СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/205 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин против бешенства животных.

Известен способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию вируса бешенства штамм "Щелково-51" в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию стабилизатора - полиакриловую кислоту или ее соль, затем инактиватора - димер этиленимина ((ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%, инкубации смеси при 37^oС в течение 20-24 ч с последующей расфасовкой полученной вакцины для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде ((RU 2134590 С, опубл. 20.08.1999).

Однако в известном способе ДЭИ используют в высокой концентрации, что приводит к значительной потере первоначальной иммуногенной активности вируса в процессе изготовления вакцины.

Кроме того, в получаемом материале, особенно на первых этапах репродукции, содержится значительное количество неполноценных дефектных вирионов, что не в полной мере способствует проявлению иммуногенной потенции штамма "Щелково-51".

Наиболее близким аналогом является способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию штамма вируса бешенства "Щелково-51" в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию инактиватора бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при температуре 4-6^oС в течение 2-4 ч с последующим добавлением стабилизирующей среды на основе пептона, сахарозы и желатина, и адъюванта сапонина (RU 955577 А, опубл. 15.08.1994).

Недостатком ближайшего аналога является то, что по существующей технологии обязательна стадия получения посевного материала путем размножения вируса "Щелково-51" в мозге овец. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины, как следствие этого, распространение прионовой инфекции среди прививаемого поголовья сельскохозяйственных и домашних животных. Поэтому процесс получения мозгового посевного материала является очень ответственной, трудоемкой и дорогостоящей операцией, связанной с тщательным отбором животных и контролем мозговой вируссодержащей ткани и изготовленных серий вакцины на наличие посторонних агентов.

Задачей изобретения является усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма "Щелково-51".

Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении затрат, повышении иммуногенности и безопасности получаемой вакцины за счет получения полноценных вирионов с полным спектром антигенов и исключения возможности включения в ее состав возбудителя скрейпи.

Сущность изобретения. Способ получения антирабической вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, и отличается тем, что посевной материала получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД₅₀, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38^oС.

Для получения посевного материала полностью исключаются овцы. В результате термообработки в термостабильной популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. Кроме того, эффективность культивирования вируса, прошедшего термическую стадию обработки, значительно выше по сравнению с контролем, что проявляется как в динамике накопления вируса, так и в повышении выхода вируса в целом (увеличивается количество сборов вируса).

Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток ВНК-21, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды 199, среды Игла и 10%-ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток отделяют от поверхности стекла бутылей общепринятым способом, например с помощью версена и трипсина, и ресуспендируют в ростовой среде.

Полученную клеточную взвесь заражают посевным материалом, подготовленным следующим образом: исходный производственный штамм вируса бешенства "Щелково-51" подвергают термообработке до сохранения им инфекционной активности от 0,0001 до 0,001% интрацеребральных мышиных ЛД₅₀.

Для этого первично репродуцированный вирус пассируют в культуре клеток ВНК-21 при температуре 37,5^oС в течение 140-160 ч. Далее вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют в качестве посевного материала для инфицирования и репродуцирования в культуре клеток ВНК-21.

Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37^oС. Затем проводят сбор вируссодержащей жидкости на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки культивирования. Замену ростовой питательной среды проводят после каждого сбора вируса. Начиная с 4-х суток культивирования включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Полученные сборы инактивируют известным способом, например бетапропиолактоном или ДЭИ.

Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания.

Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант - 6%-ную гидроокись алюминия.

Готовые вакцины проходят биологический контроль на белых мышах по методу NIH (Института здравоохранения США). Индексы иммуногенности вакцин, полученных согласно изобретению, намного выше, чем у вакцин, полученных по известным технологиям. Данные контроля приведены в таблице.

Как видно из таблицы, полученная вакцина имеет высокую иммуногенную активность при более производительном и технологичном способе изготовления.

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин. Способ включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса и последующее приготовление целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21. При этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД₅₀. Полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38^oС. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства. Этот эффект объясним тем, что в результате термообработки в популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличающийся тем, что посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД₅₀, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что термическую обработку проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38^oС.