СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У ПАЦИЕНТОВ С ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования иммунитета, и может быть использовано для определения функционального состояния иммунной системы у пациентов с термической травмой.

Известен способ оценки функционального состояния иммунной системы у пациентов с термической травмой путем исследования периферической крови и определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину-2 (CD25) и трансферрину (CD71) (Maldonado M. D., Venturoli A., Franco A., Nunez-Roldan A. Specific changes in peripheral blood lymphocyte phenotype from burn patients. Probable origin of the thermal injury-related lymphocytopenia. // Burns. - 1991. -V. 17. -N 3. -P. 188-192).

Однако известный способ позволяет оценить функциональное состояние лишь отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

В качестве прототипа нами выбран способ оценки функционального состояния иммунной системы у пациентов с термической травмой, заключающийся в заборе крови, выделении сыворотки и определении в ней различных цитокинов, маркеров активации иммунной системы (O' Riordain D.S., Mendez M.V., O' Riordain M.G. at al. Molecular mechanism of decreased interleukin-2 production after thermal injury // Surgery. - 1993. -V. 113. - P. 407-415).

Однако специфичность клеток продуцентов в отношении цитокинового профиля заставляет для получения информации о функциональном состоянии всей совокупности иммунокомпетентных клеток пользоваться очень широкой панелью исследуемых цитокинов. Кроме того, период полураспада ряда цитокинов - показателей активации определенных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, очень небольшой и в процессе обработки периферической крови концентрация этих цитокинов может существенно изменяться. Это существенно ограничивает возможности исследования у пациентов в клинике термических поражений.

Задача предлагаемого изобретения - повышение достоверности результатов и снижение затрат на их получение за счет исследования стабильного интегрального показателя функциональной активности иммуноцитов.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови из периферической вены и получение сыворотки, определяют содержание растворимых форм молекул главного комплекса гистосовместимости I класса и при их повышении на 50% и более от уровня этих молекул у клинически здоровых лиц судят о повышении функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

Способ осуществляют следующим образом: забирают кровь из периферической вены (5-6 мл) в сухие пробирки. Для образования сгустка образцы крови последовательно выдерживают по 30' в термостате при температуре +37^oС и в холодильнике при температуре +4^oС. После этого свернувшуюся кровь центрифугируют при 200 g 15 минут. Сыворотку отбирают в сухие чистые пробирки.

В лунки планшетов для иммуноферментного анализа сорбируют моноклональные антитела ИКО-53. Сорбирование проводят в течение 16-18 часов при температуре +4-8^oС. После отмывания не связавшихся моноклональных антител в лунки наносят образцы исследуемых сывороток с последующей инкубацией планшетов в течение 1 часа при комнатной температуре и отмывкой несвязавшихся белков. Затем лунки планшетов в тех же условиях обрабатывают рабочим раствором очищенных моноклональных антител ИКО-216, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для каждого образца ставят отрицательный контроль. С этой целью используют образцы поликлональных мышиных антител, меченных пероксидазой хрена и разведенных в той же концентрации, что и моноклональные антитела ИКО-216. После заключительного отмывания несвязавшегося конъюгата, реакцию проявляют раствором 0,1%-ного ортофенилендиамина в 0,05 М нитратном буферном растворе рН 5,0, содержащем 0,01% перекиси водорода. Реакцию останавливают 1М раствором H₂SО₄ и учитывают результаты с помощью фотометра при длине волны 492 нм. Для определения нормального уровня содержания растворимой формы HLA-I в сыворотке крови исследуют образцы сывороток клинически здоровых доноров. При повышении уровня растворимой формы HLA-I по сравнению с нормой на 50% и более судят об активации иммунокомпетентных клеток.

Примеры применения
При исследовании уровня растворимой формы HLA-I в сыворотке крови 30 здоровых доноров показано, что ее содержание в норме было 1150±90 условных единиц (у.е.).

