СРЕДА ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ Российский патент 2002 года по МПК C12N5/00 C12N5/06 C12N1/04 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к сохранению клеток и тканей человека, и может быть использовано при создании клеточных банков для нужд тканевой терапии.

Известно, что для долговременного хранения клеток используют специальные среды и вещества - криопротекторы, которые обеспечивают сохранность и жизнеспособность биологических объектов после размораживания [1].

Так известна среда для консервации лимфоцитов, содержащая в качестве основы стандартную среду 199, инактивированную человеческую сыворотку и в качестве криопротектора 10%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) [2]. Данная среда имеет следующий состав: 10% диметилсульфоксида, 20% инактивированной человеческой сыворотки, 70% среды 199 [3].

Концентрация лимфоцитов в криоконсервирующем растворе составляет 2,5•10⁴-2,5•10⁶ клеток/мл. В зависимости от концентрации клеток в растворе меняется их сохранность.

Также известна среда, содержащая в качестве криопротектора 12,5% раствор ДМСО, разведенный в аутологической сыворотке крови [4]. Концентрация лимфоцитов в данном криоконсервирующем растворе составляет 1-3•10⁶ клеток/мл.

К недостаткам известных сред относится невысокий процент жизнеспособных клеток через 3 месяца хранения, который составляет от 57,5% до 85,5-93,1% [2, 4] . Наибольшая сохранность лимфоцитов достигается при их минимальной концентрации 2,5•10⁴ в 1 мл питательной среды [2].

К недостаткам данных сред следует также отнести необходимость удаления ДМСО после размораживания, в связи с его токсическим действием по отношению к лимфоцитам, а также невозможность полного удаления ДМСО из клеток, т.к. он относится к внутриклеточным консервантам. Следствием чего является повышение трудозатрат при использовании этого криоконсерванта и дополнительное повреждающее действие на лимфоциты при отмывании ДМСО.

Также необходимо отметить низкую концентрацию лимфоцитов, подвергающихся криоконсервации в этих средах, и необходимость хранения замороженных клеток в жидком азоте.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда для консервации клеток печени [5]. Сущность известной среды заключается в том, что в качестве криоконсерванта она содержит низкомолекулярный поливинилпирролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов содержит питательную среду RPMI - 1629, 1% раствор альбумина, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
Среда RPMI-1629 - 10-10,5
Поливинилпирролидон - 1-1,5
1% Раствор альбумина человеческого - 3-3,6
Калий оротат - 1-1,2
рН 7,6
После криоконсервирования в известной среде и хранения в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток составляет 89,3±0,9%, после хранения в течение 12 месяцев - 87,5±0,5%.

К недостатку данной среды следует отнести то, что она не обеспечивает высокой жизнеспособности криоконсервированных клеток селезенки, так как предназначена для клеток печени. Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого технического решения был установлен процент жизнеспособных клеток селезенки на среде клеток печени, который составил 82,6±2,0% в режиме заморозка-оттаивание и 69% после 3-х месяцев хранения в замороженном состоянии.

Задачей заявляемого изобретения является разработка среды, обеспечивающей высокую жизнеспособность всех клеток селезенки, как лимфоцитов, так и макрофагов, моноцитов и ретикулярных клеток, при их длительном хранении в замороженном состоянии.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение жизнеспособности всех клеток селезенки при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие их слипания и обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации.

Эта задача решается применением среды, содержащей в качестве криоконсерванта низкомолекулярный поливинилпирролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду RPMI-1629. Кроме указанных компонентов среда также содержит калия оротат, рН среды 7,6.

Отличие предлагаемой среды заключается в том, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов она дополнительно содержит сыворотку эмбриональную телячью категории К055, дексаметазон Е-6 - 5,0 Е в 1 мл и липиды бобов сои без холестерина.

Предлагаемая среда для консервации клеток селезенки имеет следующее соотношение компонентов, мас.ч.:
Среда RPMI-1629 - 10-10,5
Поливинилпирролидон 10% - 1-1,5
Сыворотка эмбриональная телячья кат. К055 - 3-3,6
Калий оротат - 1-1,2
Дексаметазон Е-6 - 5,0 Е в 1 мл - 0,1
Липиды бобов сои без холестерина 17 мкг/мл - 1
рН 7,6
Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого изобретения установлено, что предлагаемая среда обеспечивает высокую жизнеспособность и отсутствие слипания клеток селезенки при хранении в замороженном состоянии длительное время - в течение 6 месяцев.

Основой предлагаемой среды служит стандартная среда RPMI-1629 [6], которая является питательным субстратом при культивации клеток селезенки.

