СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/205 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии, а именно к способу получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства посредством непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, позволяющему в промышленных объемах получать инактивированную вакцину против вируса бешенства с высокой концентрацией инфицированных вирусом клеток, высоким титром инфекционной активности вируса и высокой иммуногенностью получаемой вакцины.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В мероприятиях по профилактике заболевания бешенством первостепенную роль играют вакцины.

На сегодняшний день существует как ряд известных вакцин против вируса бешенства, так и ряд способов их получения.

Известен способ получения антирабической вакцины (патент RU №2134590, 1999), включающий выращивание вируса бешенства в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в течение 96-144 ч, внесение в вируссодержащую суспензию сначала стабилизатора белковых вирусных антигенов (полиакриловая кислота или ее железная соль в концентрации 0,7-1,0%), затем инактиванта вирусного генома (димер этиленимин в концентрации 0,1-0,3%) с дальнейшим инкубированием при 37°С в течение 20-24 ч. Полученный вируссодержащий материал используют в качестве жидкой или сухой вакцины. Однако указанный способ не обеспечивает достаточно выраженный эффект стабилизации протективных вирусных антигенов и не обеспечивает высокой плотности клеток.

Известен способ получения антирабической вакцины (Патент RU №2191600, 2002), включающий репродукцию вируса бешенства в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 на роллерных установках при температуре 37-38°С в течение 140-160 ч. Этот вирусный материал с низкой удельной инфекционной активностью в пределах 0,001-0,0001 ММЛД₅₀/КЛ используется для заражения производственной роллерной расплодки клеток, которые культивируются в тех же условиях, периодически рассеваются в отношении 1:4 с использованием свежей поддерживающей среды в течение 5-6 суток и при этом трижды производится сбор вируссодержащей культуральной жидкости. Полученный в результате материал пригоден для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с характеристиками иммуногенности по NIH на уровне 2,3-2,5 МЕ/мл. Недостатком данного способа является то, что его промышленная реализация сопровождается многочисленными трудоемкими операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Кроме того, полученный таким способом вирусный материал содержит недостаточно стабилизированный антиген с деструктурированным гликопротеином, что снижает эффективность вакцины. Данный способ изготовления вакцины приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах.

Известен способ получения антирабической вакцины, включающий культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта (Патент RU №2287343, МПК A61K 39/205, опубл. 20.11.2006), причем инфицирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21 проводят вирусом бешенства штамм Щелково-51 из расчета 0,01-0,001 МЛД₅₀/КЛ, культивирование проводят в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии и 5-6 суток на микроносителях с ежесуточным сбором вируссодержащего материала, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Указанный способ трудоемок в связи с необходимостью проведения сложных процедур подготовки микроносителей к посеву клеток, снятия клеток с микроносителей и последующего отделения клеточно-вирусной суспензии от микроносителей. Эти технологические процедуры ухудшают воспроизводимость результатов, занимают много времени и не позволяют гарантировать качество целевого продукта. Кроме того, полученный таким способом антиген недостаточно стабилен, а поверхностный белок (гликопротеин) значительно деструктиризирован.

Таким образом, в области ветеринарии сохраняется потребность в высокопроизводительном способе получения вакцины против вируса бешенства в промышленном масштабе.

Непрерывное культивирование клеток с применением перфузионных процессов представляет собой перспективный метод, используемый в промышленной биотехнологии при наработке в клетках различных вирусов, белков, в том числе терапевтического назначения.

В WO 2005095578 раскрыто, что с помощью перфузионного культивирования клеток животных, в частности клеток млекопитающих, или дрожжевых клеток согласно изобретению можно получить чрезвычайно высокую плотность жизнеспособных клеток, тогда как клеточная культура дополнительно демонстрирует чрезвычайно высокую жизнеспособность клеток.

