СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ HELICOBACTER PYLORI В РЕАКЦИИ КОАГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 G01N33/531 

Назначение: биотехнология, может быть использован в области медицины и ветеринарии, а именно в иммунологии, в частности для экспрессной диагностики заболеваний, ассоциированных с Неlicobacter pylopi.

Сущность изобретения: получают сыворотки при иммунизации кроликов прогретыми /для разрушения термолабильных антигенов/ бактериями разных штаммов Неlicobacter pylopi /Нр/, имеющих антигены палочковидных и кокковых форм; отбирают сыворотки с разным спектром антител к поверхностным термостабильным специфическим антигенам этих бактерий; сыворотками сенсибилизируют убитые формалином и прогреванием клетки Staphylococcus aureus штамм Cowan 1, которые затем отмывают, ресуспендируют, контролируют, консервируют; полученные препараты используют в качестве монодиагностикумов /не менее пяти/ при постановке реакции коагглютинации /РКА/ с рядом последовательных разведений исследуемого материала, а результаты учитывают по вычислению среднеарифметического титра антигенов Нр из этих пяти определений.

Способ позволяет получить диагностикумы для выявления антигенов Нр палочковидных и кокковых форм бактерий непосредственно в исследуемом материале.

Диагностика заболеваний, при которых Нр играет ключевую роль в этиологии и патогенезе/гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, миелосаркома желудка и др./трудна, многоэтапна, дорогостояща и нуждается в предварительном проведении гастродуоденоскопии, использовании изотопов, сложного оборудования.

Применение методов, позволяющих выявлять антигены-маркеры Нр непосредственно в биологическом материале от больных, таких как слюна, кал, кровь, является наиболее простым и доступным приемом диагностики, учитывая же безопасность и информативность, выявление антигенов Нр может быть использовано для скрининга инфекций, вызываемых этим возбудителем, мониторирования в ходе заболевания, определения сроков и полноты санации организма, оценки эффективности лечения.

Одним из таких методов является реакция коагглютинации /РКА/, используемая при многих инфекционных заболеваниях, в том числе кишечных /1/. Однако диагностикумы для выявления антигенов Нр с помощью этой реакции до последнего времени не были разработаны.

Известен способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров /поливалентный/ в РКА, предусматривающий получение сывороток иммунизацией кроликов культурами кампилобактеров разных серверов и видов, убитых прогреванием и ацетоном для разрушения термолабильных антигенов, иммунизацию кроликов в дозах 1-16 млрд микр. клеток, сенсибилизацию стафилококка смесью сывороток для получения поливалентного диагностикума. Этот способ выбран в качестве ближайшего аналога /2/.

Однако известный способ получения диагностикума для РКА не пригоден для получения хеликобактерного диагностикума вследствие особенностей антигенной структуры и иммунобиологических свойств этого возбудителя. Хеликобактеры имеют в своем составе большое количество термолабильных поверхностных белковых антигенов, перекрестно реагирующих с антигенами других бактерий. Термостабильные специфические антигены Нр недостаточно исследованы, специфический О-антиген /ЛПС/ слабо иммуногенен. Штаммы Нр, в том числе выделяемые от больных и тем более длительно культивируемые на питательных средах, весьма вариабельны по количественному и качественному составу антигенов, легко переходят из палочковидных в кокковые формы с иной иммунологической специфичностью. Даже выделяемые от больных штаммы Нр в 30% случаев могут состоять из кокковых форм.

Исходя из этих немногочисленных данных, а также принимая во внимание отсутствие хеликобактерных коммерческих диагностикумов для РКА, нами были проведены исследования антигенного состава этих бактерий, получены сыворотки и разработан способ получения препарата для диагностики заболеваний, ассоциированных с Нр.

Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, является то, что получен диагностикум для выявления термостабильных специфических антигенов - маркеров Нр в культурах, биологическом материале /слюна, кал, кровь/ от людей, не требующий предварительного проведения инвазивных процедур /гастродуоденоскопии, введения изотопов и др./, что делает его безвредным и безопасным, особенно для детей и тяжелобольных, и экономичным; использование диагностикума значительно сокращает время и упрощает проведение анализа. Он достигается тем, что отбирают штаммы хеликобатеров, популяция которых содержит в различных соотношениях палочковидные и кокковые формы бактерий, для иммунизации кроликов используют густые взвеси/30-33 млрд микр. тел/ этих бактерий; после прогревания бактерий при 100^oС в течение 10 мин и центрифугирования при 2000 об/мн в течение 10 мин проводят многократную /7-8 раз/ внутривенную иммунизацию кроликов в дозе 1 мл, кровь берут через 3, 5, 8 инъекций для определения антител к палочковидным и кокковым формам бактерий; для сенсибилизации стафилококка отбирают несколько /не менее 5/ сывороток с разным составом антител, на основе которых готовят монодиагностикумы, и реакцию коагглютинации ставят с каждым из них, смешивая на стекле с разведенным двукратно /от 1:5 до 1:80/ исследуемым материалом. Результат реакции учитывают по величине среднеарифметического титра антигенов из пяти определений. Агглютинацию стафилококка при разведении 1:5-1:9 считают слабо положительной, 1:10-1:19- положительной, 1:20 и более - резко положительной.

Диагностикум представляет собой комплект, включающий 5 емкостей, заполненных диагностикумами, приготовленными на основе пяти разных сывороток к палочковидным и кокковым формам Нр, и одной емкости с 1% взвесью стафилококка для отрицательного контроля.

Способ получения хеликобактерного диагностикума для выявления антигенов Нр и его возможное использование представлены в примерах.

Пример 1. Получение и отбор сывороток для изготовления хеликобактерных диагностикумов /предварительный этап/.

Использованы штаммы Helicobacter pylori АТСС 7392, НСТС 11637, НСТС 11639. Первый из них находился преимущественно в палочковидной форме, второй в палочковидной и кокковой форме, третий преимущественно в кокковой форме. Бактерии выращивали на Columbia агаре с антибиотиками и 5% лошадиной сыворотки или 7% эритроцитов крови человека 1/0/группы; густую взвесь бактерий /30-33 млрд микр. тел/мл по оптическому стандарту/ прогревали на водяной бане при температуре 100^oС в течение 10 мин для разрушения термолабильных антигенов Нр и белков крови, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин.

Иммунизацию кроликов породы шиншилла весом 4-5 кг проводят внутривенно, многократно /7-8 раз/ каждую неделю надосадочной жидкостью вышеназванных штаммов в дозе 1 мл, раздельно. Через 7-10 дней после 3-, 5-, 8-кратной иммунизации берут кровь из вены уха. Сыворотки исследуют в реакции коагглютинации на стекле, используя пробные диагностикумы.

Для получения пробных диагностикумов берут сыворотки от разных кроликов, иммунизированных штаммами Нр, разных по содержанию палочковидных и кокковых форм, после 3-, 5- и 8-кратного введения бактерий.

Сыворотки разводят 1: 2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:15, 1:20 физиологическим раствором натрия хлорида. Берут 0,1 мл каждого разведения сыворотки, добавляют 0,9 мл 10% взвеси отмытых и стабилизированных формалином /0,5% р-р формальдегида в течение 2 ч/ и прогреванием 85^oС в течение 2 ч/ Staph. aureus Cowan 1, перемешивают и доводят до 10 мл фосфатно-солевым буфером /pH 7,2/.

Приготовленные таким образом пробные диагностикумы контролируют путем постановки РКА с ЛПС и лиофилизированными разведенными десятикратно /10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 мг/мл/ лизатами бактерий штаммов Нр в палочковидной и кокковой формах, а также ЛПС других возбудителей кишечных инфекций /шигелл, сальмонелл, иерсиний, кампилобактеров, эшерихий/ и др. для определения чувствительности и специфичности.

