СРЕДА ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА Российский патент 2006 года по МПК C12N1/04 C12N5/08 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к сохранению клеток и тканей человека, и может быть использовано при создании клеточных банков для нужд трансплантационных методов лечения.

Известно, что для долговременного хранение клеток используют специальные среды и вещества - криопротекторы, которые обеспечивают сохранность и жизнеспособность биологических объектов после размораживания [1].

Так известна среда для консервации клеток островков Лангерганса, содержащая в качестве основы стандартную среду №199, 10% фетальную сыворотку и в качестве криопротектора 10%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Данная среда имеет следующий состав: 10%-ный раствор ДМСО, 10% фетальной сыворотки, 70% среды №199, пенициллин 100 U/мл, стрептомицин 100 μг/мл [2].

Концентрация клеток островков Лангерганса в криоконсервирующем растворе составляет 500-3000 клеток в 0,2 мл.

К недостаткам известной среды следует отнести невысокий процент жизнеспособных клеток, который через 3 месяца хранения составляет от 51% до 75% [2].

К недостаткам данной среды следует также отнести необходимость удаления ДМСО после размораживания, в связи с его токсическим действием по отношению к клеткам островков Лангерганса, а также невозможность полного удаления ДМСО из клеток, так как он относится к внутриклеточным консервантам. Следствием чего является повышение трудозатрат при использовании этого криоконсерванта и дополнительное повреждающее действие на клетки островков Лангерганса при отмывании ДМСО.

Также необходимо отметить низкую концентрацию островковых клеток, подвергающихся криоконсервации в этих средах и необходимость хранения замороженных клеток в жидком азоте.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда для консервации клеток печени [3].

В данной среде в качестве криоконсерванта содержится низкомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП), а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательная среда RPMI-1629, 1% раствор альбумина, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:

Среда RPMI-162910-10,5Поливинилпирролидон1-1,51% раствор альбумина человеческого3-3,6Калий оротат1-1,2

рН 7,6.

После криоконсервирования в известной среде и хранении в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток печени составляет 89,3±0,9%, после хранения в течение 12 месяцев - 87,5±0,5%.

К недостатку данной среды следует отнести то, что она не обеспечивает высокой жизнеспособности криоконсервированных клеток островков Лангерганса, так как предназначена для клеток печени. Так, экспериментальными исследованиями авторов заявляемого технического решения был установлен процент жизнеспособных клеток островков Лангерганса на среде клеток печени, который составил 87,4% (в режиме заморозки - оттаивание) и 64,1% после 3-х месяцев хранения в замороженном состоянии.

Задачей заявляемого изобретения является разработка среды консервации для клеток островков Лангерганса при их длительном хранении в замороженном состоянии.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение жизнеспособности клеток островков Лангерганса при их длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток и обеспечение возможности их трансплантации без удаления среды криоконсервации.

Поставленная задача решается средой, содержащей в качестве криоконсерванта низкомолекулярный поливинилпирролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду RPMI-1629. Кроме указанных компонентов среда также содержит калия оротат.

Отличие предлагаемой среды заключается в том, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов она дополнительно содержит сыворотку эмбриональную телячью кат. № К055, глюкозу, пируват и линолевую кислоту, при рН среды 7,4.

Предлагаемая среда для консервации островков Лангерганса имеет следующее соотношение компонентов:

Среда RPMI-16299 мл10%-ный раствор поливинилпирролидона1 млСыворотка эмбриональная телячья кат. № К0555 млКалий оротат0,75 г40%-ный водный раствор глюкозы1 млПируват 0,001 мкМ в 1 мл0,1 млЛинолевая кислота 0,016 мкМ в 1 мл0,4 мл

рН 7,4.

Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого изобретения установлено, что предлагаемая среда обеспечивает высокую жизнеспособность и отсутствие слипания клеток островков Лангерганса при хранении в замороженном состоянии длительное время - в течении 6 месяцев.

Основой предлагаемой среды служит стандартная среда RPMI-1629 [4], которая является питательным субстратом при культивации островков Лангерганса.

Поливинилпирролидон, является внеклеточным криоконсервантом, который защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда и не оказывает на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон является иммуностимулятором и обладает антитоксичным действием [5].

Авторами заявляемой среды экспериментальным путем установлено, что внесение в среду криоконсервации 1 мл 10%-ного раствора поливинилпирролидона обеспечивает высокую сохранность клеток.

