СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ КАМПИЛОБАКТЕРОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/531 G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к клинической и ветеринарной микробиологии и иммунологии, и предназначено для экспрессной диагностики кампилобактериозов у людей и животных, выявления кампилобактеров в пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды.

Известен способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов Campylobacter jejuni и Campylobacter coli с помощью коагглютинации, предусматривающий получение сывороток к живым культурам кампилобактеров всех существующих серотипов (порядка 57), сенсибилизацию лиофилизированных клеток S. aureus Cowan 1, инкубирование в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывание в ФСБ при центрифугировании и суспензирование в ФСБ, консервирование 0,05 азида натрия. Таким образом получают монодиагностикумы, которые используют в РКА на стекле с живыми и убитыми культурами исследуемых штаммов. Этот способ выбран в качестве ближайшего аналога. Однако известные диагностикумы пригодны только для серотипирования культур, метод серотипирования многоэтапный и не пригоден для выявления антигенов непосредственно в исследуемом материале. Коммерческих наборов для выявления антигенов кампилобактеров реакцией коагглютинации в известной нам литературе не имеется.

Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является то, что полученный диагностикум пригоден для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров не только в культурах, но также непосредственно в исследуемом материале, что упрощает диагностику (РКА ставят одноэтапно) и значительно сокращает время проведения анализа. Он достигается тем, что из набора часто встречающихся при патологии человека и животных серотипов кампилобактеров отбирают несколько культур, имеющих в своем составе максимальный спектр термостабильных антигенов, для иммунизации кроликов используют убитые ацетоном и прогреванием при температуре 100 ^oC в течение 1 ч культуры, иммунизацию проводят многократно внутривенно возрастающими дозами от 1,0 до 16,0 млрд микр. кл. кампилобактеров с двумя повторными циклами после каждого взятия крови, для сенсибилизации стафилококка используют смесь полученных сывороток. Диагностикум для выявления кампилобактеров реакцией коагглютинации представляет собой комплект, включающий емкость, заполненную диагностикумом, вторую емкость с несенсибилизированным стафилококком для отрицательного контроля и третью емкость для положительного контроля.

Известно, что наиболее распространенными серотипами кампилобактеров по схеме Lior являются: L1, L2, L4, L5, L6, L7, L9, L11, K16, K17 и L36, которые составляют 70 всех выделенных культур. Наиболее распространенными штаммами, серотипированными по термостабильным антигенам 0 в США являются P1, P2, P4, P5, P3, P10, P16, P18, P21, P25, которые составляют 73,7 выделенных штаммов, у нас в стране L1, L5, L6, L7. При этом культуры серотипов по схеме Lior часто сочетаются с наиболее распространенными 0-антигенами по схеме Penner: так, L1 часто сочетается с P2 (59) и L4 с P3 (11); серотип L36 с P3, P4 и P8 (19 15 11 соответственно); L1 с P4 и P1 (36 и 27 соответственно); L6 с P25, P17 и P7 (34 33 и 22 соответственно); L16 с P10 и P5 в 77 и 22 соответственно.

Исходя из этих данных, для дальнейшей разработки диагностикума для РКА, исследования специфических и перекрестно-реагирующих антигенов, а также для получения антисывороток был использован набор культур кампилобактеров из 14 наиболее распространенных в патологии человека и животных серотипов кампилобактеров.

Пример 1. Получение сывороток к каждому серотипу кампилобактеров (подготовительный этап).

Для получения сывороток были испытаны описанные в литературе, а также специально разработанные схемы иммунизации кроликов. Из 6 испытанных методов, в которых применялись формалинизированные, гретые при 100 ^oC культуры в течение 1 ч и 2 ч, ЛПС, полученные горячим фенольным методом по Вестфалю и Джан (1965), с адъювантом Фрейнда и без него, в разных дозах, мы остановились на оригинальном, разработанном нами методе получения антисывороток к термостабильным антигенам, который заключается в следующем. Кролики породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг иммунизировались убитой и высушенной ацетоном микробной массой кампилобактеров после прогревания ее при 100 ^oC в течение 1 ч, внутривенно, один раз в неделю в возрастающих дозах от 1,0 млрд микр. кл. до 16,0 млрд микр. кл (I цикл); 4,0, 8,0 и 16,0 млрд микр. кл (II цикл); 10,0 и 10,0 млрд микр. кл (III цикл). После каждого цикла вакцинации на 7-10 день брали кровь из ушной вены. Сыворотки исследовали в реакции препипитации и иммуноэлектрофореза в агаре с ЛПС каждого штамма и перекрестно.