При постановке РКА одну каплю каждого разведения антигена наносят на предметное стекло, разделенное на сектора стеклографом, и добавляют по одной капле диагостикума. В контроле вместо антигена помещают каплю ФСБ. Во втором отрицательном контроле вместо диагностикума помещают каплю взвеси несенсибилизированного 1% стафилококка. Капли осторожно перемешивают покачиванием стекла, стекла помещают во влажную камеру на 30 мин. Учет реакции проводят по 4-крестовой шкале, положительной считают реакцию на 1 крест /1+/.

Исследование пробных диагностикумов позволяет определить оптимальные разведения сывороток /максимальное разведение сыворотки, необходимое для получения диагностикума, дающего положительную реакцию со специфическими антигенами в разведениях 10^-1 мг/мл и более и не дающего агглютинации с несенсибилизированным стафилоккоком/, спектр антител в них к палочковидным и кокковым формам Нр, специфичность, и на основании этих критериев отобрать не менее 5 сывороток, необходимых для изготовления диагностикумов на конечном этапе производства.

Пример 2. Изготовление диагностикумов для определения антигенов хеликобатеров в реакции коагглютинации /конечный этап/.

Готовые диагностикумы в необходимом количестве получают на основе сывороток, отобранных при исследовании пробных диагностикумов и используя оптимальные их разведения. Технология получения описана в примере 1. Изготавливают комплекты диагностикумов, состоящие из пяти диагностикумов, способных выявлять антигены палочковидных и кокковых форм в их минимальной концентрации, и 1% взвеси стафилококка для отрицательного контроля.

Приготовленные таким образом диагностикумы должны быть специфичными и чувствительными. Они должны давать агглютинацию с ЛПС и лизатами хеликобактеров разных штаммов до концентрации 10^-1-10^-2 мг/мл и не давать реакцию с антигенами /ЛПС/ кампилобактеров разных видов и сероваров, а также других возбудителей кишечных инфекций и некоторых других, как представлено в таблице 1.

Пример 3. Применение диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori в динамике инфекционного процесса.

Выявление антигенов Нр у больных проводят в пробах слюны, кала. Слюну собирают утром натощак, до чистки зубов в чистые пенициллиновые флаконы или другие емкости в количестве 2-3 мл и используют при постановке РКА неразведенными и разведенными от 1:5 и выше. Кал помещают в такие же емкости в количестве 2-3 г, перед исследованием его разводят 1:5, взбалтывают, дают отстояться и надосадочную жидкость также как и слюну прогревают в водяной бане при температуре 100^oС в течение 20 мин, осветляют центрифугированием или фильтрованием через бумажный фильтр и используют для постановки РКА, как указано в примере 1, с каждым из пяти диагностикумов. Учет реакции проводят по определению среднеарифметического титра антигенов.

Как показано на чертеже, антигены Нр у здорового человека не определяются. После инфицирования антигены Нр обнаруживаются в течение 1-2 суток, затем выявляются в незначительных титрах. С началом клинических симптомов заболевания /тошнота, изжога, боль в области желудка, затем в тонком кишечнике, головная боль, температура/ антигены Нр обнаруживаются постоянно на высоком уровне. Высокий уровень антигенов Нр держится в период ранней реконвалесценции, затем постепенно снижается и периодически выявляется еще в течение 1-2,5 месяцев, после чего наступает стойкая длительная санация организма.

Применение хеликобактерных диагностикумов, т.о., позволяет проводить динамические исследования на наличие антигенов - маркеров Нр при инфекционном процессе, вызываемом этим возбудителем. Они позволяют определять Нр в период инфицирования, в процессе острого периода заболевания и в периоды ранней и поздней реконвалесценции, определять сроки и полноту санации организма от возбудителя.

Пример 4. Выявление антигенов Helicobacter pylori у больных острыми бактериальными кишечными инфекциями.

Пробы слюны и кала берут так же, как в примере 3.

