СПОСОБ СЕРОДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI-ИНФЕКЦИИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ АНАЛИЗОМ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 G01N33/53 

Изобретение относится к области диагностики заболеваний и может найти применение в диагностике заболеваний гастродуоденальной сферы и других патологических состояний, ассоциированных с инфекцией, вызванной возбудителем рода Helicobacter pylory (H.pylori).

Диагностике H. pylori-инфекции придается важное значение в клинической медицине и эпидемиологии в связи с установлением того факта, что инфицированность этим возбудителем играет ведущую роль в этипатогенезе массовых заболеваний людей - хронических гастритов, дуоденитов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественной лимфомы желудка [1-3]. Первые достоверные сообщения об обнаружении этого патогена были сделаны в 1983 г. Его первоначальное наименование - Campylobacter ру1оridis. Современное наименование микроорганизм получил в 1989 году, когда выяснилось, что генетически он не относится к роду Campylobacter [2]. В связи с тем, что общепринятой стала стратегия противоинфекционной терапии указанных заболеваний [4] , особенно важна достоверная диагностика H.pylori-инфекции - для современного и правильного назначения курса лечения.

Известны способы серодиагностики H. pylori-инфекции с помощью иммуноферментного анализа [5-6] , основанные на детекции антител к антигенам H. pylori в сыворотке крови обследуемых лиц.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому способу серологической диагностики является способ, описанный в работе [5]. Он включает: приготовление антигена (кислотного антигенного экстракта) H.pylori, сорбцию антигена на носителе - лунках планшета для иммунологических реакций, контактирование сорбированного антигена с разведенной исследуемой сывороткой крови и детекцию антител с помощью меченых пероксидазой антител к иммуноглобулину G человека в присутствии хромогенной субстратной смеси. Конечный продукт реакции фотометрируют и оптическую плотность исследуемого образца сопоставляют с оптической плотностью продукта реакции в отрицательном контроле, а именно - в реакции с заведомо серонегативной сывороткой (не содержащей антител к H.pylori).

Прототипу присущи следующие недостатки: имеется значительное расхождение между данными инфицированности и данными серопозитивности больных. По новейшим данным способ имеет специфичность не выше 67% [7]. По нашим собственным данным при выполнении известного способа наблюдаются высокие значения отрицательного контроля и на этом фоне маскируется часть серопозитивных результатов (до 15%), особенно на начальных стадиях заболевания.

Изобретение направлено на усовершенствование способа серодиагностики H. pylori методом иммуноферментного анализа, при этом повышена чувствительность и информативность диагностики.

Сущность изобретения сводится к следующему.

Способ серодиагностики предусматривает приготовление суммарного антигена H.pylori, его сорбцию на твердой фазе и определение антител к нему в образце сыворотки крови обследуемых лиц методом иммуноферментного анализа. Для повышения достоверности диагностики H.pylori-инфекции суммарный антиген перед сорбцией на твердой фазе абсорбируют иммобилизованным комплексом "белок G стрептококка - иммуноглобулин человека", а детекцию антител осуществляют с помощью конъюгата "белок G стрептококка - пероксидаза хрена".

Рекомбинантный IgG-связывающий G-белок стрептококка группы G, его свойства и способ получения раскрыты в патенте РФ 2056859 с приоритетом - 14.12.93. Он представляет собой селективный реагент, который по неиммунному механизму высокоспецифично реагирует с IgG-человека и IgG большинства видов млекопитающих.

Результат улучшается: а) при использовании в качестве иммуноферментного конъюгата соединения рекомбинантного белка G стрептококка с молекулярной массой 42 килодальтона и пероксидазы хрена; б) при соотношении компонентов белок G: пероксидаза хрена 1:2-1:3, что было обосновано в специальных сериях авторских экспериментов.

Сущность и преимущества предлагаемого способа демонстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Получение суммарного антигена H.pylori.

Готовят питательную среду для культивирования H.pylori: к расплавленному колумбийскому агару (Colambia Agar Base) стерильно добавляют лошадиную нормальную сыворотку до конечной ее концентрации 7% и раствор Iso Vitalex (Becton Dickinson Microbiology Systens) до конечной концентрации 1%. Агар разливают в чашку Петри и дают ему застыть.

