СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ОБОСТРЕНИЙ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА Российский патент 2013 года по МПК G01N33/554 

Назначение: медицина, гастроэнтерология. Может быть использован для прогнозирования возможного клинического обострения Helicobacter pylori инфекции и их своевременной профилактики и лечения.

Сущность изобретения: реакцией коагглютинации с использованием специально разработанных диагностических тест-систем (2) в биопробах (слюне или копрофильтратах) определяют частоту встречаемости термостабильного О-антигена Helicobacter pylori (Hp), являющегося маркером палочковидных форм этого микроба, и частоту встречаемости вакуолизирующего цитотоксина VacA в составе иммунных комплексов (ИК). При высокой частоте определения О-антигена в биоматериале, свидетельствующем о размножении микроба в организме, и более низком (≤40%) показателе VacA в составе иммунных комплексов (ИК) риск возникновения обострений хеликобактериоза (диспепсии, гастрита, язвенной болезни (ЯБ) считается вероятным, при показателе VacA≤20% - риск обострения становится высоким.

Helicobacter pylori является широко распространенным микробом, он инфицирует 50-95% населения разных стран мира. В большинстве случаев вызывает бессимптомное многолетнее, нередко пожизненное, воспаление в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Общепризнано, что Hp является важным фактором развития хронического гастрита, гастродуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, безусловным фактором риска рака желудка и, возможно, других неинтестинальных заболеваний (4, 5).

В результате многолетних проспективных исследований здоровых добровольцев и амбулаторных больных ЖКИ нами были установлены закономерные циклические колебания частоты встречаемости патогенетически значимых антигенов Hp - O-, высокомолекулярных белков, включая CagA и VacA в биологических жидкостях в свободном виде и связанных в иммунные комплексы. Полученные данные свидетельствуют о закономерных сезонных волнообразных изменениях жизнедеятельности микроба (его размножении и продукции токсинов), коррелирующих с нарушением гуморального и клеточного иммунитета, и сопровождающихся клиническими обострениями хеликобактериоза (1).

Разработанный нами «Способ определения риска обострений хеликобактериоза» по своей сущности наиболее близок «Способу определения вероятности инфицирования Helicobacter pylori», который ранее был защищен патентом №2360251 и выбран нами в качестве аналога (3).

Настоящий «Способ определения риска обострений хеликобактериоза», наряду с определением О-антигена Hp в биоматериале, с учетом его сезонных колебаний, дополнительно включает определение частоты встречаемости VacA-антигена в составе иммунных комплексов и, следовательно, наличие специфических антител и их способности к связыванию с антигеном в ИК.

Известно, что образование иммунных комплексов является одним из важнейших начальных звеньев в системе сложных гуморальных и клеточных иммунных механизмов защиты организма, приводящих к удалению эндогенных и экзогенных антигенов и токсинов. В норме иммунные комплексы, образовавшиеся в кровотоке из антигенов, антител и компонентов комплемента, фагоцитируются и разрушаются. Патологические реакции могут быть обусловлены изменением скорости их образования и разрушения, дефицитом одного или нескольких компонентов комплемента или функциональными дефектами фагоцитарной системы. Исследования иммунных комплексов при хронической персистенции Hp в организме весьма ограничены.

Целью настоящей работы являлась разработка способа определения риска обострений Helicobacter pylori инфекции, включающего алгоритм постановки реакции определения частоты встречаемости О-, VacA-антигенов в биопробах и в составе иммунных комплексов с учетом периодических изменений жизнедеятельности микроба и иммунитета в различные временные периоды.

Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, является оптимизация диагностики, возможность определения жизнедеятельности микроба (размножения, продукции токсинов) и состояния специфического иммунитета организма, нарушение баланса взаимодействия которых, в конечном итоге, определяет риск возникновения клинического обострения. Предлагаемый способ неинвазивен, относительно прост в исполнении и учете, не требует сложного оборудования, экономичен и, что особенно важно, может быть использован при длительном мониторинге. Рекомендуется для пациентов любого возраста. Может быть использован при выборе терапевтических средств, включая иммунологические, для оценки эффективности эрадикационной терапии и своевременной профилактики обострений.

Эффективен в научных исследованиях в медицине, гелиобиологии.

Предлагаемый способ, т.о., позволяет определять не только жизнедеятельность Hp в данный временной период года, но и состояние специфического иммунитета, при снижении которого может воникать обострение Нр-инфекции.

Способ определения риска обострений хеликобактериоза представлен в примерах.

ПРИМЕР 1. Динамика частоты встречаемости О-антигена в биоматериалах и VacA в составе иммунных комплексов при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

В основе настоящего изобретения лежат результаты многолетних (начиная с 1999 г.) исследований циркуляции патогенетически значимых антигенов Нр у здоровых добровольцев (25 человек, более 7500 проб) и амбулаторных больных гастритом, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК), ГЭРБ, гепатитами, а также у обезьян и домашних животных (более 8900 проб).

