ВНК-21/13-13-ПЕРЕВИВАЕМАЯ МОНОСЛОЙНО-СУСПЕНЗИОННАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ НОВОРОЖДЕННОГО СИРИЙСКОГО ХОМЯЧКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА И ВИРУСА БЕШЕНСТВА Российский патент 2015 года по МПК C12N5/71 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, сфере суспензионного культивирования перевиваемых культур клеток ВНК-21 и может быть использовано для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, САТ-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», в свою очередь используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Уровень техники

Из уровня техники известна перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13, полученная в 1961 году в Англии Макферсоном и Стокером /Macpherson J, Stoker M. - Syrian hamster fibrolast cell line ВНК-21 snd its derivatives. - Nature, 1964, 203, 1355-1357/.

Известны следующие аналоги клеток почки хомячка.

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита.

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС;

3. ВНК-21 /2-17а - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток, получен во ВНИЯИ;

4. ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства, получена ФГУП «Щелковский биокомбинат».

Ниже представлено более подробное описание аналогов.

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка поддерживалась в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР / С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 60/.

Среда культивирования. Адаптирована к выращиванию в пристеночных культурах. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°C.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 дней. В литровом матрасе РУ накапливается 40-45 млн клеток.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.

Кариология. Культура резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.

Среда замораживания. Среда культивирования (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность в пределах 85-95%. Культуры восстанавливают исходные ростовые свойства на 2-3 пассаже.

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, получена в НИИС / С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 6-1/.

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания применяют среду Игла-МЕМ, обогащенную 120 мг/л серина и 610 мг/л глутамина с добавлением 0,25% ГЛА и 10% сыворотки крови КРС. При пристеночном культивировании употребляют среду Игла MEM (90%) и сыворотку КРС (10%) рН 7,5-7,6.

Способ поддержания. Поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. Сохранила способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до 37°C.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс. клеток на мл обеспечивает 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки роста. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки после посева и переживает не более 3-х дней.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.

Кариология. Популяция гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность на уровне 88-96%. Культуры восстанавливаются на 1-2 пассаже.

3. ВНК-21/2-17а - перевиваемый монослойно-суспеизионный клон клеток /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 62/ ,получен во ВНИЯИ и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.

Среда культивирования. 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), согласно прописи модифицированной среды Игла и 8 витаминов группы В, сыворотка КРС (5%), рН среды 6,8-7,2.

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают объемно-доливным методом. Монослойную культуру в пристеночных сосудах любой емкости. При очередном пересеве применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн/мл. При выращивании в монослое при посевной концентрации 50-100 тыс. клеток на мл среды монослой образуется на 2-3 сутки роста.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%.

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность 85-90%, клетки восстанавливают морфологию и ростовые свойства на 2-3 пассаже.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия.

4. Наиболее близкой к заявляемому изобретению является ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная на Щелковском биокомбинате и предназначенная для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, вируса бешенства шт. "Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства (RU 2300562, МПК: C12N 5/06).

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,0 lg ТЦД_50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1 мг/мл, а также чувствительны к вирусу бешенства, обеспечивая титр инфекционности 6,5 lg ЛД_50/мл.

ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка адаптирована к суспензионному способу культивирования с использованием питательной среды для суспензионного культивирования на основе солевого раствора Хенкса, содержащая 5-7% сыворотки, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина с добавлением пяти аминокислот: 1-аргинина 0,042 г/л; 1-глутамина 0,584 г/л; 1-тирозина 0,02 г/л; 1-триптофана 0,015 г/л; 1-цистина 0,032 г/л и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034, пантотенат кальция (В5) 0,0034, пиридоксаль HCl 0,0034, тиамин (B₁) 0,0034, миоинозит 0,0068, никотинамид (РР) 0,0034, рибофлавин (В₂) 0,00034, фолиевая кислота (В₉) 0,0034.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгломератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-3-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Также отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.

Способ культивирования: монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в матрацах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:9 при температуре 37°C. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации. В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.

Кариологическая характеристика: кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом (n=44).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является получение культуры клеток ВНК-21/13-13, предназначенной для репродукции в промышленных условиях вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3, вируса бешенства шт. "Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Технический результат достигается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-21/13-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах.

Поставленная задача решается получением ВНК-21/13-13 - перевиваемой монослойно-суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка, депонированной в Российской коллекции клеточных культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89, предназначенной для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, САТ-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Заявляемые клетки характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,0 lg ТЦД_50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1,5 (в наиболее близком аналоге, с использованием культуры клеток ВНК 13/02 - до 1) мг/мл, повышенной чувствительностью к вирусу бешенства, соответствующей титру от 6,5 до 8,0 lg ЛД_50/мл, и увеличенным выходом клеток, индекс пролиферации которых при суспензионном культивировании равняется 6-8 и достигает концентрации к 48 часам 4·10⁶ клеток/мл при жизнеспособности 95-98%. С помощью заявляемых клеток получают на 50% больше конечного продукта по сравнению с аналогом.