Поливинилпирролидон является внеклеточным криоконсервантом, защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда, и не оказывает на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон является иммуностимулятором и обладает антитоксичным действием [7].

Авторами заявляемой среды экспериментальным путем установлено, что 10%-ная концентрация поливинилпирролидона обеспечивает высокую сохранность клеток.

Стандартная сыворотка эмбриональная телячья категории К055 и липиды бобов сои являются питательной добавкой к среде криоконсервации, обеспечивающей высокую сохранность клеток селезенки.

Известно, что при замораживании клетки интенсивно теряют калий, что приводит к "свинчиванию" цитоплазмы и потере их жизнеспособности.

Авторами заявляемого изобретения установлено, что перенасыщение среды калием, достигаемое за счет введения калия оротата, повышает жизнеспособность клеток при криоконсервации. Кроме этого также установлено, что калий оротат не позволяет клеткам слипаться при длительном хранении в замороженном состоянии.

Величина рН 7,6 является оптимальной для жизнедеятельности клеток селезенки, что и было установлено авторами экспериментальным путем.

Концентрация клеток селезенки при криоконсервации на заявляемой среде составила 2,15•10⁷ в 1 мл. Температура криоконсервации составила - 70^oС.

Указанный состав предлагаемой среды и условия хранения обеспечили высокую степень сохранности клеток после длительной, в течение 6 месяцев криоконсервации.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для криоконсервации клеток селезенки отличается от известной введением новых компонентов, а именно: сыворотки эмбриональной телячьей кат. К055, дексаметазона Е-6, липидов бобов сои без холестерина, и следовательно, обладает критерием патентоспособности "новизна".

Заявленная среда обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - обеспечение высокой жизнеспособности клеток селезенки при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток, обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации.

Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

При анализе известных сред для криоконсервации тканевых лимфоцитов было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемой среды на достижение технического результата.

Известных сред для криоконсервации всех выделенных клеток селезенки - лимфоцитов, макрофагов, моноцитов, ретикулярных клеток и в большей концентрации, нами не найдено, следовательно, изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Заявляемую среду готовят следующим образом.

К 5 мл сыворотки эмбриональной телячьей кат. К055, проверенной на цитотоксичность, добавляют 0,75 г стерильного калия оротата, 1 мл дексаметазона Е-6 - 5,0 Е в 1 мл, липиды бобов сои без холестерина - 17 мкг/мл в количестве 1 мл. Затем в суспензию вводят раствор консерванта. Для этого концентрированный поливинилпирролидон молекулярной массой 18 000 разводят на среде культивации RPMI - 1629 до получения 10% концентрации (9 мл питательной среды RPMI-1629±1 мл поливинилпирролидона). рН среды консервирования 7,6.

Среда RPMI-1629 /4/ имеет следующий состав:
Аминокислоты: мг/л
L-аланин - 13,90
L-аргинин-HCl - 42,10
L-аспарагин - 45,00
L-аспарагиновая кислота - 19,97
L-цистеин - 31,50
L-глутаминовая кислота - 22,10
L-глутамин - 219,20
Глицин - 7,50
L-гистидин-НСl•Н₂О - 20,96
L-гидроксипролин - 19,70
L-изолейцин - 39,36
L-лейцин - 39,36
L-лизин-НСl - 36,50
L-метионин - 14,90
L-фенилаланин - 16,50
L-пролин - 17,30
L-серин - 26,30
L-треонин - 17,90
L-триптофан - 3,10
L-тирозин - 18,10
L-валин - 17,60
Витамины:
Аскорбиновая кислота - 0,50
Биотин - 0,20
Холинхлорид - 5,00
Р-Са-пантотенат - 0,20
Фолиевая кислота - 10,00
I-инозит - 36,00
Никотинамид - 0,50
Никотиновая кислота - 0,50
n-Аминобензойная кислота - 1,00
Пиридоксаль-HCl - 0,50
Пиридоксин-HCl - 0,50
Рибофлавин - 0,20
Тиамин-HCl - 0,20
Витамин B₁₂ - 2,00
Соли:
CaCl₂ - 100,0
HCl - 400,0
MgSO₄•7H₂O - 200
NaCl - 6460,0
NaHCO₃ - 2200,0
NaH₂PO₄•7H₂O - 580,0
Другие компоненты
Феноловый красный - 10,0
Глюкоза - 3000,0
Глутатион - 0,50
Бакто-пептон - 600,0
Сыворотка эмбриона крупного рогатого скота - 0-30%
Выделенные клетки селезенки концентрируют путем центрифугирования и удаления супернатанта. Далее взвесь клеток аккуратно смешивают со средой криоконсервации, разливают по ампулам, замораживают и хранят при температуре - 70^oС.

