НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/569 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности диагностике инфекционных болезней, и может быть использовано для быстрого неинвазивного выявления Helicobacter pylori (Hp) при заболеваниях верхних отделов желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с этим возбудителем (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гастрит, дуоденит, "не язвенная диспепсия", рак желудка).

Известны два типа тестов диагностики заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с Hp: инвазивные тесты (культуральный, гистологический, бактериоскопический, уреазный и неинвазивные тесты (серологический, уреазный дыхательный тест с использованием изотопов и другие).

Однако инвазивные тесты требуют проведения гастродуоденоскопии с биопсией, в ряде случаев являющихся небезопасными или невозможными (тяжелые больные, дети), кроме того, их нельзя проводить с достаточной частотой.

Неинвазивные тесты, такие как методы, основаные на выявлении специфических антител (ELISA, реакция фиксации комплемента, пассивная гемагглютинация, иммуноблоттинг, латексная агглютинация), ограничены в клиническом применении, т.к. не позволяют дифференцировать факт инфицирования Hp в анамнезе от заболевания геликобактериозом в настоящее время и потому не могут быть использованы для раннего определения эрадикации возбудителя и оценки эффективности лечения. Уреазный дыхательный тест связан с применением изотопов С¹³ или С¹⁴ мочевины и сложного оборудования для массовой спектроскопии или сцинтилляционного счетчика соответсвенно.

Предложен метод определения ДНК Нр в фекалиях с помощью полимеразной цепной реакции, однако он сложен, многоэтапен, требует дорогостоящего оборудования и недоступен практическим лабораториям.

Предложено выявлять антигены Нр в фекалиях больных с помощью иммуноферментного метода EIA (1). Однако этот метод, как и все аналогичные, требует специального оборудования.

Известен способ определения термостабильных антигенов - маркеров Campylobacter в биологических жидкостях больных с помощью разработанного в последнее время диагностикума для реакции коагглютинации на стекле (2). Этот метод наиболее близок по своей сущности в качестве неинвазивного, простого и быстрого для выявления маркера Нр у человека и выбран нами в качестве аналога.

Целью изобретения является разработка неинвазивного, быстрого, доступного, экономичного и, вместе с тем, чувствительного и специфичного способа выявления маркера Нр, пригодного для скрининга инфицированных этим возбудителем лиц с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, мониторирования в ходе заболевания и после него, оценки сроков и полноты эрадикации Нр и эффективности лечения, метода, пригодного для длительных многократных наблюдений.

Цель достигается путем определения термостабильных антигенов Нр с помощью реакции коагглютинации непосредственно в биологическом материале (фекалиях, слюне) без применения эндоскопической техники, установления их диагностического титра и динамики выделения у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в процессе антибактериальной терапии.

Диагностическая эффективность нового неинвазивного способа выявления Нр представлена в примере 1.

Пример 1. Определение маркера Нр у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки неинвазивным методом /РКА/.

Материалом для исследования является слюна и кал, в которых выявляют антиген Нр. Пробы слюны берут натощак в количестве 2-3 мл, пробы кала в количестве 2-3 г в чистые стеклянные или пластмассовые емкости.

Пробы слюны и кала берут до лечения, 3-4 раза через каждые 2-3 дня во время лечения и через 1-1,5 мес после окончания лечения. Все пробы можно хранить при 4-10^oС до 2-2,5 мес и затем исследовать одновременно.

Реакцию коагглютинации /РКА/ ставят с диагностикумом, разработанным и изготовленным в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Диагностикум представляет собой взвесь стабилизированного стафилококка штамм Cowan 1, сенсибилизированного специфическими антителами.

Постановку и учет реакции проявляет согласно инструкции, прилагаемой к препарату. Слюну и кал /разведенный фосфатно-солевым буфером /ФСБ/ 1:5/ прогревают в водяной бане при 100^oC в течение 20 мин, центрифугируют для осветления при 2000 об/мин 15 мин. На предметное стекло, разделенное на сектора стеклографом, наносят по 1 капле разведенного 1:10, 1:20, 1:40 исследуемого материала, в каждую из них добавляют по 1 капле диагностикума. Используют 5 диагностикумов, изготовленных на сыворотках, содержащих разный спектр антител к термо-стабильному антигену Нр. Смесь исследуемого материала и диагностикумов осторожно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. За положительную реакцию с каждым диагностикумом считают агглютинацию стафилококка на 1+ по 4-х бальной шкале. Определяют среднеарифметический титр антигена Нр в слюне и кале из результатов определения их с 5-ю диагностикумами.

При среднем титре, равном 0 - 1:4, реакцию считают отрицательной, при среднем титре 1: 5-1: 9 - слабо положительной, при среднем титре 1:10 - 1: 19-положительной, при среднем титре 1:20 и выше - резко положительной. Неинвазивный тест сравнивали с данными "золотого стандарта": уреазного теста (Кампи - теста) и бактериоскопического исследования мазков - отпечатков биоптатов, окрашенных по Романовскому - Гимзе.

Появление малинового окрашивания при постановке уреазного теста (УТ) в первые 5 мин при 37^o свидетельствовало о значительной инфицированности слизистой оболочки (3+), в течение 1-3 ч - об умеренной (2+), к концу суток - незначительной (1+), в более поздние сроки - об отрицательной реакции.