В US 6 544 424 раскрыт процесс перфузии. Хотя в этом документе упоминается, что этот способ может быть использован для культивирования клеток животных с перфузией, он не раскрывает и не предполагает чрезвычайно высоких плотностей клеток, обнаруженных в настоящем изобретении. Кроме того, в US 6544424 В1 раскрыто, что процесс перфузии может уменьшить прикрепление и рост препятствия на поверхности мембраны полых волокон, но он не раскрывает и не предполагает, что клетки в самой клеточной культуре будут агрегироваться меньше.

Voisier и др. (Биотехнология. Биоинженерия. 82 (2003), 751-765) рассматривают различные методы удержания клеток в высокоплотной перфузионной культуре суспендированных клеток млекопитающих.

Ни одна из рассмотренных систем удержания клеток не способна обеспечить чрезвычайно высокую плотность жизнеспособных клеток в сочетании с чрезвычайно высокой жизнеспособностью клеток. Кроме того, клетки, выращенные в химически определенной среде, чувствительны к силе сдвига, что потенциально приводит к снижению роста клеток. Это также является существенной проблемой.

В RU 2672318 С1 раскрыт способ непрерывного культивирования линии клеток яичника китайского хомячка СНО, причем включает непрерывное культивирование линии клеток яичника китайского хомячка СНО в биореакторе, ускорение перфузии, находящееся в диапазоне от 0,1*сутки^-2 до 0,12*сутки^-2, и отвод суспензии клеток из биореактора, осуществляемый со скоростью 0,15*сутки^-1. Указанный способ применяют для продукции терапевтических антител в линии клеток яичника китайского хомячка СНО. Указанный способ не предполагает его применение для получения вакцины. Между тем, публикация «Оптимизация ускорения перфузии - ключевой этап разработки высокопроизводительного перфузионного культивирования клеток СНО (Морозов А.Н. и др. Биотехнология, 2016: 60-67)» раскрывает способ оптимизации непрерывного культивирования клеток СНО, экспрессирующих моноклональные антитела нейтрализующего действия, к которым относятся, в частности, омализумаб, экулизумаб и адалимумаб. В эксперименте показано, что медленное ускорение перфузии (0,1*сутки^-2) приводит к существенному подавлению пролиферации клеток, увеличению их объема (гипертрофии клеток), увеличению специфической продуктивности и, одновременно, изменение профиля гликозилирования антитела таким образом, что может увеличиваться его антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), а фармакокинетические свойства целевой молекулы могут изменяться в сторону снижения времени полувыведения. Эти изменения являются нежелательными и могут сделать процесс культивирования непригодным для промышленного использован. Таким образом, режим культивирования клеток, разработанный в целях получения терапевтических белков, в частности моноклональных антител, прежде всего предназначен для получения высоких фармакокинетических свойств целевой молекулы, и не может быть соотнесен с режимом культивирования клеток для получения вакцины.

В D. Fontana et al. Immunogenic virus-like particles continuously expressed in mammalian cells as a veterinary rabies vaccine candidate (Vaccine 33 (2015) 4238-4246) раскрыт способ получения вакцины против вируса бешенства, включающий непрерывное перфузионное культивирование линии клеток HEK-293 (sP2E5). В частности, раскрыт экспрессирующий клон HEK-293 (sP2E5), продуцирующий только внешний гликопротеин в клетках HEK293VLPS), который культивировали в бессывороточной среде (SFM) с использованием 5-литрового биореактора в режиме перфузии в течение 20 дней, достигая плотности клеток выше 1,6×10⁷ клеток/мл, скорость перфузии варьировала от 0,2 до 0,8 объема реактора в сутки по мере необходимости, а содержание гликопротеина вируса бешенства в собранном материале составило 9,1 ME мл^-1, измеренное методом ИФА, по сравнению с 6-м международным стандартом по бешенству. Осветленный неочищенный супернатант, полученный в биореакторе, использовали ля проведения теста NIH на эффективность вакцины против бешенства, получив значение 1,3 ME мл^-1. Таким образом, раскрытый способ приводит достаточно низкой плотности клеток на 20 день культивирования, а также низкой иммуногенности получаемой указанным способом вакцины.