На основании полученных фактических данных впервые установлены закономерные волнообразные колебания частоты встречаемости О-антигена с подъемом в феврале-марте и сентябре-ноябре и спадом в летние июнь-август месяцы, а также волнообразные изменения кривой частоты встречаемости VacA в составе ИК (Рисунок). Как видно из рисунка, кривые частоты встречаемости О-антигена Нр или VacA в составе ИК представляют собой волнообразные линии, которые по своей направленности зеркально отражают друг друга. В весенние и осенние месяцы года повышение частоты встречаемости О-аатигена в биопробе сопровождается снижением показателей VacA в ИК, в летние месяцы, наоборот, снижению кривой О-антигена соответствует повышение VacA в ИК. Происходит как бы перекрещивание кривых О- и VacA-антигенов в феврале, особенно в марте, а также в сентябре или октябре, когда частота встречаемости О-антигена (показателя размножения микробов в организме) начинает превышать содержание патогенетически значимых антигенов, в данном случае VacA, в составе ИК. Именно в эти критические периоды года чаще регистрируются обострения гастритов, ЯБДПК. В остальные месяцы года, как правило, средняя частота встречаемости VacA в составе ИК значительно превышает показатели О-антигена.

Предлагаемый способ позволяет определять О-антиген (маркер размножения микроба в организме) и связанный в иммунные комплексы VacA-антиген (показатель специфического иммунитета) в данный конкретный период года.

ПРИМЕР 2. Постановка, учет и оценка реакции коагглютинации при определении риска обострения хеликобактериоза.

Алгоритм определения

Взятие материала

Материалом для исследования является слюна. При невозможности получения проб слюны, например, у детей раннего возраста можно использовать пробы кала.

Биоматериал в количестве 3 мл собирают в чистую сухую стеклянную или пластиковую емкость (пенициллиновый флакон, пробирка и др.) и хранят при температуре от +4°C до +10°C в течение 1-3 суток, или в замороженном виде - неограниченно долго. Для исследования необходимо 4-6 проб биоматериала, взятых в течение 2-3-х недель в феврале-марте, сентябре-октябре или в любое другое время года при появлении начальных симптомов обострения (боль, изжога, отрыжка и т.д.).

Обработка биоматериала

В лаборатории кал разводят фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,2-7,4) в соотношении 1:5. Слюну и разведенный кал центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость используют для постановки реакции коагглютинации (РКА) на стекле для определения О-антигена после предварительного прогрева (100°C - 30 мин) и на планшетах с U-образным дном лунок для определения VacA- антигена без предварительного прогревания после разведения ФСБ 1:5.

Постановка и учет РКА для определения О-антигена Нр

Одну каплю прогретого биоматериала наносят на предметное стекло, добавляют одну каплю О-диагностикума. Последний представляет собой 1%-ную взвесь стафилококка Staphylococcus aureus Cowan 1, стабилизированного формалином и прогреванием и сенсибилизированным специфической кроличьей сывороткой против О-антигена Нр. Стекла помещают во влажную камеру при 39°C на 1 час.

Результат учитывают по появлению хлопьев агглютината разной интенсивности («±», «1+», «2+», «+3», что соответствует разведениям О-антигена 1:5, 1:10, 1:20, 1:40-1:60. Реакция в титре 1:5 считается слабо положительной, 1:10-1:40 - положительной.

Постановка и учет результатов РКА на планшетах для определения VасА-антигена.

Подготовленный, как указано выше, биоматериал титруют четырехкратно в 2-х рядах лунок планшета. Затем в первый ряд лунок добавляют VacA-диагностику, во второй - несенсибилизированный стафилококк (Контроль). Планшеты инкубируют во влажной камере в термостате при 39°C в течение суток.

Учет РКА на планшетах проводят через 1-3 суток путем просмотра над вогнутым зеркалом от микроскопа. Положительной реакцией считается появление равномерного «зонтика» на «4+» или зонтика с легким осадком на дне лунки («3+») в 1 ряду лунок с диагностикумом в титрах, превосходящих титры реакции во 2 ряду (Контроль) в 4 и более раз.

Оценка результатов определения О- и VacА-антигенов для заключения о возможном обострении хеликобактериоза

Вычисляется частота встречаемости (%) О-антигена в биоматериале и VacA в составе ИК по результатам определения этих антигенов в 4-6 или более исследованных образцах. При высоком содержании О-антигена (≥50%) и низком показателе VacA A (≤40%) риск обострения считается вероятным, при частоте встречаемости VacA≤25% - высоким.

Например, если у пациента X. частота встречаемости О-антигена составляет 82%, VacA - 30%, то риск обострения считается вероятным, или если у пациента У. частота встречаемости О-антигена равняется 65%, VacA-антигена - 17%, то риск возникновения обострения является высоким.