Заявляемые преимущества обусловлены генетическими характеристиками созданной линии клеток ВНК-21/13-13 (подтвержденными протоколом ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии), которая была модифицирована путем многократных пассажей суспензии с использованием питательной среды оригинального состава, которая была подобрана опытным путем и многократно проверена в лабораторных условиях.

Осуществление изобретения

ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка адаптирована к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания, содержащей натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый 7-водный, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий углекислый кислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, D-кальций пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамина гидрохлорид, миоинозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу или декстрозу моногидрат, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат, противогрибковый препарат и дистиллированную воду или суперочищенную апирогенную воду, при этом в качестве противогрибкового препарата среда содержит нистатин, растворенный в растворе гидроокиси натрия с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л и дополнительно содержит холина хлорид и янтарную кислоту (бутандикислоту), причем бензилпеницилин натриевую соль используют с активностью 0,09×10⁵ - 1,1×10⁵, а канамицина сульфат - с активностью 0,09×10⁵ - 1,1×10⁵, при следующем содержании компонентов, г/л:

Нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ Д/л 0,0098-0,0102 Бензилпеницилина натриевая соль с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵ 0,05-0,07 Канамицина сульфат с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵ Ед/л 0,14-0,16 Глюкоза или Декстроза моногидрат 3,5-3,7 D-кальций пантотенат 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,07 Калий хлористый 0,3-0,5 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,10-0,20 Кальций хлористый фармакопийный 0,26-0,30 Ферментативный гидролизат лактальбумина 1,15-1,30 Ферментативный гидролизат мышечных белков 1,15-1,30 L-аргинин 0,040-0,044 L-глутамин 0,58-0,60 L-тирозин 0,018-0,022 L-триптофан 0,018-0,022 Магний сернокислый, 7-водный 0,15-0,25 Мио-инозит 6,4×10^-3-7,0×10^-3 Натрий углекислый кислый 0,30-0,40 Натрий хлористый 7,5-8,5 Никотинамид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Пиридоксаль гидрохлорид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Рибофлавин 3,2×10^-4-3,5×10^-4 Тиамина гидрохлорид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Фолиевая кислота 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Холина хлорид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Кислота янтарная (бутандикислота) 0,065-0,095 Натрий гидроокись 7,38-9,24×10^-3 Вода дистиллированная или суперочищенная апирогенная остальное

При этом растворение нистатина (полиенового противогрибкового антибиотика, который является высокоактивным в отношении дрожжеподобных грибов) проводят в растворе щелочи. Преимуществом питательной среды данного состава является использование химически стабильного раствора щелочи, в котором происходит полное растворение антибиотика и сохранение его активности. Добавление янтарной кислоты в состав питательной среды обеспечивает стабилизацию конечной величины рН, буферной емкости среды, что гарантирует лучшие ростовые свойства для клеток животного происхождения.

Полученная ВНК-21/13-13 депонирована в Российской коллекции клеточных культур в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (РККК) (СХЖ РАСХН) ВИЭВ при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. Линии клеток присвоен коллекционный №89.

Происхождение. Перевиваемая линия клеток ВНК-21/13-13 выделена из линии клеток ВНК-21/13-02 запатентованной 31.05 2005 г., патент №2300562. Линия клеток ВНК-21/13-02 находится в ФКП «Щелковский биокомбинат».

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными клетками, возможно формирование отдельных клеточных конгломератов, состоящих из 5-10 клеток. Клетки фибробластоподобные с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Способ культивирования: В суспензии культуру клеток выращивают в течение 48 часов до 50 последовательных пассажей.

Условия культивирования: суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4-40-100-600-2000 литров с рабочим объемом 3-30-60-450-1800 литров соответственно при следующих параметрах:

- посевная концентрация 0,4-0,5·10⁶ кл/мл;

- скорость перемешивания 25-40 об/мин;

- температура культивирования 36,0-36,5°C;

- рН среды в пределах 6,5-7,15;

- аэрация путем барботирования воздухом 0,5-1,5 л/л среды.

Индекс пролиферации при суспензионном культивировании равняется 6-8, концентрация к 48 часам достигает 4·10⁶ клеток/мл при жизнеспособности 95-98%.

Культура ВНК-21/13-13 выделена из культуры ВНК-21/13-02 путем многократного пассирования в суспензионных условиях (49 пассажей в суспензии) из-за чего изменилась кариологическая характеристика.