Стандартная сыворотка эмбриональная телячья категории № К055 и глюкоза являются питательной добавкой к среде криоконсервации, обеспечивающей высокую сохранность клеток островков Лангерганса.

Авторами заявляемого изобретения установлено, что введение калия оротата повышает жизнеспособность клеток при криоконсервации. Кроме этого также установлено, что калий оротат не позволяет клеткам слипаться при длительном хранении в замороженном состоянии.

Величина рН 7,4 является оптимальной для жизнедеятельности клеток островков Лангерганса, что и было установлено авторами экспериментальным путем.

Концентрация клеток островков Лангерганса при криоконсервации на заявляемой среде составила 2·10⁶ в 1 мл. Температура криоконсервации составила -70°С.

Предлагаемый состав среды и условия хранения при -70° обеспечили высокую степень сохранности клеток после 6 месяцев криоконсервации.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для криоконсервации островковых клеток Лангерганса отличается от известной введением новых компонентов, а именно: 40%-ного водного раствора глюкозы, пирувата 0,001 мкМ в 1 мл, линолевой кислоты 0,016 мкМ в 1 мл, следовательно, обладает критерием патентоспособности "новизна".

Заявленная среда обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - обеспечение высокой жизнеспособности клеток островков Лангерганса при длительном хранении их в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток после размораживания, обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации.

При анализе известных сред для криоконсервации островков Лангерганса было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемой среды на достижение технического результата.

Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Среда, составляющая заявляемое изобретение, предназначена для использования в здравоохранении. Возможность ее приготовления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Состав заявляемой среды обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "промышленная применимость".

Заявляемую среду готовят следующим образом.

К 5 мл сыворотки эмбриональной телячьей кат. № К055, проверенной на цитотоксичность, добавляют 0,75 г стерильного калия оротата, 40%-ный водный раствор глюкозы в количестве 1 мл, пируват 0,001 мкМ в 1 мл в количестве 0,1 мл, линолевую кислоту 0,016 мкМ в 1 мл в количестве 0,4 мл. Затем в суспензию вводят раствор консерванта. Для этого концентрированный поливинилпирролидон молекулярной массой 18 000 разводят на среде культивации RPMI-1629 до получения 10%-ной концентрации, после чего к 9 мл питательной среды RPMI-1629 добавляют 1 мл 10%-ного раствора поливинилпирролидона. рН среды консервирования 7,4.

Среда RPMI-1629 имеет следующий состав:

Аминокислоты: мг/л

L-аланин13,90L-аргинин-HCl42,10L-аспарагин45,00L-аспарагиновая кислота19,97L-цистеин31,50L-глутаминовая кислота22,10L-глутамин219,20Глицин7,50L-гистидин-HCl·Н₂O20,96L-гидроксипролин19,70L-изолейцин39,36L-лейцин39,36L-лизин-HCl36,50L-метионин14,90L-фенилаланин16,50L-пролин17,30L-серин26,30L-треонин17,90L-триптофан3,10L-тирозин18,10L-валин17,60

Витамины:

Аскорбиновая кислота0,50Биотин0,20Холинхлорид5,00Р-Са-пантотенат0,20Фолиевая кислота10,00I-инозит36,00Никотинамид0,50Никотиновая кислота0,50n-Аминобензойная кислота1,00Пиридоксаль-HCl0,50Пиридоксин-HCl0,50Рибофлавин0,20Тиамин-HCl0,20Витамин В₁₂2,00

Соли:

CaCl₂100,0HCl400,0MgSO₄·7H₂O200,0NaCl6460,0NaHCO₃2200,0NaH₂PO₄·7H₂O580,0

Другие компоненты

Феноловый красный10,0Глюкоза3000,0Глутатион0,50Бакто-пептон600,0Сыворотка эмбриона крупнорогатого скота0-30%.

Выделенные островки Лангерганса концентрируют путем центрифугирования и удаления супернатанта. Затем взвесь клеток аккуратно смешивают со средой криоконсервации, разливают по ампулам, замораживают и хранят при температуре -70°С.

Пример конкретного выполнения.

