаря предварительному применению дешевой и доступной никотиновой кислоты.

Способ бинарной перфузии может быть использован для электронно-микроскопического исследования любого внутреннего органа (полостного и паренхиматозного).

Изобретение относится к области медицины. Способ осуществляется введением через перфузионную систему в сосуды, питающие пищевод, вначале порции 0,1 н. раствора никотиновой кислоты, а затем 20-50 мл фиксатора (глютарового альдегида). Предварительная перфузия раствором никотиновой кислоты создает сосудорасширяющий эффект, ускоряя проникновение фиксатора в мышечные ткани, и снижает вероятность возникновения артефактов при фиксации, т.к. является антиоксидантом и стабилизирует мембраны клеток. Способ может быть рекомендован для фиксации любых внутренних (полостных и паренхиматозных) органов позвоночных и человека. Способ обеспечивает быстроту фиксации клеток и волокон мышечной оболочки.

Способ бинарной перфузии пищевода, включающий перфузионную префиксацию раствором глютарового альдегида, отличающийся тем, что перфузию проводят поэтапно, с применением на первом этапе 3-5 мл 0,1 н. раствора никотиновой кислоты, а затем глютарового альдегида объемом 20-50 мл и временем фиксации 3-5 мин.