При обследовании пациента С. с диагнозом: ожог пламенем вольтовой дуги 60% п. т. , ожог верхних дыхательных путей, крайне тяжелый ожоговый шок (возраст 26 лет, N ист. болезни 185574, травма от 02.03.99 г.), уровень растворимой формы HLA-I в сыворотке крови составил:
04.03.99 - 1920 у.е. При одновременном исследовании содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом - CD25⁺ клетки - 12% (N - 16%), В-лимфоцитов с активационным фенотипом - HLA-DR⁺ лимфoциты - 62% (N - 34%), количество естественных киллеров - CD 16⁺ клетки - 17% (N - 15%).

11.03.99 - уровень sHLA-I - 1500 у.е. При одновременном исследовании содержание CD25⁺ клеток - 14%, HLА-DR⁺ лимфоцитов - 67%, CD 16⁺ клеток - 16%.

22.03.99 - уровень sHLA-I - 980 у.е. При одновременном исследовании содержание CD25⁺ клеток - 15%, HLА-DR⁺ лимфоцитов - 30%, CD16⁺ клеток - 13%.

В дальнейшем мембранные показатели активации и содержание sHLA-I в сыворотке крови находились недостоверно ниже нормы. Пациенту проведено три операции аутопластики ожоговой раны. Осложнений ожоговой болезни не было. 13.05.99 выписан на амбулаторное лечение по месту жительства.

Пациент X. Поступил в клинику с диагнозом: ожог пламенем 60% п.т., ожог верхних дыхательных путей, крайне тяжелый ожоговый шок (возраст 39 лет, N ист. болезни 186138, травма от 07.04.99 г.), уровень растворимой формы HLA-I в сыворотке крови составил:
09.04.99 - 190 у.е. При одновременном исследовании содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом - CD25⁺ клетки - 6%, В-лимфоцитов с активационным фенотипом - НLА-DR⁺ лимфоциты - 26%, количество естественных киллеров - CD16⁺ клетки - 4%.

13.04.99 - уровень sHLA-I - 230 у.е. При одновременном исследовании содержание CD25⁺ клеток - 4%, НLА-DR⁺ лимфоцитов - 15%, CD16⁺ клеток - 5%. У пациента развилась мелкоочаговая, двусторонняя пневмония, острая язва 12-п кишки, множественные эрозии желудка. Несмотря на проводимую интенсивную терапию, 13.04.99 пациент погиб.

Из приведенных примеров видно, что увеличение повышения уровня растворимой формы HLA-I по сравнению с нормой на 50% и более сопровождается увеличением экспрессии и других ранних маркеров активации различных разновидностей иммунокомпетентных клеток. С другой стороны, снижение сывороточного уровня растворимой формы HLA-I, наоборот, сопровождается уменьшением количества различных популяций иммунокомпетентных клеток с активационным фенотипом. При этом наблюдались инфекционные осложнения ожоговой болезни, в результате которых пациент погиб.

Способ оценки функциональной активности иммунной системы при ожоговой болезни позволяет с достаточной достоверностью оценить функциональное состояние клеток иммунной системы при низких затратах и небольшом времени исследования. Способ информативен, выполним в условиях специализированного стационара и может быть использован в клинической практике.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Способ обеспечивает повышение достоверности результатов и снижение затрат на их получение за счет исследования стабильного интегрального показателя функциональной активности иммуноцитов. Проводят у пациентов с термической травмой забор крови из периферической вены и получают сыворотку, при этом в полученной сыворотке определяют содержание растворимых молекул гистосовместимости 1 класса и при его повышении на 50% и более от уровня этих молекул у клинически здоровых лиц судят о повышении функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

Способ оценки функционального состояния иммунокомпетентных клеток у пациентов с термической травмой путем забора крови из периферической вены и получения сыворотки, отличающийся тем, что в полученной сыворотке определяют содержание растворимых молекул гистосовместимости 1 класса и при его повышении на 50% и более от уровня этих молекул у клинически здоровых лиц судят о повышении функциональной активности иммунокомпетентных клеток.