СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования иммунной системы, и может быть использовано для определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой.

Известен способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы, заключающийся в исследовании периферической крови и определении на иммунокомпетентных клетках поверхностных активационных рецепторов (см. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М., 1997, стр.99-109).

Однако при этом способе в процессе выделения и подготовки клеток теряется часть рецепторов, что ведет к искажению истинной картины состояния иммунной системы.

В качестве прототипа выбран способ определения функционального состояния иммунной системы, заключающийся в заборе крови из периферической вены, выделении мононуклеарных клеток, инкубации их в культуральной среде с добавлением митогенов (ФГА, Кон-А, ЛПС, митоген лаконоса) в термостате при 37^oC во влажной среде и 5% CO₂ в течение 72 ч и последующей оценке пролиферативной активности лимфоцитов морфологическим способом или с применением радиоактивного раствора H³-тимидина (см. Сачек М.Г., Косинец А.Н., Адаменко Г.П. Иммунологические аспекты хирургической инфекции. Витебск, 1994, стр. 38,39.)
Однако известный способ трудоемкий, требует дорогостоящего оборудования, стерильных условий и обучения персонала навыкам работы с культурами клеток. Кроме того, этот способ длителен в исполнении, что делает его непригодным в клинической практике.

Задачей предлагаемого изобретения является сокращение времени, затрачиваемого на проведение исследования.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови из периферической вены и выделение мононуклеарных клеток, клетки разделяют на опыт и контроль, в опыт добавляют моноклональные антитела против CD95- рецептора, в контроль - поликлональные антитела, инкубируют клетки в течение часа, выделяют ДНК, проводят электрофорез исследуемых образцов, определяют низкомолекулярную фрагментацию ДНК и при ее отсутствии в контрольном образце с одновременным наличием в опытном образце судят об активации иммунокомпетентных клеток периферической крови, а при отсутствии различий в электрофоретических картинах опыта и контроля констатируют отсутствие активации клеточного звена иммунной системы.

Способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы при термической травме осуществляют следующим образом: забирают кровь из периферической вены (5-6 мл) в пробирки с гепарином (5 ЕД/мл). Затем разводят кровь ЗФР в соотношении 1:1 и наслаивают 10 мл разведенной крови на одноступенчатый фиколл - тразограффовый градиент (плотность 1.077), откручивают при 200 G в течение 40 мин, выделяя мононуклеарные клетки. Выделенные мононуклеарные клетки отмывают два раза в избытке ЗФР и приготавливают суспензию клеток на ЗФР с концентрацией 5-6 • 10⁶/мл, которую вносят по 1 мл в две пластиковые микропробирки (на 1.5 мл). В опытную микропробирку добавляют 0.1 мл раствора моноклональных антител ИКО-160 (против CD95-рецептора) в концентрации 10-50 мкг/мл, в контрольную микропробирку - 0.1 мл поликлональных антител (мышиных иммуноглобулинов) в той же концентрации. Инкубируют образцы 1 ч в термостате при 37^oC. Для выделения ДНК после завершения инкубации микропробирки центрифугируют при 5-7 тысячах об/минуту 3-5 мин. Удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл дистиллированной воды. К полученным суспензиям клеток добавляют по 50 мкл лизирующего буфера, тщательно перемешивают на вортексе 1 мин, приливают к лизату 300 мкл буфера для осаждения белков, тщательно перемешивают и откручивают при 10-15 тысячах об/минуту 10 мин. После откручивания по 300 мкл водной фазы переносят в чистые пластиковые микропробирки (на 1.5 мл). В каждую микропробирку добавляют 300 мкл изопропилового спирта. Растворы тщательно перемешивают, охлаждают при -20^oC в течение 15-20 мин и центрифугируют при 10-15 тысячах об/минуту 15-20 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, добавляют 100 мкл 70% этилового спирта и центрифугируют их при 10-15 тысячах об/минуту 5 мин. Этиловый спирт осторожно отбирают, микропробирки высушивают до исчезновения запаха спирта. Для растворения выделенной ДНК в пробирку добавляют 20 мкл бидистиллированной воды (воды для инъекций) и дают постоять 15-25 мин. Затем в пробирки вносят по 10 мкл бромфенолового синего, переносят по 10 мкл исследуемых растворов в лунки на 1.5% агарозном геле и проводят горизонтальный электрофорез на фосфатном буфере с pH 7,2 в течение 30 мин. После этого с помощью трансиллюминатора определяют низкомолекулярную фрагментацию ДНК (200, 300 и 500 п.н.) в опытном и контрольном образцах. При отсутствии низкомолекулярной фрагментации ДНК в контрольном образце и одновременном ее наличии в опытном образце делают вывод об активации иммунокомпетентных клеток периферической крови, а при отсутствии различий в электрофоретических картинах опыта и контроля констатируют отсутствие активации клеточного звена иммунной системы.