При оценке результатов бактериоскопии биоптатов (увеличение в 630 раз) выделяли 3 степени обсемененности слизистой оболочки: слабую (1+) - до 20 микробных тел в поле зрения, среднюю - до 50 микробных тел в поле зрения, высокую - более 50 микробных тел в поле зрения.

Результаты определения чувствительности и специфичности неинвазивного теста по выявлению Нр у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки представлены в таблице.

С помощью РКА в слюне и/или кале до лечения обнаружены положительные и резко положительные реакции у 46 и 55% больных соответственно, всего положительные реакции выявлены у 100%. После семидневного курса "тройной" антибактериальной терапии общее число положительных реакций составило 78%, из них положительных и резко положительных - 56%.

Уреазным тестом и бактериоскопией биоптатов геликобактериоз был выявлен в 100% случаев ЯБДК до лечения и в 86% после лечения (представлен пример малоэффективного сочетания антибиотиков). При этом число положительных и резко положительных реакций составило 71%. В контрольной группе, которую составили больные атрофическим гастритом (диагноз подтвержден эндоскопически и морфологически), РКА выявляла у 50% лиц слабоположительную реакцию, у остальных 50% она была отрицательная. В этой же группе уреазный тест и бактериоскопия дали отрицательный результат в 100% случаев.

Анализ числа совпадающих результатов по всем трем тестам свидетельствует о полной идентичности их до лечения (100%) и совпадение в 85,7% случаев после лечения. В одном из 6 контрольных случаев уреазный тест и реакция на обсемененность при бактериоскопическом исследовании были отрицательными, а РКА дала слабоположительные результаты (средний титр антигена 1:5). Однако это несовпадение результатов трех тестов было несущественным (Р > 0,05).

Таким образом, была установлена высокая чувствительность и специфичность неинвазивного метода выявления маркеров Нр (РКА) у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в сопоставлении с традиционными более сложными методами обследования больных на обсемененность Нр.

Пример 2. Изучение динамики выделения антигенов Нр (РКА) у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки на фоне лечения в период обострения заболевания.

Обследование больных с помощью неинвазивного метода проводили многократно не только до и после лечения, но также в период приема антибактериальных препаратов. Пробы слюны и кала брали через каждые 2-3 дня и исследовали РКА с геликобактерным диагностикумом. Результаты выявления антигенов Нр в динамике представлены на чертеже.

Из чертежа видно, что уровень антигенов Нр в слюне и кале динамически менялся, причем через 3-6 дней после начала лечения у половины больных он значительно повышался, особенно в кале, очевидно, вследствие разрушения бактерий и освобождения антигенов под действием антибактериальных средств.

К концу лечения у большинства больных (70%) уровень антигенов Нр снижался до очень низких показателей. Это снижение количества антигенов в биологических жидкостях коррелировало с улучшением клинических показателей в первые же дни начала лечения.

Таким образом реакция коагглютинации является чувствительной и быстро реагирующей на изменения уровня антигенов Нр в организме.

Через 3-5 недель после начала лечения у части обследованных больных уровень антигенов Нр по-прежнему оставался низким, однако у большей части лиц (57%) снова повышался в слюне при незначительном его уровне в кале, что указывало на недостаточную эффективность антибактериальной терапии.

Частота обнаружения антигенов Нр раздельно в пробах слюны и кала примерно одинаковая (55,5 и 52,0% соответственно). Однако количественная динамика изменений антигенов Нр в этих пробах различна. Учитывая эти данные, целесообразно при обследовании больных брать пробы кала и слюны одновременно и результаты реакции учитывать по максимальным показателям среднего титра антигенов в том или другом материале.

Полученные данные свидетельствуют о возможности с помощью РКА судить об эффективности лечения и полноте эрадикации Нр.

Предлагаемый способ выявления маркера Нр является быстрым, доступным, не требующим специального оборудования и дорогостоящих реактивов, позволяет без эндоскопии, по результатам исследования проб слюны и фекалий проводить скрининг заболеваний, ассоциированных с Нр, осуществлять мониторинг в ходе заболевания, быстро оценивать эффективность антибактериальной терапии и ее отдаленные результаты.

Литература
1. Athanasion Makristathis, Eva Pasching, Kurt Schutze, Margit Wimmer, Manfred L.Rotter, Alexander M. Hirsche. Detection of Helicobacter pylori in Stool Specimens by PCR and Antigen Enzyme Immunoassay, J. of Clin. Micr., 1998, v.36, N9, p.2772-2774.

2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Быстрова С.М., Петрухин В.Г., Прокофьева Е.М. Способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров. Патент 2086984, БИ 22, 10 августа 1997 г.

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных болезней, и может быть использовано для быстрого неинвазивного выявления Helicobacter pylori при заболеваниях, ассоциированных с этим возбудителем. Сущностью способа является определение термостабильного антигена Helicobacter pylori реакцией коагглютинации одновременно в фекалиях и слюне. Диагностическим титром антигена является разведение исследуемых проб слюны и фекалий 1: 5-1:40. Техническим результатом является ускорение сроков проведения анализа, экономичность, простота, возможность определения динамики и полноты эрадикации Helicobacter pylori и эффективности антибактериальной терапии. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Неинвазивный способ выявления Helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в биологическом материале, отличающийся тем, что проводят определение термостабильного антигена реакцией коагглютинации одновременно в фекалиях и слюне, а результат оценивают по показателю титра антигена в том или ином материале. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диагностическим титром антигена Helicobacter pylori является разведение исследуемых проб слюны и фекалий 1: 5-1: 40.