СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИ-, ПРООКСИДАНТНОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА (АОП) Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и медицине, тем их разделам, которые описывают окислительные процессы, не связанные с образованием (накоплением) энергии в дыхательной цепи митохондрий и четырехэлектронным восстановлением молекулы кислорода до молекулы воды, т.е. к характеристикам антиоксидантного статуса биологической системы.

В состоянии физиологического оптимума антиоксидантный статус организма характеризуется равновесием между двумя противоположными составляющими: уровнем свободно-радикального окисления и активностью антиоксидантной защиты. В обычных условиях это равновесие удерживает перекисное окисление на определенном низком уровне, препятствуя развитию цепных окислительных процессов. Как известно, про-, антиоксидантная система функционирует при сложном взаимоотношении субстратов системы и ферментов системы (6). Физиологическая антиоксидантная система при этом минимизирует аскорбатзависимое аутоокисление субстратов, контролируя процессы радикалообразования в тканях, модулирует ферментативное перекисное окисление, изменяя его интенсивность в соответствии с физиологическими потребностями организма (12). Т.е. в мембранах клеток поддерживается определенный постоянный уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ), необходимый для осуществления как синтетических функций (синтез простагландинов, стероидных гормонов и т.д.) (6, 7), так и, что особенно важно, для осуществления специфических мембранных функций: поддержание фосфолипидного состава и активности мембранных ферментов, регуляции проницаемости и активного ионого транспорта, фагоцитоза, мышечного сокращения и т. д. (5, 7). По данным ряда авторов (10), для реализации функционирования физиологической системы в организме поддерживается стационарная низкая концентрация липоперекисей порядка 10^-7÷10^-8 М/г липидов тканей. Изменения этих величин, наблюдаемые в некоторых тканях, связаны с интенсивностью обменных процессов. Доказано, что в активно метаболизирующих тканях (сердце, печень, почки, надпочечники) уровень ПОЛ, как правило, несколько повышен (7), в норме динамическое равновесие сдвинуто в сторону преобладания антиоксидантов (1). При переходе организма в режим более напряженной жизнедеятельности, связанной с изменениями внешних условий, реализацией различных поведенческих актов, выполнения работы и т.д., окислительно-восстановительный потенциал системы смещается в сторону увеличения прооксидантов (1).

В условиях действия на организм экстремальных факторов (токсиканты, радиация, гипоксия, гипотермия и т.д.) организм отвечает неспецифической реакцией активации (стресс), которая при определенных условиях может перейти в патологию (дистресс) и которая всегда сопровождается фазными изменениями антиоксидантной системы: от временного усиления до резкого падения антиоксидантного статуса.

Оценка антиоксидантного статуса организма и его компонентов производится разными методами (уровни субстратов ПОЛ и активности ферментов - ингибаторов и активаторов ПОЛ), а также неспецифическими методами: хемилюминесцентные, ЭПР и др. (6, 4, 8, 13, 3, 11), которые зачастую разведены по времени процесса, не согласуются в размерностях, могут характеризовать как систему, так и отдельную реакцию, а также иметь разную систематическую ошибку. Все это вместе может приводить к противоположному толкованию одного и того же процесса или состояния и соответственно к противоположным схемам коррекции процесса.

С целью уменьшения ошибочности оценки наблюдаемых процессов предлагается оценивать интегральный показатель - антиоксидантный потенциал (АОП) системы, представляющий собой безразмерную величину, которая для физиологической конкретной нормы равна 1,0 (100%). В случае усиления ПОЛ АОП уменьшается: 0<АОП<1,0, в случае ингибирования (ослабления) ПОЛ: АОП≥1.

При этом АОП расчитывается таким образом, что включает в себя любые измеряемые показатели антиоксидантной системы и надежность его оценки увеличивается с увеличением числа измеряемых параметров.

Предложенная схема и формула расчета АОП основывается на собственных экспериментальных данных по радиационным воздействиям и их коррекции в соответствии с представлением ряда авторов (2) об активации ПОЛ при радиационных воздействиях.