Примеры практического применения:
а) Больной Берестнев А.В., 39 лет, история болезни N 185720. Травма от 15.3.99. Диагноз: ожог пламенем II-III АБ степени туловища, головы, верхних конечностей на площади 30% поверхности тела. Ожог верхних дыхательных путей. Крайне тяжелый ожоговый шок. Колото-резаные раны верхних конечностей. При исследовании иммунного статуса 14.04.99 экспрессия активационных рецепторов снижена (CD25-2%+, CD71-5%+, CD26-3%+, HLA- DR-12%++). Вместе с тем, в контрольном образце признаков низкомолекулярной фрагментации ДНК не выявлено, но при инкубации с МКА против CD95-рецептора получены выраженные признаки низкомолекулярной фрагментации ДНК. Принято решение не применять медикаментозную иммуностимуляцию. Пациент прошел комплексное лечение по существующей в институте схеме. Инфекционных осложнений не было. 13.05.99 выписан на амбулаторное лечение по месту жительства.

б) Больной Павлов Е. С. , 15 лет, история болезни N 186458. Травма от 25.04.99. Диагноз: ожог пламенем лица, шеи, туловища, верхних конечностей, бедер I-II-III АБ степени на площади 70% поверхности тела. Баротравма. При исследовании иммунного статуса 29.04.99 CD25- 5%+, CD71-3%+, CD26-3%+, HLA-DR-6%++, 05.05.99 CD25-29%++, CD71-18%++, CD26-8%+++, HLA-DR-13%+++. 06.05.99 признаков низкомолекулярной фрагментации ДНК в контрольном образце нет, одновременно получены выраженные признаки низкомолекулярной фрагментации ДНК в опыте. Принято решение специальной иммуностимулирующей терапии не назначать. Инфекционных осложнений не было. Пациент выписан домой на амбулаторное лечение.

в) Больной Садков Д. А. , 26 лет, история болезни N 185574. Травма от 03.03.99. Диагноз: электротравма. Ожог пламенем II-III АБ степени на площади 60% поверхности тела. Крайне тяжелый ожоговый шок. При исследовании иммунного статуса 04.03.99 CD25-12%++, CD71-2%+, CD26-3%+, HLA-DR-62%++, 11.03.99 CD25-38%+, CD71-29%+, CD26-4%+, HLA-DR-67%++, 13.4.99 CD25- 5%+, CD71- 4%+, CD26-8%+, HLA-DR-10%+++. При исследовании ДНК 12.3.99 и 13.4.99 признаков низкомолекулярной фрагментации ни в опытном, ни в контрольном образце получено не было. Было принято решение включить в комплекс лечебных мероприятий иммуностимуляторы различного действия. Несмотря на это на фоне выраженной интоксикации у пациента развилась пневмония, явления которой были купированы медикаментозной терапией. После успешно проведенного лечения 13.5.99. пациент выписан домой на амбулаторное лечение.

Способ определения функциональной активности клеточного звена иммунной системы при термической травме позволяет сократить время, затрачиваемое на выполнение исследования, определяет с достаточной достоверностью состояние иммунной системы. Способ информативен и выполним в условиях специализированного медицинского учреждения, и может использоваться в клинической практике.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам исследования иммунной системы, и может быть использовано для определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой. Способ обеспечивает сокращение времени, затрачиваемого на проведение исследования. Осуществляют забор крови из периферической вены, выделение мононуклеарных клеток, разделение их на опытный образец, в который добавляют моноклональные антитела против CD95-рецептора, и контрольный образец, в который добавляют поликлональные антитела, инкубацию образцов, выделение ДНК из исследуемых клеток и определение методом горизонтального электрофореза низкомолекулярной фрагментации ДНК, по которой судят о наличии или отсутствии активации клеточного звена иммунной системы.

Способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы при термической травме, заключающийся в заборе крови из периферической вены и выделении мононуклеарных клеток, отличающийся тем, что клетки разделяют на опыт и контроль, в опыт добавляют моноклональные антитела против CD95 - рецептора, а в контроль - поликлональные антитела, инкубируют клетки в течение часа, выделяют ДНК, проводят электрофорез исследуемых образцов, определяют низкомолекулярную фрагментацию ДНК и при ее отсутствии в контрольном образце с одновременным наличием в опытном образце судят об активации иммунокомпетентных клеток периферической крови, а при отсутствии различий в электрофоретических картинах опыта и контроля констатируют отсутствие активации клеточного звена иммунной системы.