СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и клинико-лабораторной диагностике и может быть использовано для установления степени тяжести патологического процесса, прогнозирования его течения и для оценки эффективности проводимой антиоксидантной терапии.

Известен способ определения антиоксидантной активности липидов крови (авт. свидетельство СССР N 1644033 G 01 N 33/49, 33/92), который заключается в том, что осуществляют экстрагирование липидов из крови или эритроцитов смесью гептана и изопропилового спирта с последующей сушкой гептанового экстракта, добавление к нему раствора азобисизобутиронитрила (инициатора), насыщение полученного раствора кислородом, термостатирование при 60^o + 0,2^oC и манометрическое определения количества поглощенного кислорода с последующим расчетом периода индукции и скорости окисления.

Однако этот способ трудоемок, поскольку требует осуществления как большого количества операций, так и выполнения сложных расчетов.

Известен также способ определения активности антиоксидантов методом регистрации хемилюминесценции (ХЛ) митохондрий в присутствии ионов Fe^** (Владимиров Ю.А., Тафельштейн Э.Е., Козлов Ю.П. Докл. АН СССР, 1969. - 188. - с. 1163) или (Добрина С.К., Владимиров Ю.А., Дубур Г.Я. в сб. "Симпозиум. Свободнорадикальные состояния и их роль при лучевом поражении и злокачественном росте. Тезисы докладов." - М., 1971. - с. 33), который заключается в том, что осуществляют регистрацию ХЛ смеси, включающей суспензию митохондрий печени крысы, среду инкубации и раствор исследуемого жиростворимого антиоксиданта в метиловом или этиловом спирте. Активность антиоксиданта рассчитывают по уравнению с учетом его концентрации и тангенсов углов наклона полулогарифмических кривых с антиоксидантом и без него.

Однако этот способ не позволяет определить суммарный антиокислительный потенциал крови, обусловленный не только жирорастворимыми (витамины E, A, K; стерины, убихинон; фосфолипиды), но и водорастворимыми (серосодержащие соединения; витамины C, B6, PP; серотонин и др.) биоантиоксидантами и ферментами, тормозящими процесс перекисного окисления липидов (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глутатионпероксидаза).

Кроме того, данный способ предлагает приготовление суспензии митохондрий лечение крысы. Эта операция трудоемка и требует для своего выполнения наличия лабораторных животных, что не является доступным в условиях поликлиник и больниц.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения общей антиоксидантной активности биологических субстратов на липопротеидной желтковой модели - НИЦ "Биоавтоматика" г. Нижний Новгород. (Инструментальная методика. Определение общей антиоксидантной активности биологических субстратов на липопротеидной желтковой модели, 1991 г.). Объекты исследования - разведенные изотоническим раствором хлорида натрия моча пациента (в 5 раз) и сыворотка крови (в 10-30 раз). Используемые реактивы: 0,02 мМ раствор сульфата железа готовят растворением навески 0,28 г в 50 мл дистиллированной воды непосредственно перед употреблением. Фосфатный буфер готовят растворением навесок KH₂PO₄ - 1,361 г и KCl - 3,9144 г в 500 мл дистиллированной воды; до необходимой pH 8,5 доводят с помощью таблетированной формы KOH. В буфер добавляют 0,01 мл 30% раствора перекиси водорода на 100 мл буфера и используют в сроки не более 2-х недель. Готовят липопротеидную модель приготовлением сначала основного (маточного) раствора желтков, затем рабочего. Маточный раствор приготавливают из свежего яйца. Желток отделяют от белка, вносят в мерный цилиндр, добавляют равное количество дистиллированной воды, тщательно перемешивают; хранят не более 10 дней при +4^oC. Рабочий раствор готовят из маточного раствора путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1:24. Раствор люминола 0,1 мМ готовят растворением 2 мг люминола в 200 мкл диметилсульфоксида и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл. Способ проводят следующим образом: по величине амплитуды первого пика ХЛ определяют интенсивность перекисного окисления липидов липопротеидной модели, а по величине амплитуды второго пика ХЛ определяют интенсивность остаточного перекисного окисления липидов липопротеидной модели после ингибирования антиоксидантами сыворотки крови или мочи пациента. В кювету вносят по 0,2 мл раствора сульфата железа, фосфатного буфера, люминола и рабочего раствора желтковых липопротеидов. Тщательно перемешивают и помещают кювету в измерительную камеру хемилюминометра. Включают регистрацию сигнала свечения. Кривая ХЛ записывается в течение 40-60 с и при появлении второго пика ХЛ вносят 0,1 мл разведенной сыворотки крови или мочи и вновь регистрируют пик свечения.