Кариологическая характеристика: согласно акту лаборатории ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, составленному по результатам цитогенетических исследований культуры клеток ВНК-21/13-13, проведенные цитогенетические исследования позволили заключить, что число диплоидных метафазных пластинок 2n=44 составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками содержащими 30 хромосом, что составляет 43%.

Таблица 1 Интервал изменчивости числа хромосом в культуре клеток ВНК-21/13-13 Количество хромосом 20-24 26 30 35-36 44 64 % 18 3 43 17 17 2

Было проведено молекулярно-генетическое исследование образца клеточной культуры (ВНК-21/13-13) на предмет соответствия изначальной видовой принадлежности Mesocricetus auratus.

Методы исследования. Выделение ДНК из суспензии клеток (10000 клеток/мл) проводили с использованием набора реагентов «Рибо-Преп» (Амплисенс, Россия) согласно прилагаемой инструкции. Определение видовой принадлежности исследуемой культуры клеток проводили с использованием методики видоспецифической ПЦР, разработанной в лаборатории ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. Для исключения возможной контаминации культуры клетками, полученными от других видов животных и человека, одновременно проводили видоспецифическую ПЦР с использованием набора видоспецифических праймеров для определения видовой принадлежности 12 видам животных.

Результаты: В исследуемом образце клеточной культуры присутствует ДНК сирийского хомячка и отсутствует ДНК человека, свиньи, кошки, овцы, лошади, зеленой мартышки, собаки, кролика, коровы, крысы и мыши.

Криоконсервация, жизнеспособность после консервации. Для длительного хранения в жидком азоте (минус 196°C) используют ампулы, заполненные суспензией клеток с концентрацией 30-35 млн клеток/мл. Консервирование клеток проводят в питательной среде (73%), сыворотке (20%), диметилсульфоксид (7%). Замораживание суспензии клеток осуществляют по 2-х ступенчатому режиму понижения температуры от 0 до минус 30°C со скоростью 1°C в минуту, от минус 30°C до минус 70°C со скоростью 4-6°C в минуту. Охлажденные до минус 70°C ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (минус 196°C), предварительно подержав ампулы в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации составляет 98-99%.

Линию клеток получили следующим образом.

В качестве исходного материала использовали ВНК-21/13-02 - перевиваемую монослойно-суспензионную сублинию клеток почки новорожденного сирийского хомячка, находящуюся на хранении в Российской коллекции клеточных культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №61, а также в ФКП «Щелковский биокомбинат». Суспензионное культивирование проводили в биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) и в промышленном 130-литровом биоферментере Applikon (Голландия) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), концентрации растворенного кислорода DO (10-30%), температуры (36,5-37°C), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили, используя питательную среду перечисленного выше состава. При этом в процессе культивирования в питательную среду добавляли 7% по объему сыворотки крупного рогатого скота (КРС).

Засевная концентрация клеток составляла 500 тыс. клеток/мл, за время генерации (48 часов) концентрация клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз.

После проведения 49 пассажей в суспензии были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера с небольшим количеством конгломератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 6-7).

Культура клеток прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

Данные кариологического анализа, проведенного методом Moorhead Р.З. et al 1960 г., адаптированной суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-13 соответствуют кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку составляет от 20 до 64, модальный класс (43%) составляют клетки, содержащие 30 хромосом.

Концентрация клеток ВНК-21/13-13, выращенных в биореакторах промышленных объемов в среде, содержащей 0,25% по объему гидролизата и 7% по объему сыворотки, отличается высокой пролиферативной активностью и составляет от 2,0 до 4,0 млн клеток/мл.

Клетки ВНК 21/13-13 являются перспективной клеточно-культуральная системой, предназначенной для промышленного получения вируссодержащей культуральной жидкости для изготовления иммуногенных инактивированных антирабических вакцин и противоящурных вакцин. Линия клеток ВНК 21/13-13 позволяет получать вирусы бешенства и ящура в промышленных масштабах и использовать их (вирусы) для изготовления безвредных высокоиммуногенных антирабических вакцин и противоящурных вакцин. В частности, суспензионное культивирование клеток ВНК 21/13-13 с последующим их инфицированием вирусом бешенства позволяет стабильно получать высокоактивный вируссодержащий материал и готовить из него инактивированные антирабические вакцины с иммуногенной потенцией, превосходящей международный стандарт в 2,5 раза (Индекс иммуногенности равен 2,5).

Изобретение относится к области биотехнологии. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка задепонированна в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89 и предназначена для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства. Результат, достигаемый при использовании данной клеточной культуры, заключается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-21/13-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах. 1 табл.

ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, депонированная в Российской коллекции клеточных культур (РККК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89, предназначенная для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.