Исследовано 345 человек, из числа которых по данным РКА с соответствующими диагностикумами больные дезинтерией Флекснера, Зонне, Ньюкасл составляли 23 человека, сальмонеллезом В,С₁,С₂,Д,Е серогрупп - 47 человек, иерсиниозом псевдотуберкулеза I и III сероваров, иерсиниозом энтероколитика, вызванным кишечными иерсиниями 03,09,07,8,06,30 - 63 человека, кампилобактериозом - 31 человек, а также 181 больной кишечными инфекциями, возбудитель у которых не был выявлен. Результаты определения антигенов Нр у больных этих групп представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, антигены Нр в биологических жидкостях больных кишечными инфекциями разной этиологии в диагностических титрах /1:10 и выше/ выявляются с высокой частотой - в среднем в 56,5% /от 29% до 83%/ случаев. Средний титр антигенов в этих группах колеблется от 1:40 до 1:82, в 4-12% случаев из числа положительных реакций отмечаются и более высокие титры - от 1:160 и выше.

Важно отметить, что маркер Нр в 1/3 случаев /29%/ в достаточно высоких титрах/1: 10 и выше/ обнаруживается в группе больных кишечными инфекциями, у которых другие патогенные возбудители не были обнаружены /группа ОКИНЭ/. Эти данные свидетельствуют о перспективности применения хеликобактерного диагностикума для определения патогенетической роли Нр при моно- и микст-инфекциях желудочно-кишечного тракта.

Применение диагностикумов для выявления антигенов - маркеров Нр непосредственно в биологическом материале от больных в реакции коагглютинации открывает широкие возможности для скрининга лиц, инфицированных Нр, мониторирования в ходе заболевания, ранней диагностики с целью своевременного назначения этиотропной терапии, объективной оценки тяжести и исходов заболевания, оценки полноты санации, определения бессимптомного бактерионосительства, оценки эффективности антибактериальной терапии, выявления микст-инфекций. Обладая специфичностью и достаточно высокой чувствительностью, не уступающей другим иммунологическим методам /например ИФА/, этот метод обладает рядом преимуществ - простотой, доступностью для малооснащенных лабораторий, быстрым получением ответа /1-2 ч/. Область применения: микробиология, эпидемиология, клиника, санитария, ветеринария, научные исследования патогенеза, иммунитета, профилактики заболеваний, ассоциированных с хеликобактериями.

Источники информации
1. Белая О. Ф. Итоги и перспективы применения реакции коагглютинации в качестве иммунологического метода выявления антигенов возбудителей кишечных инфекционных заболеваний // Патогенез, иммунология, клиника и диагностика инфекционных болезней. Сб. научн. тр. - М., 1992, - с.19-24.

2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Быстрова С.М., Петрухин В.Г., Прокофьева Е.М. Способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров. // Патент 2086984. БИ 22, 10.08.97.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской и ветеринарной иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori. Способ заключается в раздельной иммунизации кроликов надосадочной жидкостью густой взвеси 30-33 млрд. микр. тел/мл 2-3-суточных культур палочковидных и кокковых форм Helicobacter pylori после их прогревания и центрифугирования, с последующим получением от иммунизированных животных сывороток крови и сенсибилизацию полученными сыворотками клеток Staphylococcus aureus Cowan 1, причем для сенсибилизации отбирают не менее 5 сывороток, имеющих разный спектр антител к антигенам Helicobacter pylori. Способ обеспечивает получение диагностикумов для быстрого выявления Helicobacter pylori непосредственно в исследуемом материале, что позволяет сократить сроки диагностики. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ получения диагностикумов для выявления термостабильных антигенов патогенных бактерий, включающий раздельную иммунизацию кроликов культурами разных штаммов с последующим забором крови от каждого животного, выделением сыворотки, сенсибилизацию полученными сыворотками клеток Staphylococcus aureus Cowan 1, отмывкой, ресуспендированием и консервированием, отличающийся тем, что для получения диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori иммунизацию кроликов осуществляют надосадочной жидкостью густой взвеси (30-33 млрд. микр. тел/мл) 2-3-суточных культур палочковидных и кокковых форм бактерий после прогревания их при температуре 100^oС в течение 10 мин и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 10 мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для сенсибилизации стафилококка отбирают не менее 5 сывороток, имеющих разный спектр антител к антигенам палочковидных и кокковых форм Helicobacter pylori.