Пример 2. Подготовительный этап-отбор штаммов для получения диагностикума кампилобактериозного для реакции коагглютинации.

Методом иммуноэлектрофореза в агаре и препипитации в геле было установлено, что многие сыворотки к изученным культурам кампилобактеров (10 из 15) имеют в своем составе, кроме антител к гомологичным термостабильным антигенам 0 этих бактерий, также антитела к гетерологичным 0-антигенам других серотипов, причем некоторые сыворотки имеют антитела к двум или даже шести термостабильным 0-антигенам.

На основании этих данных в смесь сывороток для приготовления кампилобактериозного поливалентного коагглютинирующего диагностикума можно было взять 3-4 сыворотки, при этом она содержала бы антитела ко всем исследованным культурам кампилобактеров.

Так, из табл. 1 видно, что сыворотка к штамму 4 выявляет термостабильные антигены штамма 5 и наоборот, сыворотка к штамму 6 является моноспецифической; сыворотка к штамму 35 выявляет антиген также штамма 21 наряду с гомологичным антигеном; сыворотка к штамму 21 имеет антитела к термостабильным антигенам сероваров 1, 2, 8, 20, 21, 35. Таким образом, для смеси можно было взять эти 4 сыворотки. Данный пример не ограничивает предмет изобретения.

Пример 3. Получение кампилобактериозного диагностикума (конечный этап).

Для получения сывороток, которые содержали бы антитела ко всем термостабильным антигенам наиболее часто встречающихся серотипов кампилобактеров, берут штаммы кампилобактеров, имеющие максимальный набор термостабильных антигенов этих серотипов, выращивают на твердой питательной среде, смывают физиологическим раствором (0,9 хлорида натрия), взвесь микробов заливают тремя объемами ацетона, через сутки дважды отмывают свежими порциями ацетона и высушивают микробы на воздухе. Убитые и высушенные ацетоном микробы каждого штамма разводят 0,9-ным раствором хлорида натрия до концентрации 20-25 млрд микр. кл. прогревают в водяной бане при 100 ^oC в течение 1 ч и хранят при 2-6 ^oC в течение всего периода иммунизации. Кроликов иммунизируют, как указано в примере 1. Определяют рабочее разведение каждой гипериммунной кроличьей сыворотки, необходимое для приготовления смеси, путем приготовления пробных диагностикумов для РКА и испытания их с гомологичным ЛПС. Готовят смесь этих сывороток, используя такие их соотношения, чтобы в смеси содержалось примерно равное количество антител к разным термостабильным антигенам, учитывая их разведения при изготовлении пробных диагностикумов. Например, если рабочее разведение первой, второй и третьей сывороток соответственно составляло 1:200, 1:400 и 1:400, то для приготовления смеси этих сывороток берут их соотношения как 2:1:1 (табл.1).

Для приготовления поливалентного диагностикума берут 0,1 мл смеси сывороток, добавляют 0,9 мл 10-ной взвеси стабилизированной формалином (0,5 раствор формальдегида 2 ч) и прогреванием (85 ^oC 2 ч), отмытого при центрифугировании стафилококка Staphylococcus aureus штамм Cowan 1, тщательно перемешивают и доводят ФСБ до 10 мл. Приготовленный таким образом кампилобактериозный диагностикум контролируют путем постановки РКА на стекле с ЛПС или гретыми (100 ^oC 1 ч) культурами наиболее часто встречающихся серотипов Campylobacter jejuni, coli, laridis, взятыми в различных разведениях, для определения чувствительности, а также другими энтеробактериями для определения специфичности препарата. Для постановки РКА одну каплю каждого разведения ЛПС (десятикратного, от 10^-1 до 10^-4 мг/мл) наносят на предметное стекло, разделенное на сектора стеклографом, и добавляют к ней одну каплю сенсибилизированного стафилококка (диагностикума). В контроле N 1 вместо диагностикума помещают каплю несенсибилизированного стафилококка (отрицательный контроль), в контроле N 2 - к диагностикуму добавляют ЛПС Campylobacter, разведенный в ФСБ (положительный контроль). Капли осторожно перемешивают покачиванием стекла в течение 3-5 мин, помещают во влажную камеру на 30 мин. Учет реакции проводят по 4-крестовой шкале, положительной считается агглютинация стафилококка на 2+.