Посев культуры H. pylori на поверхность агара производят бактериальной петлей и распределяют нанесенный материал по поверхности агара стерильным стеклянным шпаделем. Чашку с посевом помещают в анаэростат системы GasPak 100 с газогенерирующим пакетом типа GasPak и выдерживают в термостате при температуре 37+0,5^oС 6 суток. Выросшие колонии H.pylori проверяют микроскопическим методом на чистоту культуры, снимают биомассу культуры стерильным стеклянным шпаделем и эмульгируют в 10 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,2+0,1 (забуферный физиологический раствор - ЗФР). Биомассу осаждают центрифугированием (15 минут при +4^oС и 6 тыс.об/мин). Надосадочную жидкость удаляют, а осадок биомассы ресуспендируют в 5 мл 0,1 М глицинового буферного раствора с рН 2,5, выдерживают при постоянном перемешивании на роторной мешалке при скорости вращения 5-10 об/мин при температуре 20+5^oС 10 минут. После этого биомассу культуры осаждают центрифугированием, как описано выше, и отсасывают надосадочный слой, содержащий растворимый суммарный антиген H.pylori. Осадок культуры удаляют. Надосадочный слой нейтрализуют 1 М раствором NaOH до рН 7,2+0,1, при этом получают 5 мл раствора суммарного антигена H.pylori.

Получение иммобилизованного комплекса белок G стрептококка - иммуноглобулин человека.

5 мг белка G стрептококка рекомбинантного (ВФС 42-34-80-99) растворяют в 1 мл ЗФР, полученный раствор смешивают с 1 мл иммуноглобулина человека нормального предварительно разведенного в 10 раз ЗФР. Смеси инкубируют при 37+0,5^oС 1 час и наносят на колонку G 200 диаметром 16 мм с высотой слоя геля 320 мм, уравновешенную ЗФР. Гельфильтрацию проводят при температуре 20+5^oС со скоростью 5 мл/час на см² поперечного сечения колонки. В свободном объеме колонки под контролем ультрафиолетового абсорбциометра при длине волны 280 нм, собирают фракцию первого белкового пика, содержащую комплекс белок G стрептококка - иммуноглобулин в объеме 2 мл вытекающего раствора. Полученный комплекс белок G стрептококка - иммуноглобулин контактируют с 1 см³ геля свежепромытой CNBr-агарозы 2B (Farmacia, Швеция) при постоянном перемешивании на роторной мешалке при температуре 20+5^oС в течение 4 часов. В результате получают 1 см³ геля агарозы 2 В с иммобилизованным комплексом белок G стрептококка - иммуноглобулин. Гель промывают на фильтре Шотта 100 мл глицинового буферного раствора 0,1 М, рН 7,2+0,2 и упаковывают в хроматографическую колонку диаметром 6 мл. Колонку уравновешивают ЗФР.

Абсорбция суммарного антигена H. pylori на иммобилизованном комплексе белок G - иммуноглобулин человека.

Раствор суммарного антигена H.pylori в объеме 5 мл пропускают через колонку с иммобилизованным комплексом белок G - иммуноглобулин со скоростью 2 мл/час см² поперечного сечения колонки при температуре 20+5^oС. Вытекающий раствор контролируют на содержание белка с помощью ультрафиолетового абсорбциометра при длине волны 280 нм. Белоксодержащую фракцию вытекающего раствора в объеме 5,5 мл собирают и используют как абсорбированный антиген H. pylori.

Сорбция абсорбированного антигена в лунках полистирольного планшета.

Раствор абсорбированного антигена разводят глициновым буферным раствором 0,01 м, рН 8,2 в 10 раз и вносят по 100 мл в лунки полистирольного планшета для иммунологических реакций. Планшеты выдерживают 18 часов при +4^oС, затем содержимое лунок удаляют и лунки 4-кратно промывают ЗФР, содержащим твин в концентрации 0,025% (ЗФР).

Выполнение иммуноферментного анализа.

Исследуемые сыворотки крови: (к+) - содержащую антитела к H.pylori и (к-)- не содержащую антитела к H.pylori разводят в 200 раз раствором ЗФР и вносят по 100 мкл в лунки планшета с сорбированным антигеном. Планшет выдерживают 1 час при 37^oС, затем содержимое лунок удаляют и лунки промывают 4-кратно, как описано выше. После промывки в лунки вносят по 100 мкл конъюгата белок G - пероксидаза в рабочем разведении (100 мг пероксидазы в 1 мл рабочего раствора на ЗФР). Планшеты выдерживают при 37^oС 40 минут, после чего содержимое лунок удаляют и лунки промывают 4-кратно, как описано выше. В лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (в 10 мл 0,1 М цитратно-фосфатного буферного раствора растворяют 6 мг ортофенилендиамина и добавляют 10 мкл 33% H₂О₂), и планшет выдерживают 30 минут в темноте, после чего в лунки добавляют по 0,1 мл 2 н. серной кислоты и продукт реакции фотометрируют при длине волны 492 нм.

Параллельно выполняют ИФА по способу аналогов и прототипа: в лунках планшета для иммунологических реакций сорбируют, как описано выше, неабсорбированный суммарный антиген H.pylori, разведенный 0,01 Н глициновым буферным раствором в 10 раз. Исследуемые сыворотки разводят и инкубируют в лунках планшета, как описано выше, и детекцию антител осуществляют: а) конъюгатом очищенных антител к иммуноглобулину G человека и пероксидазы хрена (производства фирмы Sigma, кат. А-6029 б) конъюгатом белок А золотистого стафилококка - пероксидаза хрена (производства НИИЭМ им.Пастера, ФС 42-3428-97).