В статье KALLEL, Н., et al. Evaluation of various serum and animal protein free media for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells. Journal of Biotechnology, 2002, 95(3), 195-204. doi:10.1016/s0168-1656(02)00009-3 оптимизированный способ продукции вируса бешенства клетками ВНК -21, выращенными в 2-литровом биореакторе с использованием выбранных сред. В частности, раскрыт способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, включающий непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21. Однако не раскрыты сведения о промышленной реализации раскрытого способа. Между тем, указанная максимально достигаемая плотность клеток составляет 3×10⁶ клеток/мл при посевной концентрации клеток 2×10⁵ кл/мл. Иммуногенная активность полученной вакцины составила 1,5 МЕ/мл. Для специалиста в данной области техники очевидно, что указанная максимально достигаемая плотность клеток является низкой для целей получения вакцины в промышленных масштабах. Кроме того, для специалиста в данной области техники очевидно, что полученные данные по иммуногенности вакцины нельзя рассматривать в качестве хорошего результаты и преимущества получаемой вакцины. Согласно указанной статье не удовлетворяется потребность в высокопроизводительном способе получения в промышленном масштабе вакцины против вируса бешенства, обладающей высокой иммуногенность.

Таким образом, сохраняется потребность в улучшении процесса непрерывного перфузионного культивирования клеток и разработке режима непрерывного перфузионного культивирования клеток для получения вакцины против вируса бешенства с высокой производительностью в промышленном масштабе, а именно высокой плотностью инфицированных клеток, высоким титром инфекционной активности вируса и иммуногенностью вакцины.

Задача настоящего изобретения состоит в предоставлении высокопроизводительного способа получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства посредством непрерывного перфузионного культивирования клеток с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, позволяющего с высокой производительностью в промышленных объемах получать высокую концентрацию инфицированных вирусом клеток, а также инактивированную вакцину против вируса бешенства с высоким титром инфекционной активности вируса и высокой иммуногенностью вакцины.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Указанная задача настоящего изобретения достигается посредством обеспечения способа получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, включающего непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, инфицирование клеток вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим получением гликопротеина вируса бешенства, где на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 прирост скорости перфузии находится в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 скорость перфузии находится в диапазоне от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 посевная концентрация клеток составляет 0,5±0,1 млн/мл.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии инфицирования вирусом бешенства концентрация клеток составляет 19-20 млн/мл.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению вирус бешенства представляет собой вирус бешенства штамма «Щелково-51».

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Перфузионное культивирование клеток имеет общепринятое значение в данной области техники, т.е. означает, что во время культивирования клетки удерживаются разделительным устройством, в котором имеется отток жидкости, имеющей меньшую плотность клеток, чем до разделения, и в которой имеется приток среды для культивирования клеток.

Перфузия - разновидность непрерывного культивирования с частичным или полным отделением клеток от выходящего потока культуральной жидкости и возвращением их в биореактор.

Скорость перфузии - объем потока культуральной жидкости, может быть выражена в литрах в сутки (л/сутки, л*сутки^-1).

Относительная скорость перфузии - количество объемов реактора (N), сменяемых за сутки, Размерность определяется в относительных единицах как N/сутки или N*сутки^-1.

Прирост скорости перфузии - изменение скорости перфузии за единицу времени, достигаемое путем увеличения скорости протока среды на начальном этапе перфузионного культивирования. Определяется как первая производная скорости перфузии, т.е. скорость перфузии, деленная на время, N/сутки², или N*сутки^-2.

Удельная скорость перфузии (УСП) - отношение скорости протока питательной среды к концентрации клеток, измеряется в пиколитрах на клетку в сутки, пл/кл/сутки.

Стационарная фаза перфузионного культивирования - фаза перфузионного процесса, в которой рост клеток в биореакторе скомпенсирован их отбором, так что концентрация клеток в течение длительного времени поддерживается на определенном уровне с незначительными отклонениями.

Блидинг - непрерывный или дискретный отбор суспензии клеток из биореактора в стационарной фазе перфузионного культивирования для предотвращения перерастания культуры и недостатка питательных веществ, размерность определяется в относительных единицах - количество объемов реактора, отбираемых за сутки, N*сутки^-1.

Способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства

В области ветеринарии сохраняется потребность в высокопроизводительном способе получения вакцины против вируса бешенства в промышленном масштабе.

Непрерывное культивирование клеток с применением перфузионных процессов представляет собой перспективный метод, используемый в промышленной биотехнологии при наработке в клетках различных вирусов, белков, в том числе терапевтического назначения. Однако, как очевидно из уровня техники, в целях высокой производительности и промышленного применения требуется усовершенствование как перфузионного процесса культивирования, так и режима культивирования.

Задача настоящего изобретения состоит в предоставлении высокопроизводительного способа получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства посредством непрерывного перфузионного культивирования клеток с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, позволяющего с высокой производительностью в промышленных объемах получать высокую концентрацию инфицированных вирусом клеток, а также инактивированную вакцину против вируса бешенства с высоким титром инфекционной активности вируса и высокой иммуногенностью вакцины.

Авторами настоящего изобретения разработана стратегия интенсификации процесса культивирования клеток для дальнейшего улучшения производства вакцины против бешенства на основе клеточных культур. Авторы настоящего изобретения применили процесс непрерывной перфузии для выращивания клеток ВНК-21 до высоких концентраций клеток 19-20 млн/мл за непродолжительный срок 144-168 часов, в котором использовали систему фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда.

Таким образом, указанная задача решена авторами настоящего изобретения посредством разработки способа получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, включающего непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим получением гликопротеина вируса бешенства, где на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 прирост скорости перфузии находится в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 скорость перфузии находится в диапазоне от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 посевная концентрация клеток составляет 0,5±0,1 млн/мл.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии инфицирования вирусом бешенства концентрация клеток составляет 19-20 млн/мл.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению вирус бешенства представляет собой вирус бешенства штамма «Щелково-51».

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что использование процесса непрерывной перфузии для выращивания клеток ВНК-21, в котором использовали систему фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулировали скорость перфузии, так что прирост скорости перфузии на стадии перфузионного культивирования клеток находится в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2 или от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1, обеспечивает масштабируемость процесса, достижение высокой жизнеспособности (более 95%) клеток на стадии перфузионного культивирования клеток, концентрацию клеток 19-20 млн/мл на стадии инфицирования вирусом бешенства после стадии перфузионного культивирования, титр инфекционной активности вируса по меньшей мере 7,9-8,0 ЛД50/мл, а иммуногенность вакцины в тесте NIH на мышах по меньшей мере 2,0 МЕ/мл.

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что достижение указанного технического результата, состоящего в масштабируемости процесса получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, высокой жизнеспособности (более 95%) клеток на стадии перфузионного культивирования клеток, достижении высокой концентрации клеток 19-20 млн/мл на стадии инфицирования вирусом бешенства после стадии перфузионного культивирования, а также получении титра инфекционной активности вируса по меньшей мере 7,9-8,0 ЛД₅₀/мл и иммуногенность вакцины в тесте NIH на мышах по меньшей мере 2,0 МЕ/мл, происходит исключительно посредством разработанного режима непрерывного перфузионного культивирования клеток с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, так что прирост скорости перфузии на стадии перфузионного культивирования клеток находится в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2.

Авторами настоящего изобретения также неожиданно обнаружено, что на начальной стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток предпочтительная посевная концентрация клеток составляет 0,5±0,1 млн/мл.

Авторами настоящего изобретения также неожиданно обнаружено, что указанный режим непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием прироста скорости перфузии в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2 является наиболее эффективным при культивировании линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21.

Авторами настоящего изобретения также неожиданно обнаружено, что указанный режим непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии в диапазоне от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1, позволяет получить высокую концентрацию клеток 19-20 млн/мл, а при последующем инфицировании их вирусом бешенства штамма «Щелково-51» позволяет получить титр инфекционной активности вируса по меньшей мере 7,9-8,0 ЛД₅₀/МЛ и иммуногенность вакцины в тесте NIH на мышах по меньшей мере 2,0 МЕ/мл.

