СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРООКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 G01N33/49 G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам определения прооксидантной активности (ПОА) биологического материала. Многие патологические состояния и заболевания, такие как гипоксия, старение, стресс, злокачественные новообразования, воспалительные заболевания различной локализации, инфаркт миокарда, острые и хронические отравления и т.д., сопровождаются активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Ю.А.Владимиров, А.И. Арчаков, 1972; И. В. Александрова и соавт., 1988; Е.В.Бурлакова и соавт., 1975-1982; В.З. Ланкин, 1980 и др.). В настоящее время большое внимание уделяют исследованию антиоксидантной активности (АОА) биологического материала, для чего предложены многочисленные методики (Е.В.Спектор и соавт.,1984; Г.И. Клебанов и соавт., 1988 и др.). Считается, что АОА обусловлена находящимися в биологическом материале SH- соединениями, стероидными гормонами, альфа-токоферолом, СОД и другими ферментативными системами, обезвреживающими свободные радикалы (А.В.Козлов и соавт., 1984; Stocks J., et al., 1974). Однако не вызывает сомнений тот факт, что, кроме перечисленных выше соединений, в биологическом материале содержатся и вещества, которые способствуют активации ПОЛ. К ним относятся металлы переходной валентности, аскорбиновая кислота, переокисленные липиды и свободные радикалы, свободный гемоглобин, ферментативные системы, генерирующие свободные радикалы, активированные полиморфноядерные лейкоциты и др. (Ю.А.Владимиров, А. И. Арчаков, 1972). Принимая во внимание тот факт, что многими авторами найдены продукты ПОЛ в плазме у здоровых людей (В.Б.Гаврилов и соавт., 1983; Т.Н.Федорова и соавт., 1983; Н. К. Мишина и соавт., 1978 и др.), можно сделать вывод, что прооксидантная система плазмы крови обладает довольно мощным потенциалом, который, по-видимому, значительно возрастает при патологических состояниях и заболеваниях и может иметь значение для их развития. Все вышесказанное делает очевидным необходимость определения ПОА биологического материала.

Наиболее эффективно применение способа для определения ПОА биологического материала при изучении ПОЛ и механизмов его регуляции в организме человека как в норме, так и при различных патологических состояниях и заболеваниях.

Известен способ определения прооксидантной активности витамина D2 (эрго-кальциферола), заключающийся в том, что о прооксидантной активности витамина D2 судят по количеству образовавшегося в суспензии эритроцитов малонового диальдегида (МДА) при инкубации их с витамином D2 (В.Б.Спиричев, Н. В. Блажиевич //Вопр. мед. химии.-1969.-Т.XIV, вып. 4.- С. 371-374). Также известен способ определения оксидантной активности перекиси водорода, заключающийся в том, что об окислительной активности судят по степени гемолиза эритроцитов, инкубируемых с перекисью водорода.

Однако известные способы малоэффективны, так как позволяют определить ПОА только какого-либо химического агента, а не самих эритроцитов или плазмы крови. Кроме того, оба эти способа используются только для оценки перекисной устойчивости эритроцитов.

Наиболее близким по достигаемому результату является способ определения проокислительной активности химических веществ (но не сложных биологических систем, которыми являются плазма, эритроциты или ткань, содержащие, помимо прооксидантов, и мощные антиоксидантные системы) - путем введения исследуемого вещества в модельную систему, содержащую субстрат и инициатор свободнорадикального окисления с последующей регистрацией хемилюминесценции, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют олеиновую кислоту в концентрации 6 мг/мл в этанол-фосфатном буфере, в качестве инициатора-1,2% раствор перекиси водорода, а прооксидантную активность определяют по нарастанию величины светосуммы быстрой вспышки хемилюминесценции после добавления исследуемого вещества (заявка 4634881/30-14 (006521) 1986 год).