Однако этот способ не дает высокой воспроизводимости результатов и не обладает достаточной точностью. Реакция, развивающаяся при смешивании липопротеидной модели с реактивами, характеризуется мгновенно нарастающей скоростью, что находит отражение в возникновении пика ХЛ.

Однако, согласно способу, кювету с уже внесенными липопротеидной моделью и реактивами помещают в измерительную камеру хемилюминометра, предварительно тщательно перемешав содержимое кюветы, и только потом осуществляют включение регистрации сигнала свечения. Эти манипуляции требуют времени большего, чем время возникновения вспышки свечения. Поэтому начальная часть информационной картины остается не зарегистрированной, что снижает точность способа.

Кроме того, в процессе работы происходит окисление железа, находящегося в растворе, и происходит падение от исследования к исследованию амплитуды пиков ХЛ; использование маточного раствора люминола приводит к возникновению пика ХЛ, амплитуда которого настолько велика, что при регистрации происходит зашкаливание; смешивание липопротеидной модели и реактивов, в том числе люминола, производится на свету, что приводит к искажению результатов, так как люминол поглощает кванты света извне и, следовательно, увеличивает интенсивность свечения смеси; второй пик ХЛ возникает не всегда и не всегда его амплитуда равна амплитуде первого пика.

Задачей заявляемого способа является устранение названных недостатков и повышение точности.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе определения суммарной антиоксидантной активности крови, включающем подготовку исследуемых проб крови пациента, подготовку реактивов растворением сульфата железа, люминола, фосфатного буфера, подготовку липопротеидной модели, смешивание исследуемых проб с реактивами, регистрацию амплитуд пиков ХЛ полученной смеси, по разнице которых судят о величине суммарной антиоксидантной активности крови, в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму пациента, раствор сульфата железа готовят в концентрации 0,01 мМ путем растворения навески в кипящей дистиллированной воде и центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла, подготовку раствора люминола осуществляют путем разведения основного (маточного) раствора дистиллированной водой в соотношении 1:1000, в качестве запускающего реакцию вещества применяют перекись водорода в виде 2%-ного раствора, соединение исследуемой среды с реактивами осуществляют в следующей последовательности: в фосфатный буфер вводят липопротеидную модель, исследуемую цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента, затем в условиях темноты, без доступа света в измерительную камеру вводят раствор люминола, сульфата железа, а раствор перекиси водорода вводят в реакцию после включения регистрации сигнала свечения, причем исследование ведут при перемешивании, начиная с момента введения липопротеидной модели. Кроме того, другими усовершенствованиями заявляемого способа являются обеспечение pH буфера равным 7,5 с последующим центрифугированием его и перенесением супернатанта в другую посуду; измерение шумового сигнала перед исследованием каждой пробы; разделение приготовленного основного (маточного) раствора желтков на порции для заданного ряда исследований на один день работы с возможностью хранения при -20^oC в течение 3-х месяцев.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят взятие крови пациента в количестве 1-1,5 мл и смешивают с 3,8%-ным раствором цитрата в соотношении 9: 1. Полученную стабилизированную кровь центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, затем полученную богатую тромбоцитами цитратную плазму крови пациента центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. Для исследования отбирают верхний слой - цитратную бестромбоцитарную плазму, которую разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:9. Затем приготавливают реактивы, необходимые для проведения анализа: 1.0, 01 мМ раствор FeSO₄ готовят растворением навески 0,035 г в 12,5 мл кипящей (для удаления кислорода) дистиллированной воды. Полученный раствор центрифугируют при 1000 об/мин в герметично