Набор диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров включает: 1. емкость (ампула, флакон), заполненную диагностикумом в объеме 1-2 мл; 2. емкость, заполненную несенсибилизированным 1 стафилококком для отрицательного контроля 1-2 мл; 3. емкость, заполненную жидкостью для положительного контроля 1-2 мл.

Приготовленный кампилобактериозный диагностикум должен давать положительную реакцию коагглютинации со всеми наиболее распространенными культурами кампилобактеров разных серотипов или их 0-антигенами при концентрации последних 100 мкг/мл и более. Он не должен реагировать с 0-антигенами других видов бактерий (табл. 2).

Пример 4. Использование кампилобактериозного диагностикума для выявления термостабильных антигенов этих бактерий непосредственно в исследуемом материале.

Для определения термостабильных антигенов кампилобактеров материал (копрофильтрат, слюна, моча, сыворотка крови, пищевые продукты, корма) прогревают в водяной бане при 100 ^oC в течение 30 мин, осветляют центрифугированием или фильтрацией. Одну каплю исследуемого материала наносят на предметное стекло, размеченное на сектора карандашом по стеклу, добавляют одну каплю диагностикума, осторожно перемешивают покачиванием стекла в течение 3-5 мин, оставляют во влажной камере на 30 мин при комнатной температуре. Учет реакции проводят визуально, отмечая интенсивность реакции над вогнутым зеркалом микроскопа. Положительной считается реакция на 2+. Контролем служат капля исследуемого материала с несенсибилизированным стафилококком (отрицательный контроль). Положительным контролем является реакция агглютинации диагностикума с ЛПС кампилобактеров, прилагаемого к набору. Разработанный диагностикум был испытан на материале от здоровых и больных людей, а также при исследовании птиц, яиц, содержимого кишечника, печени кур, а также материалов от работников птицефабрик (табл. 3).

Показана достаточно высокая чувствительность разработанного кампилобактериозного диагностикума в выявлении антигенов этих бактерий; наши данные соответствуют результатам других исследователей, показавших высокую частоту выявления кампилобактеров у людей и животных с помощью бактериологического метода.

Применение диагностикума, полученного по предлагаемому способу, позволяет проводить экспресс-диагностику кампилобактериозов у больных людей и животных, выявлять контаминацию кампилобактерами пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды, непосредственно в исследуемом материале без проведения бактериологического исследования и выделения чистой культуры, требующих специальных дорогостоящих питательных сред и оборудования. Постановка РКА с помощью предлагаемого диагностикума является технически простой процедурой, а способ приготовления диагностикума и его применение, в особенности при массовых исследованиях, экономически значительно более эффективен, чем другие способы диагностики кампилобактериоза.

Назначение: биотехнология, в частности, клиническая и ветеринарная микробиология и иммунология, для экспресс диагностики кампилобактериозов у людей и животных, выявление кампилобактеров в пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды. Сущность: получают сыворотки при иммунизации кроликов, убитые ацетоном и прогретые, для разрушения термостабильных антигенов культурами кампилобактеров, отобранных из числа наиболее часто встречающихся в патологии серотипов и имеющих максимальный набор термостабильных антигенов, полученные сыворотки от разных животных смешиваются, сенсибилизируются клетками Staphylococcus Qureus Cowan I, отмываются, ресуспендируются и консервируются. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров, включающий раздельную иммунизацию животных культурами Campylobacter spp. разных серотипов с последующим забором крови от каждого животного, выделением сывороток, сенсибилизацией полученными сыворотками клеток Staphylococcus aureus Cowan I, отмывкой, ресуспедированием и консервированием, отличающийся тем, что животных иммунизируют дезактивированной нагреванием и высушенной ацетоном микробой массой кампилобактеров внутривенно дозами 1,0 16,0 млрд клеток, а полученные от разных животных сыворотки перед сенсибилизацией смешивают. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дезактивацию кампилобактеров проводят при температуре 100^oС в течение 1 ч. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления смеси берут ограниченное (3 5) число сывороток, имеющих максимальный набор антител к термостабильным антигенам кампилобактеров разных серотипов.