0,75 г стерильного калия оротата в 5 мл стерильной эмбриональной телячьей сыворотки кат. № К055, проверенной на цитотоксичность, смешивают с 1 мл 40%-ного водного раствора глюкозы, 0,1 мл пирувата 0,001 мкМ в 1 мл, 0,4 мл линолевой кислоты 0,016 мкМ в 1 мл, а затем с концентрированной клеточной взвесью островков Лангерганса, приготовленной из поджелудочных желез новорожденных суточных поросят. Затем в суспензию добавляют 10%-ный раствор поливинилпирролидона в среде RPMI-1629. Соотношение объемов поливинилпирролидона к клеточной взвеси с суспензией, как 1:1.

Оценку жизнеспособности консервированных клеток проводили с помощью теста "на исключение красителя", подсчет абсолютного количества клеток в 1 мкл, суправитальная окраска трипановым синим.

Для экспериментальной проверки были проведены исследования на 68 образцах клеточной взвеси островков Лангерганса, приготовленной из поджелудочных желез новорожденных суточных поросят.

В суспензию клеток добавляли водный раствор красителя (трипановый синий) и в камере Фукса - Розенталя подсчитывали число неокрашенных клеток.

Подсчет клеток лучше проводить при их концентрации 0,5-2·10⁶ кл/мл, в течение 1-5 минут после смешивания суспензии с красителем.

Число неповрежденных клеток после замораживания-оттаивания составило:

на заявляемой среде -94,3±0,7%на среде с ДМСО (аналог) -68,7±1,2%на среде с ПВП (прототип) -87,4±0,9%

После криоконсервирования и хранения в заявляемой среде в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток островков Лангерганса составило 88,2±1,2%. Данные обработаны по методу Стьюдента.

При использовании среды-аналога через 6 месяцев хранения жизнеспособность клеток составила 62,8±0,9%.

Таким образом, предложенная среда обеспечивает высокую жизнеспособность островковых клеток Лангерганса при длительном (6 месяцев) хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к трансплантации, так как не требуется удаления среды криоконсервации и тем самым снижается травмирование клеток.

Источники информации

1. Биохимия мембран: Учеб. Пособие для биол. и мед. спец. Вузов. / Под ред. А.А.Болдырева. Кн.3. A.M.Белоус, Е.М.Гордиенко, Л.Ф.Розанов. Замораживание и криопротекция. - М.: Высш. Шк. - С.68-77.

2. Ray V.Rajotte, Garth L. Warnock, Norman M. Kneteman. Cryopreservation of insulin-producing tissue in rats and dogs. World J.Surg. 1984; Vol.8, p.179.

3. Патент РФ RU №2161198, МКИ⁷ С 12 N 5/00, 5/08, 1/04. Среда для консервации клеток печени / С.А.Лепехова, О.А.Гольдберг (РФ). - 4 с.

4. Методы культуры клеток для биохимиков: Пер. с англ. / Р.Адамс. - М.: Мир, 1983. - С.230-231.

5. Климанский В.А., Рудаев Я.А. Трансфузионная терапия при хирургических заболеваниях. - М.: Медицина, 1984, С.39.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано при создании клеточных банков для нужд трансплантационных методов лечения. Среда для консервации островков Лангерганса в своем составе содержит: Среду RPMI-1629 - 9 мл, 10%-ный раствор поливинилпирролидона - 1 мл, сыворотку эмбриональную телячью кат. № К055 - 5 мл, калий оротат - 0,75 г, 40%-ный раствор глюкозы - 1 мл, пируват 0,001 мкМ в 1 мл - 0,1 мл, линолевую кислоту 0,016 мкМ в 1 мл - 0,4 мл, рН 7,4. Среда обеспечивает высокую жизнеспособность (88,2±1,2%) клеток островков Лангерганса при длительном (6 месяцев) хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к трансплантации, снижается травмирование клеток.

Среда для консервации островков Лангерганса, содержащая среду RPMI-1629, калий оротат и криопротектор - низкомолекулярный поливинилпирролидон, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сыворотку эмбриональную телячью категории № К055, 40%-ный водный раствор глюкозы, пируват 0,001 мкМ в 1 мл, линолевую кислоту 0,016 мкМ в 1 мл, при следующем соотношении компонентов, мл:

Среда RPMI-1629910%-ный Раствор поливинилпирролидона1Сыворотка эмбриональная телячья кат. № К0555Калий оротат, г0,7540%-ный Раствор глюкозы1Пируват 0,001 мкМ в 1 мл0,1Линолевая кислота 0,016 мкМ в 1 мл0,4рН7,4