K недостаткам известного способа следует отнести возможность исследовать ПОА только относительно простых химических веществ, которые и были испытаны авторами способа (адренохром, азид натрия, соль железа и т.п.), так как имеющиеся в биологическом материале вещества с антиоксидантными свойствами всегда подавляют процессы ПОЛ в данной модельной системе. Не случайно именно на этом принципе построено большинство методик для исследования антиокислительной активности биологического материала (олеиновая кислота+продувка воздухом + исследуемый биологический материал - А.В.Алексеенко//Радиобиология. - 1966.-N6.-С.718-720; желток куриного яйца + ионы железа и аскорбиновая кислота + биологический материал- Г.И.Клебанов и соавт.//Лаб.дело.-1988.-N5. -С.59-62; гомогенат мозга экспериментального животного или суспензия липосом+ активатор+биологический материал-L.Stocks et al.//Clin.Sci.molec.Med.-1974. -Vol. 47, N2.-P.215-222 и т.п.). Кроме того, в известном способе определяется только способность вещества инициировать окисление по "нарастанию светосуммы быстрой вспышки хемилюминесценции после добавления исследуемого вещества", в то время как для биологического материала активация перекисного окисления не является залогом того, что оно будет продолжаться, т.к. будут взаимодействовать разнонаправленные процессы - активация перекисного окисления и его ингибирование. В этом случае итог взаимодействия можно определить только по накоплению одного из конечных продуктов перекисного окисления - малонового диальдегида или шиффовых оснований, что и используется в предлагаемом нами способе. И последнее - предлагаемый нами способ определения ПОА выгодно отличается от прототипа своей простотой и доступностью для любой клинико-диагностической лаборатории, начиная с уровня районной больницы, т. к. не требует дорогостоящего оборудования или химреактивов, а также больших затрат труда персонала.

Положительными результатами являются выявление прооксидантной активности биологического материала и упрощение способа. Положительный результат достигается тем, что в качестве субстрата используют Твин-80, в качестве инициатора биологический материал, а прооксидантную активность определяют по накоплению в модельной системе конечного продукта перекисного окисления - малонового диальдегида.

Способ осуществляется следующим образом.

РЕАКТИВЫ: 1. 1% раствор Твина-80;
2. 40% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
3. 0,25% раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

ТЕХНИКА ВЫПОЛНЕНИЯ: в 2 стеклянные колбы с притертой пробкой объемом 200 мл вносят по 2 мл Твина-80. Затем в одну из них прибавляют биологического материала в количестве, эквивалентном 0,001 г/л белка, а в другую - соответствующий объем дистиллированной воды. Затем колбы закрывают крышками и помещают в термостат при 40^oC на 48 часов. После истечения времени инкубации все колбы извлекают из термостата и в каждую добавляют, для остановки реакции, по 1 мл ТХУ, после чего содержимое колб перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 60 мин. После этого содержимое колб переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 мин, 2 мл супернатанта смешивают с 2 мл ТБК, и пробы нагревают на водяной бане в течение 15 мин. При этом ТБК реагирует с МДА с образованием химического соединения, имеющего розовую окраску. Пробы охлаждают и спектрофотометрируют в 1 см кювете при длине волны 532 нм.

Расчет ПОА производят по формуле:
ПОА= Е_оп. - Е_контр./Е_оп.•100%,
где
Е_оп. - экстинкция опытной пробы;
Е_контр. - экстинкция контрольной пробы.

Для изучения возможности клинического применения способа была обследована группа лиц с различными заболеваниями: гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца (ИБС), вегетососудистая дистония, бронхиальная астма, хронический бронхит и пневмония. Контрольную группу составили 10 практически здоровых доноров. Полученные результаты представлены в таблице.

Как следует из данных, приведенных в таблице, имеется достоверная разница в уровнях ПОА плазмы крови между контрольной группой и группами больных с гипертонической болезнью, бронхиальной астмой, хроническим бронхитом. Отмечается умеренное повышение ПОА у больных ИБС.

Таким образом, заявляемый способ может быть эффективно применен для диагностики нарушений ПОА в нашем примере плазмы крови при различных патологических состояниях, что может способствовать более раннему назначению соответствующего лечения в плане коррекции антиокислительного гомеостаза.

Способ может быть использован в медицине, а именно при лечении ишемической болезни сердца, атеросклероза, пневмонии, гипертонической болезни. В качестве субстрата используют Твин-80, в качестве инициатора плазму крови, а прооксидантную активность определяют по накоплению в модельной системе конечного продукта перекисного окисления - малонового диальдегида. Способ обеспечивает выявление прооксидантной активности биологического материала и упрощение способа. 1 табл.

Способ определения прооксидантной активности плазмы крови путем стимуляции исследуемым материалом автоокисления субстрата и определения прооксидантной активности по количеству малонового диальдегида путем спектрофотометрирования, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют Твин-80.