Оба указанных конъюгата используют в ИФА в концентрации 100 нг/мл по пероксидазе.

Получают следующие результаты ИФА с использованием 3-х вариантов метода (таблица 1).

Предлагаемый способ имеет преимущества, так как демонстрирует наименьшее значение ОД 492 при исследовании контрольной отрицательной сыворотки, и отношение показателей ОД 492 контрольной положительной сыворотки и контрольной отрицательной сыворотки имеет наибольшую величину, достоверно выше, чем при использовании известных способов.

Пример 2.

Получение суммарного антигена H.pylori, его абсорбцию комплексом белок G - иммуноглобулин и абсорбцию антигена в лунках полистирольного планшета выполняют, как указано в примере 1.

Выполнение иммуноферментного анализа: Исследуют сыворотки крови 10 больных язвенной болезнью желудка, заведомо инфицированных H.pylori по данным "золотого стандарта" - бактериологического метода с выделением культуры H. pylori из биоптата слизистой желудка. Параллельно исследуют 10 сывороток крови заведомо неинфицированных лиц по данным того же "золотого стандарта", контрольные сыворотки к+ и к-, а также все перечисленные сыворотки известными способами.

Положительным результатом (достоверное обнаружение антител к антигенам H. pylori) считают результат ИФА, который более чем на 75% превышает результат реакции с контрольной отрицательной сывороткой (к-).

Данные представляют в таблице 2, из них следует, что предлагаемый способ серодиагностики имеет преимущества перед аналогом, так как дает полное соответствие с "золотым стандартом" при установлении факта инфицированности пациентов, тогда как известный способ серодиагностики имеет несоответствие с бактериологическим методом в 2-х случаях и неопределенный результат еще в одном случае.

Пример 3 выполняют, как указано в примере 2, за исключением того, что исследуют сыворотки крови 50 детей в возрасте 7-14 лет, больных гастритами и гастродуоденитами. Исследование проводят при первом обращении за медицинской помощью и через три недели после начала обследования и наблюдения. Предлагаемым способом диагностики выявляют при первом обращении 26 серопозитивных лиц, известным способом ИФА-19 серопозитивных лиц. Через 3 недели предлагаемым способом выявляют 27 серопозитивных лиц, известным способом - 24 серопозитивных пациентов.

Предлагаемый способ имеет преимущества, так как в более ранние сроки выявляют инфицированных пациентов, что позволяет назначить в более ранние сроки этиотропную терапию.

Источники информации
1. Warren J., Marshall В., Lancet, 1983, 1, 1273-1275.

2. Marshall В. е.а. Gastroenterology, 1990, 99, 697-702.

3. Helicobacter pylori. Basic Mechanism to Clinical Cure. Edited Hunt R. H., Tytgat G.N. J., KLUWER Acad. Publishers, Dordrecht/Boston/London, 1994.

4. Tytgat J.R. and Noach L.A. In: Helicobacter pylori, Basic Mechanism to Clinical Cure, KLUWER Acad. Publishers, Dordrecht/Boston/London, 1994, p. 550-569.

5. Goodwin C.S. e.a. J. Infect. Dis., 1987, 3, 155:488-494.

6. KosunenT.U. e.a. Scand J. Gastroenterol, 1989, 24, 110-114.

7. Cam McNulty e.a. Communicable Disease and Public Health, 1999, v.2, 1, p.59-63.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori. Сущностью способа является приготовление суммарного антигена Helicobacter pylori, сорбция на твердой фазе и определение к нему антител в образце сыворотки крови иммуноферментным анализом. Для повышения достоверности диагностики суммарный антиген перед сорбцией на твердой фазе абсорбируют иммобилизованным комплексом "белок G стрептококка - иммуноглобулин человека", а детекцию антител осуществляют с помощью конъюгата "белок G стрептококка - пероксидаза хрена". Техническим результатом является усовершенствование способа серодиагностики Helicobacter pylori методом иммуноферментного анализа, повышение его чувствительности и информативности. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ серодиагностики Helicobacter pylori-инфекции, включающий приготовление суммарного антигена Helicobacter pylori, его сорбцию на твердой фазе и определение антител к нему в образцах сыворотки крови обследуемых лиц с помощью иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что суммарный антиген перед сорбцией на твердой фазе абсорбируют иммобилизованным комплексом "белок G стрептококка-иммуноглобулин человека", а детекцию антител осуществляют с помощью конъюгата "белок G стрептококка-пероксидаза хрена". 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве конъюгата используют полученное периодатным способом соединение рекомбинантного белка G стрептококка с молекулярной массой 42 килодальтона и пероксидазы хрена. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что детекцию антител проводят конъюгатом при молярном соотношении компонентов белок G : пероксидаза хрена 1: 2 - 1: 3.