Общая характеристика экспериментов
Эксперименты проводились на беспородных крысах, самцах, массой 200-300 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Однократное тотальное рентгеновское облучение суммарной дозой 4,5 Гр проводили на установке РУМ-47; фракционированное облучение - на установке РУМ-17 с мощностью экспозиционной дозы 17,7 Р/мин, разовая поглащенная доза - 0,2 Гр в день, суммарная поглащенная доза - 5,0 Гр. Ткани для исследования выделялись в соответствии с требованиями методов. Препараты для коррекции облучения вводили внутрь зондом в виде 3-5% водных взвесей, контрольным животным вводили соответствующие пропорциональные объемы воды. Препарат "Полисорб" вводили в дозе 100 мг/кг; препарат "Полисорб + антиоксиданты" (полисорб + β-каротин + токоферол + селенит натрия) в соотношении 500+10+150+1 вводили в конечной дозе 100+2+30+0,2 мг/кг соответственно. Препарат "Полисорб + адаптогены" готовился путем смешивания 25 г полисорба, 2,5 г сухого экстракта родиолы розовой, 25 мл спиртовой настойки лагохилуса опьяняющего, 12,5 мл спиртовой настойки аралии маньчжурской, который вводился животным из расчета 120 мг/кг по сухому составу.

Пример 1 (см. табл. 1 и 1а).

Результаты, представленные в табл. 1 и 1a, свидетельствуют, что при остром облучении крыс (4,5 Гр) на 3 и 7 сутки после облучения наблюдаются заметные достоверные изменения показателей антиоксидантной системы во всех органах, характеризующих активацию ПОЛ. Эти изменения реализуются как на субстратном уровне (МДА, восстановленный глутатион, токоферол, ретинол), так и на ферментном (глутатиаонпероксидаза, глутатионредуктаза) и на неспецифическом (хемилюминесцентный метод регистрации процесса - аскорбатзависимое ПОЛ). При этом показатели повреждения возрастают, а показатели защиты падают.

Можно ввести понятие антиоксидантный потенциал (АОП), которое будет характеризовать повреждение и защиту в виде некой усредненной характеристики. При этом его можно оценивать по показателям повреждения отдельно, по показателям защиты отдельно, можно оценивать одновременно и по тем и другим, а также по отдельным тканям и всему организму.

Суть расчета заключается в том, что для оценки любого воздействия на организм или ткань при определении АОП показатели контрольных (исходных) величин должны делиться на показатели повреждения: Х_oj/Х_вj, а для показателей защиты наоборот: Х_вi/Х_oi, где X_oi и X_oj - показатели до воздействия, Х_вi и Х_вj - после воздействия. В таком случае получаем единую шкалу измерений, с результатами которой можно производить различные статистические действия и соответствующий анализ.

Пример 2 (см. табл. 2).

Из данных табл. 2 следует, что если принять АОП контрольных животных за 1,0 (100%), то независимо от способа измерения и измеряемого показателя по любому показателю при остром облучении крыс АОП падает. При этом наблюдаются определенные закономерности:
1) порядок и направленность изменений в каждой ткани подчиняется определенным закономерностям;
2) степень изменения АОП в тканях характеризует степень повреждения и чувствительностей тканей к воздействию;
3) для тканей печени, в которой измерялись как показатели повреждений, так и защиты, общая направленность изменений АОП сохраняется.

Таким образом, представляется возможность оценить суммарное (интегральное) изменение АОП в каждой ткани и во всем организме. Следует заметить, что направленность изменений АОП в крови носит противоположный характер изменениям в печени и кишечнике и эта направленность имеет прямой биологический смысл, т. к. в крови измеряются концентрации антиоксидантов, которые для тканей печени и кишечника являются расходными защитными веществами (см. табл. 3).

Результаты, представленные в табл.3, свидетельствуют, что суммарная оценка АОП печени на 3 и 7 дни наблюдений не отличается достоверно от АОП печени по деструктивным показателям и по показателям защиты. При этом АОП печени по показателям защиты достоверно выше, чем по показателям нарушений.

АОП организма по всем показателям близок по величине и суммарной АОП печени и динамика его изменений совпадает с динамикой изменений в печени.

Пример 3 (см. табл. 4 и 5).

Результаты экспериментов по фракционированному облучению показали, что через 1 и 3 месяца после начала воздействия состояние антиоксидантной системы печени, кишечника и крови близко к контрольным значениям. В тоже время обращает на себя внимание факт, что, если ориентироваться только на показатели деструкции (МДА и аскорбатзависимое ПОЛ), то создается впечатление, что происходит некоторое усиление антиоксидантной системы как в кишечнике, так и в печени. Это связано с тем, что и концентрация МДА и хемилюминесценция являются неустойчивыми динамическими характеристиками, сильно зависящими от многих факторов измерения и состояния организма и тканей (4, 7), опора только на них часто приводит к противоречивым результатам. Использование показателей защиты и в конечном итоге интегральной характеристики - АОП позволяет получить более достоверный, надежный результат, исключающий случайные отклонения в измеряемых показателях (см. табл. 6).