закрытой посуде, затем супернатант переносят в другую пробирку и помещают под слой химически инертного масла, например вазелинового, для предотвращения доступа кислорода. Раствор сульфата железа готовят непосредственно перед проведением анализа и не используют на следующий день. 2. Фосфатный буфер готовят растворением навесок KH₂PO₄ - 1,361 г и KCl - 3,9144 г в 500 мл дистиллированной воды. До необходимой величины pH 7,5 доводят с помощью таблетированной формы KOH. Буфер хранят при +4^oC. Необходимое для одного рабочего дня количество буфера центрифугируют при 1000 об/мин. Прозрачный супернатант переносят в другую посуду. 3. Основной (маточный) раствор люминола 0,1 мМ готовят растворением 2 мг люминола в 200 мкл диметилсульфоксида и полученный раствор доводят дистиллированной водой до объема 100 мл. Раствор хранят в посуде темного стекла при +4^oC. Затем готовят рабочий раствор люминола разведением основного раствора дистиллированной водой 1: 1000. Его хранят в посуде темного стекла при +4^oC не более 3-4-х недель. 4. Готовят липопротеидную модель из яичного желтка. Сначала готовят основной (маточный) раствор из свежего яйца. Отделяют желток от белка, наконечником дозатора прокалывают оболочку желтка и отбирают внутреннее содержимое желтка без оболочек. К полученному количеству желтка добавляют такое же количество дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Полученную желтковую эмульсию разливают порциями для заданного ряда исследований на один день работы и хранят при -20^oC не более 3-х месяцев. Рабочий раствор желтков готовят непосредственно перед проведением исследования добавлением дистиллированной воды к маточной эмульсии желтков в соотношении 24:1. На следующий день рабочий раствор не используют, 5.2% раствор перекиси водорода готовят разведением 2 мл стандартного пергидроля 28 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде темного стекла при +4^oC не более 2-х недель. Способ осуществляют в следующей последовательности и при следующих режимах. Проведение исследования осуществляют в два этапа: на первом этапе определяют степень перекисного окисления липидов липопротеидной модели (контроль), на втором - степень остаточного перекисного окисления липидов липопротеидной модели в результате ингибирования этого процесса антиоксидантами исследуемой плазмы крови (опыт). Исследование процесса перекисного окисления липидов проводят методом хемилюминесценции. К кювету вносят 0,4 мл фосфатного буфера и 0,1 мл рабочего раствора желтков, который перед внесением в кювету тщательно перемешивают. Последнюю помещают в светозащищенную измерительную камеру хемилюминометра, 0,2 мл рабочего раствора люминола и 0,2 мл раствора сульфата железа вносят в кювету, используя дозаторы с наконечниками, на которые надеты чехлы из светоизолирующего материала, препятствующие доступу света извне.

Включают регистрацию сигнала свечения, после чего в кювету вносят 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода дозатором с наконечником, защищенным от света, причем дозатор не вынимают из гнезда камеры до окончания реакции. Регистрацию сигнала свечения каждой пробы ведут в течение 30-40 с. При анализе кривой ХЛ определяют амплитуду пика А (в импульсах), по величине которой судят о степени перекисного окисления липидов липопротеидной модели. Определение повторяют 3-5 раз и вычисляют среднее значение (A1). Повторяют процесс в вышеизложенной последовательности с изменением количества фосфатного буфера - 0,3 мл и введением в систему 0,1 мл разведенной цитратной бестромбоцитарной плазмы крови пациента после внесения в фосфатный буфер 0,1 мл рабочего раствора желтков. Регистрация, снятие амплитуды пика хемилюминесценции, определение ее средней величины (A2) проводят аналогично контролю. Суммарную антиоксидантную активность плазмы крови определяют аналогично прототипу: сначала определяют величину A2 в %, приняв величину A1 равной 100%, а затем вычисляют суммарную антиоксидантную активность плазмы крови по формуле: X(%) = 100% - A2(%).

Способ апробирован в условиях Саратовского НИИ кардиологии при СГМУ и дал положительные результаты.