Таким образом, авторами настоящего изобретения разработан высокопроизводительный способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства в промышленном масштабе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Примеры

Пример 1. Непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21

В биореактор вносили ростовую среду и линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 при посевной концентрации клеток 0,5±0,1 млн/мл. Проводили культивирование клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда. Поддерживали прирост скорости перфузии 0,5*сутки^-2.

Концентрация клеток после перфузионного культивирования составляла 19 млн/мл. Проводили измерение жизнеспособности клеток, которая составила 95,8% живых клеток.

Пример 2. Непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21

В биореактор вносили ростовую среду и линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 при посевной концентрации клеток составляет 0,5±0,1 млн/мл. Проводили культивирование клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда. Поддерживали прирост скорости перфузии 1,0*сутки^-2.

Концентрация клеток после перфузионного культивирования составляла 20 млн/мл. Проводили измерение жизнеспособности клеток, которая составила 96,2% живых клеток.

Пример 3. Непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21

В биореактор вносили ростовую среду и линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 при посевной концентрации клеток 0,5±0,1 млн/мл. Проводили культивирование клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда. Поддерживали прирост скорости перфузии 1,2*сутки^-2. Концентрация клеток после перфузионного культивирования составляла 11,5 млн/мл. Проводили измерение жизнеспособности клеток, которая составила 59,1% живых клеток.

Пример 4. Непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21

В биореактор вносили ростовую среду и линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 при посевной концентрации клеток 0,5±0,1 млн/мл. Проводили культивирование клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда. Поддерживали прирост скорости перфузии 0,45*сутки^-2. Концентрация клеток после перфузионного культивирования составляла 11,5 млн/мл. Проводили измерение жизнеспособности клеток, которая составила 63,1% живых клеток.

Пример 5. Получение культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства

В биореактор вносили ростовую среду и линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 при посевной концентрации клеток составляющей 0,5±0,1 млн/мл. Проводили культивирование клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком. Скорость перфузии регулировали специальной программой. На следующей стадии скорость перфузии контролировали на основе измерений концентрации клеток с использованием емкостного зонда. Поддерживали прирост скорости перфузии от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2, и скорость перфузии находилась в диапазоне от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1.

В промежутке между вторыми и третьими сутки культивирования клетки, когда уже достигалась концентрация 6,0-6,5 млн/мл, заражали посевной расплодкой вируса бешенства.

Далее продолжали проводить культивирование инфицированных клеток в режиме непрерывного перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком в течение 72-Nf 96 часов. Концентрация инфицированных клеток после перфузионного культивирования инфицированных культивирования составляла 19-20 млн/мл.

Затем проводили инактивацию вируссодержащей суспензии инактивантом β-пропиолактон с последующей оценкой содержания гликопротеина вируса бешенства в вакцинном продукта.

Характеристики полученной культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства приведены в Таблице.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии. Описан способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, включающий непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим получением гликопротеина вируса бешенства. Изобретение позволяет в промышленных объемах получать инактивированную вакцину против вируса бешенства с высокой концентрацией инфицированных вирусом клеток, высоким титром инфекционной активности вируса и высокой иммуногенностью полученной вакцины. 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. Способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства, включающий непрерывное перфузионное культивирование линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком и регулированием скорости перфузии, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим получением гликопротеина вируса бешенства, где на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 прирост скорости перфузии находится в диапазоне от 0,5*сутки^-2 до 1,0*сутки^-2.

2. Способ по п. 1, где на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 скорость перфузии находится в диапазоне от 0,5 сутки^-1 до 2,0 сутки^-1.

3. Способ по п. 1, где на стадии непрерывного перфузионного культивирования линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 посевная концентрация клеток составляет 0,5±0,1 млн/мл.

4. Способ по п. 1, где на стадии инфицирования вирусом бешенства концентрация клеток составляет 19-20 млн/мл.

5. Способ по п. 1, где вирус бешенства представляет собой вирус бешенства штамма «Щелково-51».