СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С ПОВРЕЖДЕНИЕМ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования иммунитета, и может быть использовано для определения функционального состояния иммунной системы у пациентов с повреждением головного мозга.

Известен способ оценки функционального состояния иммунной системы у пациентов с повреждением головного мозга, заключающийся в заборе крови, выделении сыворотки и определении в ней различных цитокинов, маркеров активации иммунной системы (Томников М. А. Диагностическое и прогностическое значение цитокинов ФHO-∝ ИHФγ, ИЛ-4 в остром периоде нетравматических внутричерепных кровоизлияний: Автореф. канд. мед. наук - С.-Петербург, 2000. - с. 11-12).

Однако специфика проведения иммуноферментного анализа не позволяет выполнять исследования у единичных пациентов, что приводит к удлинению времени от момента забора материала до выдачи результатов в клинику.

В качестве прототипа нами выбран способ оценки функционального состояния иммунной системы у пациентов с повреждением головного мозга, заключающийся в исследовании периферической крови и определении активных Т-лимфоцитов методом Е-розеткообразования (Мидленко А.И. Острый период сотрясения головного мозга у детей.: Автореф. канд. мед. наук. - С.-Петербург, 2000. с. 8.)
Однако известный способ не позволяет оценить функциональное состояние всех звеньев иммунной системы. Кроме того, он обладает низкой специфичностью и подвержен многим артефактам.

Задача предлагаемого изобретения - повышение точности и достоверности результатов.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови из периферической вены и выделение из нее лифоцитов, определяют на них экспрессию поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости и при ее снижении на 50% и более от уровня экспрессии этих молекул на лимфоцитах у клинически здоровых лиц судят о подавлении функциональной активности иммунной системы.

Способ осуществляют следующим образом: проводят забор 5 мл крови из периферической вены в пробирки с гепарином (из расчета гепарина 5ЕД/мл), разводят забуференным физраствором (рН 7.4) в соотношении 1:1 и наслаивают на 3 мл градиента фиколл-верографина (1,077г/л). После этого проводят центрифугирование при 200g в течение 40 мин и выделяют лимфоциты. Затем на выделенных клетках методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител ИКО-1 (против молекулы HLA-DR) и ИКО-53 (против α-цепи молекулы HLA-1) определяют экспрессию поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости. Для этого мононуклеарные клетки, собранные в интерфазе, отбирают в чистую сухую пробирку и отмывают их 3 раза в избытке забуференного физраствора. Затем на стекло в лунки из парафильма наносят по 20 мкл исследуемых клеток в концентрации 1-2 млн в 1 мл.

Инкубируют клетки в течение 30 мин при температуре 37^oС во влажной камере. Надосадочную жидкость отбирают из лунок, вносят в них по 20 мкл раствора моноклональных антител ИКО-1 и ИКО-53 и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. По истечении времени отмывают клетки 5 раз в забуференном физрастворе. Затем на клетки наносят по 20 мкл раствора фрагментов антител против иммуноглобулинов мыши, меченных ФИТЦ, и инкубируют 30 мин на льду. После повторного отмывания в забуференном физрастворе в лунки добавляют 50%-ный глицерин в физиологическом растворе. Исследуют препарат на люминисцетном микроскопе, подсчитывая относительное содержание светящихся клеток с морфологией лимфоцитов, так называемых HLA -DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов. После этого сравнивают относительное количество HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов у пациентов с повреждением головного мозга и у клинически здоровых лиц и при их снижении у пострадавших на 50% и более судят об иммуносупрессии.

Клинические примеры
1. Больной И., 42 года (и.б. 7683) поступил в нейрохирургическое отделение 16.10.00 с диагнозом: закрытая черепно-мозговая травма, ушиб головного мозга II степени, алкогольное опьянение. Состояние больного тяжелое, сознание - оглушение.

В иммунном статусе: 19.10.00 в периферической крови пострадавшего количество HLA-DR⁺ лимфоцитов снижено на 40%, HLA-I⁺ лимфоцитов - на 32% по сравнению с содержанием этих клеток в крови здоровых лиц. 25.10.00 отмечается уменьшение относительного числа HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ клеток на 42% и на 32% соответственно по сравнению с уровнем HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов в крови здоровых лиц. 6.11.00 относительное содержание НLA -DR⁺ лимфоцитов снижено на 17%, а относительное число HLA-I⁺клеток находится на уровне содержания этих клеток у клинически здоровых людей.

Пациент прошел комплексное лечение по стандартной схеме. Инфекционных осложнений не было. Выписан на амбулаторное лечение.

2. Больной О., 41 год, (и.б. 8305), поступил в нейрохирургическое отделение 6.11.00 с диагнозом: Тяжелая черепно-мозговая травма, ушиб головного мозга III степени. Состояние больного тяжелое, сознание - кома 1.

В иммунном статусе от 9.11.00 в периферической крови у пострадавшего относительное количество HLA-DR⁺ лимфоцитов уменьшено на 45%, a HLA-I⁺ лимфоцитов не отличалось от содержания этих клеток в крови здоровых лиц. 15.11.00 относительное количество HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов понижено на 53% и на 40% соответственно по сравнению с содержанием этих клеток в крови здоровых лиц. 23.11.00 отмечается прогрессирующее снижение относительного количества HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов на 80% и 62% соответственно по сравнению с содержанием этих клеток в крови здоровых лиц. 12.11.00 у больного выявлена тяжелая долевая пневмония. Проводилась массивная антибиотикотерапия. Несмотря на проводимое лечение пневмония прогрессировала, и 25.11.00 констатирована смерть.

Из приведенных примеров видно, что уже при первичных исследованиях функционального состояния иммунной системы выявлены значительные изменения количества HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов по сравнению с уровнем этих клеток в крови здоровых лиц. Однако, если в последующем у первого пациента не произошло дальнейшего снижения числа HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ клеток, а наоборот, имелась тенденция к нормализации этих показателей, то у второго пострадавшего количество HLA-DR⁺ и HLA-I⁺ лимфоцитов прогрессивно уменьшилось, что говорит о развитии выраженной иммуносупрессии. При этом наблюдалось развитие грозного инфекционного осложнения пневмонии, в результате которого пациент погиб.

Способ оценки функциональной активности иммунной системы при повреждении головного мозга позволяет с достаточной достоверностью оценить функциональное состояние иммунной системы при низких затратах и небольшом времени исследования. Способ информативен, выполним в условиях специализированного стационара и может быть использован в клинической практике.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функционального состояния иммунной системы у пациентов с повреждением головного мозга. Способ обеспечивает повышение точности и достоверности результатов. Осуществляют забор крови из периферической вены, выделяют из нее лимфоциты, определяют на них с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции экспрессию поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости, и если она снижена на 50% и более от уровня экспрессии этих молекул на лимфоцитах у клинически здоровых лиц, то судят об иммуносупрессии.

Способ оценки функционального состояния иммунной системы у пациентов с повреждением головного мозга путем забора крови из периферической вены и выделения из нее лимфоцитов, отличающийся тем, что на лимфоцитах определяют экспрессию поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости и при ее снижении на 50% и более от уровня экспрессии этих молекул на лимфоцитах у клинически здоровых лиц судят о подавлении функциональной активности иммунной системы.