Технико-экономический эффект заявляемого способа заключается в повышении точности проводимых исследований крови, так как компоненты вводят в смесь в предложенной последовательности и внесение раствора перекиси водорода осуществляют после включения записи сигнала свечения, что позволяет точно зарегистрировать пик ХЛ и, следовательно, исключить утрату имеющей большое значение информации о начале исследуемого процесса; используют более стабильной в силу предотвращения окисления раствор сульфата железа, что повышает воспроизводимость результатов; используя рабочий раствор люминола (1:1000), что позволяет получать в контроле пик ХЛ с воспроизводимой амплитудой; исследование проводят в условиях темноты, что препятствует искажению результатов за счет внешних источников света; исследование проводят в условиях перемешивания, что препятствует осаждению липопротеидной модели, искажающему картину ХЛ; в течение 3-х месяцев одну и ту же липопротеидную модель, что не только повышает экономичность способа, но и также повышает воспроизводимость получаемых данных.

Кроме того, использование цитратной бестромбоцитарной плазмы крови пациента переводит способ в разряд экономичных, целесообразных, щадящих способов исследования, повышает уровень культуры производства медицинских исследований и технологий, так как позволяет обойтись без специального взятия крови и совместить, например, данное исследование с коагулологическими, иммунологическими и другими исследованиями, объектом которых служит плазма крови пациента.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии медицины и клинико-лабораторной диагностике, и может быть использовано для установления степени тяжести патологического процесса, прогнозирования его течения и для оценки эффективности проводимой антиоксидантной терапии. Способ определения суммарной антиоксидантной активности крови включает подготовку исследуемых проб крови пациента, подготовку реактивов растворением сульфата железа, люминола, фосфатного буфера с рН 7,5, подготовку липопротеидной модели, смешивание исследуемых проб с реактивами, регистрацию амплитуд пиков хемилюминесценции (ХЛ) полученной смеси, по разнице которых судят о величине суммарной антиоксидантной активности крови, в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента, раствор сульфата железа готовят в концентрации 0,01 мМ путем растворения навески в кипящей воде и центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла, подготовку раствора люминола осуществляют путем разведения основного (маточного) раствора дистиллированной водой в соотношении 1: 1000, в качестве запускающего реакцию вещества применяют перекись водорода в виде 2%-ного раствора, соединение исследуемой среды с реактивами осуществляют в следующей последовательности: в фосфатный буфер вводят липопротеидную модель, исследуемую цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента, затем в условиях темноты без доступа света в измерительную камеру вводят растворы сульфата железа и люминола, а раствор перекиси водорода вводят в реакцию после включения регистрации сигнала свечения, причем исследование ведут при перемешивании, начиная с момента введения липопротеидной модели. После внесения раствора перекиси водорода дозатор не вынимают из гнезда измерительной камеры до окончания исследования. Способ обеспечивает высокую точность определения. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ определения суммарной антиоксидантной активности крови, включающий подготовку исследуемых проб крови пациента, подготовку реактивов растворением сульфата железа, люминола, фосфатного буфера, подготовку липопротеидной модели, смешивание исследуемых проб с реактивами, регистрацию амплитуд пиков хемилюминесценции (ХЛ) полученной смеси, по разнице которых судят о величине суммарной антиоксидантной активности крови, отличающийся тем, что в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму пациента, раствор сульфата железа готовят в концентрации 0,01 мМ путем растворения навески в кипящей воде и центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла, подготовку раствора люминола осуществляют путем разведения основного (маточного) раствора дистиллированной водой в соотношении 1 : 1000, в качестве запускающего реакцию вещества применяют перекись водорода в виде 2%-ного раствора, соединение исследуемой среды с реактивами осуществляют в следующей последовательности: в фосфатный буфер вводят липопротеидную модель, исследуемую цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента, затем в условиях темноты без доступа света в измерительную камеру вводят раствор люминола и сульфата железа, а раствор перекиси водорода вводят в реакцию после включения регистрации сигнала свечения, причем исследование ведут при перемешивании, начиная с момента введения липопротеидной модели. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обеспечивают pH фосфатного буфера 7, 5, центрифугируют его и супернатант переносят в другую посуду. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед исследованием каждой пробы проводят измерение шумового сигнала. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что липопротеидную модель - основной (маточный) раствор желтков разливают порциями для заданного ряда исследований на один день работы и хранят при -20^oС не более 3 месяцев. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дозатор не вынимают из гнезда измерительной камеры после внесения последнего реагента до окончания реакции.