Данные табл.6 свидетельствуют, что АОП является чувствительной и дифференцирующей характеристикой состояний организма и коррекции патологических влияний с помощью различных препаратов. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при применении полисорба внутрь при остром облучении наблюдается некоторое недостоверное увеличение АОП, по-видимому, за счет детоксицирующего (очищающего) его действия. Сочетание полисорба с комплексом антиоксидантов приводит к достоверному повышению АОП организма, а сочетание полисорба с адаптогенами практически не отличается от эффектов собственно полисорба.

Длительное облучение малыми дозами слабо влияет на состояние АОП через 1 и 3 мес после начала облучения, аналогичные результаты наблюдаются и при коррекции выше указанными препаратами: введение полисорба несколько (не достоверно) снижает АОП организма; комбинация полисорба с антиоксидантами восстанавливает его до контрольных значений, а комбинация с адаптогенами - малоэффективна.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что рассчитываемый предлагаемым способом АОП обладает чувствительностью, дифференцирующей способностью и воспроизводимостью, надежность которых возрастает с увеличением числа измеряемых данных в обобщающей формуле:

где Х_oi и X_вi - показатели защиты до и после воздействия соответственно, a X_oj и X_вj - повреждения.

Собственные данные и данные литературы (12, 6, 13, 4, 7, 2, 1) позволяют обобщить показатели повреждения и защиты в таблице, которая, по-видимому, будет дополняться и уточняться по мере развититя представлений и методической базы при оценке антиоксидантного статуса организмов в норме и при различных воздействиях (см. табл. 7).

Знак вопроса в табл. 7 не позволяет в настоящее время считать соответствующие показатели принадлежащими данной группе из-за противоречий в литературе, различий измерения соответствующих величин.

Нами опубликована часть материалов в предварительном виде, которые прилагаются к описанию заявки (9) в виде приложения.

ЛИТЕРАТУРА
1. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии, 1991, т.111, вып.6, с.923-931.

2. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина Е.М. и др. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М., Н, 1975, 214 с.

3. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. и др. Изучение адаптивного антиокислительного действия суммы природных антиоксидантов липидов. Вопросы медицинской химии. 1990, 4, с.72-74.

4. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М, Н, 1972, 252 с.

5. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л., Н, 1986, с. 157-168.

6. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Сб. научн. статей. Рига, РМИ, 1988, 280 с.

7. Козлов Ю. П. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах. М., МГУ, 1973.

8. Коттон Г., Уилкинсон Дж. Современная неорганическая химия. М.: Мир, 1988, 246 с.

9. Лосев А. С., Фесюк А.Ф. Антиоксидантный потенциал (АОП) - системный критерий экологических нарушений и их коррекция. В кн.: Здоровье в XXI веке. Сб. материалов Всероссийской научно-практической конференции 28-30 сентября 2000 г. Тула, 2000, с.136-137.

10. Перекисное окисление и стресс. СПб, Н, 1992, 118 с.

11. Садовникова И.П. Влияние геропротекторов - антиоксидантов на иммунные реакции. М, ВИНИТИ, Итоги науки и техники, 1986, с.69-109.

12. Сорокина И.В., Крысин А.П., Хлебникова Т.Б. и др. Роль фенольных антиоксидантов в повышении устойчивости органических систем к свободно-радикальному окислению. Новосибирск, 1997, 68 с.

13. Толстиков Г.А. Реакции гидроперекисного окисления. М., Н, 1976, с. 11-28.

Изобретение относится к области медицины, в частности к характеристике антиоксидантного статуса биологической системы. Измеряют показатели защиты и деструкции антитоксидантной системы до и после воздействия экстремальных факторов с последующей оценкой влияния экстремальных факторов на АОП по формуле

где Xoi и Xвi - показатели защиты антиоксидантной системы до и после воздействия соответственно, a Xoj и Xвj - показатели повреждения до и после воздействия соответственно. Причем Xoi и Xoj = 1 и при АОП<1 оценивают влияние как негативное, а при АОП≥1 - как позитивное. Способ обеспечивает высокую точность оценки влияния экстремальных факторов на АОП. 7 табл.

Способ оценки влияния экстремальных факторов на антиокислительный потенциал (АОП) биологической системы и ее частей, включающий измерение показателей защиты и деструкции антиоксидантной системы до и после воздействия экстремальных факторов, с последующей оценкой влияния экстремальных факторов на АОП по формуле

где Xoi и Хвi - показатели защиты антиоксидантной системы до и после воздействия соответственно;
Xoj и Хвj - показатели повреждения антиоксидантной системы до и после воздействия соответственно,
причем Xoi и Xoj = 1 и при АОП<1 оценивают влияние как негативное, а при АОП≥1 - как позитивное.