Пример конкретного выполнения.

0,75 г стерильного калия оротата в 5 мл стерильной эмбриональной телячьей сыворотки кат. К055, проверенной на цитотоксичность, смешивают с 0,1 мл дексаметазона Е-6 (5,0 Е в 1 мл), 1 мл липидов бобов сои без холестерина (17 мкг/мл), а затем с концентрированной клеточной взвесью, приготовленной из селезенок поросят 1-2-дневного возраста. Затем в суспензию добавляют 10%-ный раствор поливинилпирролидона в среде RPMI-1629, при рН 7,6. Соотношение объемов поливинилпирролидона к клеточной взвеси с суспензией, как 1:2.

Оценку жизнеспособности консервированных клеток проводили с помощью теста "на исключение красителя", подсчет абсолютного количества клеток в 1 мкл, суправитальная окраска трипановым синим [8].

Для экспериментальной проверки были проведены исследования на 40 образцах клеточной взвеси, приготовленной из селезенок поросят 1-2-дневного возраста.

В суспензию клеток добавляли водный раствор красителя (трипановый синий) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывали число неокрашенных клеток.

Подсчет клеток лучше проводить при их концентрации 0,5-2•10⁶ кл/мл и в течение 1-5 мин после смешивания суспензии с красителем.

Число неповрежденных клеток после замораживания-оттаивания составило:
на заявляемой среде - 98,9±0,3%
на среде с ДМСО (аналог) - 70,7±0,7%
на среде с ПЭО-400 (прототип) - 95% (указано в источнике)
После криоконсервирования в заявляемой среде и хранения в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток составило 98,2±0,5%. Данные обработаны по методу Стьюдента.

При использовании среды - аналога через 6 месяцев хранения жизнеспособность клеток составила 70,8±0,6%.

Таким образом, предложенная среда обеспечивает высокую жизнеспособность клеток селезенки при длительном /6 месяцев/ хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к трансплантации, так как не требуется удаления среды криоконсервации и тем самым снижается травмирование клеток.

Источники информации
1. Биохимия мембран: Учеб. пособие для биол. и мед. спец. вузов/Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 3. А.М. Белоус, Е.М. Гордиенко, Л.Ф. Розанов. Замораживание и криопротекция. - М.: Высш. Шк., - С. 68-77.

2. Зарецкая Ю.М., Шахназарян А.М., Полянская И.С., Долбин А.Г. Выявление антигенов HLA-A и HLA-B на криоконсервированных лимфоцитах. - Пробл. Гематологии и переливания крови, 1978, 23, 3, с.50-53.

3. Morgan J.M., Campbell M.E., Morton H.J. Cell culture // J. Nat. Cancer Inst., Vol.16, 1955, p. 557.

4. Попов А.С., Мхеидзе Д.Г. Некоторые методические особенности длительного хранения лимфоцитов человека.// Бюлл. экспер. Биологии и медицины, 1976, 81(6), с.763-765.

5. Патент РФ RU 2161198, МКИ⁷ С 12 N 5/00, 5/08, 1/04. Среда для консервации клеток печени / С.А. Лепехова, О.А. Гольдберг (РФ).- 4 с.

6. Методы культуры клеток для биохимиков/ Пер. с англ. Р. Адамс. М.: Мир, 1983, с.230-231.

7. Климанский В.А., Рудаев Я.А. Трансфузионная терапия при хирургических заболеваниях. - М.: Медицина, 1984, С.39.

8. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ./ Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989. С.116.

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано при создании клеточных банков. Среда для криоконсервации клеток селезенки в качестве криопротектора содержит низкомолекулярный поливинилпирролидон, в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду RPMI-1629, сыворотку эмбриональную телячью и калия оротат. Предлагаемая среда обеспечивает высокую жизнеспособность и отсутствие слипания клеток селезенки при длительном хранении в замороженном состоянии и возможность трансплантации клеток без удаления среды криоконсервирования.

Среда для консервации клеток селезенки, содержащая среду RPMI-1629, калия оротат и криопротектор - низкомолекулярный поливинилпирролидон - рН 7,6, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сыворотку эмбриональную телячью категории К055, дексаметазон Е-6-5,0 Е в 1 мл, липиды бобов сои без холестерина 17 мкг/мл, при следующем соотношении компонентов, мас. ч. :
Среда RPMI-1629 - 10-10,5
Низкомолекулярный поливинилпирролидон - 1-15
Сыворотка эмбриональная телячья категории К 055 - 3-3,6
Калия оротат - 1-1,2
Дексаметазон Е-6-5,0 Е в 1 мл - 0,1
Липиды бобов сои без холестерина 17 мкг/мл - 1