СПОСОБ ХРАНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В СУСПЕНЗИИ Российский патент 2000 года по МПК C12N5/00 C12N5/08 C12N1/04 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении пространственно организованных клеточных структур и клеточных ассоциаций (суспензий).

Известен способ хранения культуры клеток в замороженном с криопротектором (глицерин или ДМСО) состоянии при -196^oC (жидкий азот) [1,2], а также способы хранения клеток крови в жидком состоянии при +4^oC с консервантом ЦОЛИПК-7Б [3].

Недостатком сохранения клеточной культуры в случае ее хранения в жидком азоте при температуре -196^oC является сохранение низкого процента жизнеспособных клеток (55-60%). Препарат ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии клеток после размораживания. Кроме того, при этом идет потеря до 30% клеток. Использование глицерина также приводит к разрушению клеток после размораживания.

Известен способ хранения культур клеток в жидком состоянии под давлением 400-500 атм с охлаждением до (-5) - (-6)^oC [прототип].

Однако этот способ не обеспечивает сохранности пространственной структурной организации клеточных ассоциаций и высокого уровня их жизнеспособности.

Задачей изобретения является обеспечение хранения клеточных культур в жидком состоянии с сохранением их пространственной 3-мерной структурной организации, возникшей в результате межклеточной адгезии и межклеточной кооперации.

Поставленная задача решается тем, что в способе хранения клеточных культур в суспензии путем охлаждения до (-3) - (-5)^oC при повышенном гидростатическом давлении согласно изобретению добавляют защитную питательную среду RPMI-1640 с добавлением 20%-ной фетальной сыворотки при поддерживании гидростатического давления в интервале от 450 до 550 атм.

Существенными признаками изобретения являются:
- смешивание клеточной суспензии со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки;
- применение повышенного гидростатического давления 450 - 550 атм.

Данный способ сохранения пространственной организации клеточных культур неизвестен из доступных литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Далее следует пример конкретного выполнения способа: культуры клеток человека, образующие 3-мерные структуры в суспензионном состоянии (лимфоцитарные и макрофагальные клеточные суспензии) смешивают со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением в нее 20%-ной фетальной сыворотки и заполняют в стерильный пластиковый контейнер объемом 5 мл без воздушного зазора. Пластиковый контейнер помещают в камеру высокого давления, которая представляет собой цилиндр с завинчивающимися пробками и с электровводами для измерения давления, контроля температуры и термоэлементом для ее поддержания в заданном режиме. Полость камеры высокого давления заполнена селиконовым маслом, которое бесконтактно передает создаваемое в камере ручным способом давление (450-550 атм) образцу. Охлаждение образцов в камере достигается либо подачей через проточную систему камеры жидкого азота, либо в криостате до заданной температуры. Образец с клеточной культурой необходимый период времени (например, 6 мес или 1 год) хранится при заданных условиях. По окончании сроков хранения камеру либо вынимают из криостата, либо подогревают до комнатной температуры включением термоэлемента, после чего плавно в режиме 10-20 атм/мин сбрасывается гидростатическое давление до атмосферного. Указанная последовательность операций и плавный сброс давления необходимы для предотвращения повреждающего действия высокого давления на клеточные ассоциации и предотвращения их замерзания. В случае сброса давления до уровня атмосферного без предварительного повышения температуры образцов до комнатной температуры культура клеток может подвергнуться замерзанию при отрицательной (ниже 0^oC) температуре. Учет результатов производят до и после воздействия по жизнеспособности клеток окрашиванием 0,4%-ным раствором трипанового синего и последующим подсчетом живых и мертвых клеток в камере Горяева по обычной методике, а также по сохранности организации тестируемых клеточных субпопуляций в 3-мерных клеточных структурах (кластерах), - процент которых определяют в сравнении с контрольными клеточными культурами.

В таблице приведены экспериментальные данные по конкретному выполнению заявленного изобретения.

Анализ таблицы показывает, что при известном способе (прототип) не сохраняется полная жизнеспособность клеток и 3-мерная структурная организация клеточной культуры нарушается уже через 24 ч их хранения в указанных условиях, а применение предлагаемого способа позволяет сохранять нативную структуру клеток долгое время.

Литература
1. Авторское свидетельство СССР N 1822782 "Способ консервирования тромбоцитов", опубликовано БИ 23, 93.

2. Кривохарченко А.С., Серобян Г.А., Садовников В.Б. Криоэмбриобанки - перспективная технология консервации генетических ресурсов лабораторных, домашних и диких животных для практического использования. Труды IV Международной конференции и дискуссионный научный клуб. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф: "IT+ME'98", 1998, т.1, с.380-383.

3. Гаврилов O.K., Кулешов Ю.Я. Массовая заготовка крови и ее компонентов. М.: Медицина, 1982.

4. Авторское свидетельство СССР N 1124974 "Способ хранения крови", опубликовано БИ 43, 84.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении пространственно организованных клеточных культур и клеточных ассоциаций. В клеточную суспензию добавляют свежую консервирующую питательную среду RPMI-1640 и вносят 20% фетальной сыворотки, в качестве которой предпочтительно используют сыворотку эмбриона крупного рогатого скота. Образец под гидростатическим давлением в 450-550 атм охлаждают до (-3) - (-5)°С. Способ обеспечивает сохранность пространственной структурной организации клеточных ассоциаций и высокий уровень их жизнеспособности. 1 табл.

Способ хранения клеточных культур в суспензии путем охлаждения до (-3) - (-5)^oC при повышенном гидростатическом давлении, отличающийся тем, что в суспензию клеточных культур вводят защитную питательную среду RPMI-1640 с добавлением 20%-ной фетальной сыворотки, а гидростатическое давление поддерживают в интервале 450 - 550 атм.