Повышение О-антигена и снижение VacA обычно начинается за 2-4 недели до появления первых клинических признаков обострения. Проведение анализа позволяет определить риск возможного обострения и предпринять соответствующие терапевтические мероприятия, включая назначение иммуномодулирующих препаратов.

ПРИМЕР 3. Апробация способа определения риска обострений хеликобактериоза.

1. Больной Ф., 84 года. Язвенная болезнь желудка. Операция по Бильрот П в 1967 г. В 2009 г. в конце февраля появились боли в области желудка, изжога. В марте при проведении эндоскопии обнаружена язва в области рубца анастомоза. В апреле 2009 г. при повторной эндоскопии язвенный дефект не обнаружен. При дальнейшем наблюдении клинических симптомов обострения не отмечалось. В ходе проспективных исследований циркуляции О- и VacA-антигенов Hp в организме установлено значительное снижение частоты встречаемости VacA-антигена в марте 2009 г. (29%) при достаточно высоких показателях его в другие месяцы 2009, 2010 и 2011 гг. (Таблица).

2. Больной В., 72 года. Язвенная болезнь желудка с 1987 г. Периодические обострения гастрита. В июне 2010 г. отмечено выраженное обострение с симптомами диспепсии и аппендицита, по поводу которого он был госпитализирован. Проведена аппендэктомия. Как видно из таблицы, в июне и июле 2010 г. у этого пациента отмечалось снижение частоты встречаемости VacA-антигена до 29% и 25% соотв., при достаточно высоких (≥40%) показателях VacA-антигена по все другие месяцы 2009-2011 гг.

3. Больная Г., 83 года. Хронический гастродуоденит, подострый, с периодическими сезонными обострениями. В сентябре-ноябре 2010 г. наблюдалось выраженное обострение хронического гастродуоденита. Как видно из таблицы, проведенные нами проспективные исследования в 2009-2011 гг. показали, что в октябре 2010 г. наблюдалось снижение частоты встречаемости VacA-антигена (36%) при высоком показателе О-антигена (90%).

Под наблюдением находились также четверо Нр-инфицированных добровольца. Показатели частоты встречаемости VacA-антигена в слюне и кале у этих добровольцев постоянно оставались достаточно высокими (≥40%) во все сроки наблюдения.

Таким образом, определение частоты встречаемости О- и VacA-антигенов H.pylori в биопробах больных и бессимптомных пациентов является эффективным способом определения возможного обострения хеликобактериоза.

Литература

1. Белая Ю.А. Сезонная изменчивость жизнедеятельности Helicobacter pylori в организме // Ремедиум Приволжья, 2006. С.72.

2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Петрухин В.Г. Способ получения диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori в реакции коагглютинации. Патент №2186394 от 31 января 2001 г.

3. Белая Ю.А., Петрухин В.Г., Вахрамеева М.С. и соавт. Способ определения вероятности инфицирования Helicobacter pylori. Патент №2360251 от 18.12.2007 г.

4. Ивашкин В.Т., Мегрэ Ф., Лапина Т.Л. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Москва, Триада-Х, 1999, 255 с.

5. Исаков В.А., Домарадский И. В. Хеликобактериоз. Москва, Медпрактика, 2003, 411 с.

Изобретение относится к медицине, конкретно к гастроэнтерологии, и касается способа определения риска обострений хеликобактериоза. Для этого отбирают пробы слюны или кала многократно (4-6 раз) в критические месяцы года (февраль-март, сентябрь-октябрь). Определяют O-антиген Helicobacter pylori в прогретых пробах (100°C, 20 мин) и VacA-антиген в непрогретых пробах реакцией коагглютинации на стекле и планшетах соответственно. Затем вычисляют частоту встречаемости этих антигенов. При высоких показателях частоты встречаемости O-антигена (≥50%) и низких значениях VacA-антигена (≤40%) риск возникновения обострения (диспепсия, гастрит, язвенная болезнь) считают вероятным, при показателе VacA-антигена ≤25% риск обострения считают высоким. Изобретение позволяет оптимизировать диагностику и проводить своевременную профилактику обострений хеликобактериоза, а также оценивать эффективность эрадикационной терапии. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ определения риска обострений хеликобактериоза заключается в определении О- и VacA-антигенов Helicobacter pylori в прогретых (100°C, 20 мин) и непрогретых пробах слюны или кала реакцией коагглютинации согласно принятых методик на стекле и планшетах соответственно, отличающийся тем, что пробы биоматериала берут многократно (4-6 раз) в критические месяцы года (февраль-март, сентябрь-октябрь), вычисляют частоту встречаемости этих антигенов, и при высоких показателях частоты встречаемости O-антигена (≥50%) и низких значениях VacA-антигена (≤40%) риск возникновения обострения (диспепсия, гастрит, язвенная болезнь) считается вероятным, при показателе VacA-антигена ≤25% риск обострения считается высоким.